杜漢承,林文東,丁小明

(1.泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校解剖教研室，福建 泉州 362011；2.泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部動物實驗室，福建 泉州 362011)

精索靜脈曲張(varicocele，Vc)表現(xiàn)為精索絨毛狀叢的異常增大，是男性不育癥的主要原因[1]。目前關(guān)于精索靜脈曲張的機制尚不清楚，最新研究表明，支持細胞和生殖細胞之間的聯(lián)系降低會導(dǎo)致生殖細胞凋亡，而波形蛋白為支持細胞提供保護和營養(yǎng)，因此在精索靜脈曲張患者中波形蛋白表達降低會使細胞營養(yǎng)供給下降，進而引起生殖細胞凋亡[2]。細胞色素c(cytochrome c，Cyt-c)是氧化過程中的關(guān)鍵蛋白，Cyt-c的降低會引起線粒體功能異常，并誘導(dǎo)生精細胞過度凋亡[3]。茶多酚(tea polyphenol，TP)是一種強效抗氧化劑，可以防止許多細胞系和動物模型中的氧化應(yīng)激及DNA損傷[4]。有研究顯示，茶多酚可以緩解氧化應(yīng)激引起的生殖細胞損傷[5]。但是茶多酚對精索靜脈曲張的影響以及作用機制仍不清楚。本研究主要分析茶多酚對精索靜脈曲張模型大鼠生精細胞凋亡及波形蛋白、Cyt-c蛋白表達的影響，并分析其作用機制，為臨床治療精索靜脈曲張?zhí)峁┬碌膮⒖挤桨浮?/p>

1 材料與方法

1.1 主要材料

清潔級SD大鼠(合格證號：2015000553055)，雄性，6周齡，由上海斯萊克實驗動物中心提供，無菌飼養(yǎng)于泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校的SPF級屏障系統(tǒng)動物實驗室內(nèi)[許可證號：SYXK(閩)2016-0001]，保持溫度23～25 ℃、相對濕度25%左右。

茶多酚(Selleck公司，中國)，TUNEL染色試劑盒(碧云天公司，中國)，顯微鏡(Olympus公司，日本)，氧化應(yīng)激試劑盒(三工生物技術(shù)有限公司，中國)，組織勻漿機(Thermo Fisher Scientific公司，美國)，TRIzol(Sigma公司，美國)，Prime Script-RT和SYBR Premix Ex Taq試劑盒(Takara公司，日本)，RIPA裂解緩沖液(Beyotime公司，中國)，BCA試劑盒(武漢博斯特生物技術(shù)有限公司，中國)，抗體(Abcam公司，美國)，PVDF膜(Bio-Rad公司，美國)。

1.2 動物分組、建模和干預(yù)

將36只SD大鼠隨機分為對照組、Vc組和Vc+TP組，每組12只。Vc組和Vc+TP組通過左腎靜脈結(jié)扎構(gòu)建精索靜脈曲張模型[6]，具體方法如下：大鼠腹腔注射5%水合氯醛進行麻醉，切開腹直肌暴露左側(cè)腎，部分結(jié)扎左側(cè)腎靜脈，使腎靜脈內(nèi)徑狹窄。對照組僅切開腹腔暴露左側(cè)腎靜脈但不結(jié)扎。Vc+TP組采用茶多酚灌胃，劑量為40 mg/kg[7]，每日1次，持續(xù)4周；對照組和Vc組以等量生理鹽水灌胃，持續(xù)4周。

1.3 HE染色觀察睪丸組織損傷

干預(yù)后，所有大鼠腹腔注射2%戊巴比妥，斷頭處死后取出睪丸組織；用4%多聚甲醛固定，再用梯度乙醇脫水；經(jīng)石蠟包埋，制成厚度為4 μm的切片并制作玻片標(biāo)本；加入蘇木精室溫孵育10 min，然后加入0.5%曙紅溶液室溫孵育3 min，顯微鏡下觀察。

1.4 TUNEL染色檢測細胞凋亡

取按照1.3方法制作的睪丸組織玻片標(biāo)本，根據(jù)TUNEL試劑盒說明書加入TUNEL反應(yīng)液試劑與底物二氨基聯(lián)苯胺進行反應(yīng)染色，然后在顯微鏡的高倍鏡下隨機觀察5個視野，計算凋亡指數(shù)，凋亡指數(shù)=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

將睪丸組織制作成組織勻漿，以3 000 r/min的速度離心25 min，根據(jù)氧化應(yīng)激試劑盒檢測丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平。

1.6 RT-qPCR檢測mRNA表達

使用TRIzol提取睪丸組織中總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒逆轉(zhuǎn)錄1 μg RNA用于合成cDNA(42 ℃下60 min，70 ℃下5 min，4 ℃保存)。使用SYBR Green PCR Master Mix和PCR檢測系統(tǒng)進行RT-qPCR實驗(95 ℃下10 s，50 ℃下30 s，72 ℃下30 s，40個循環(huán)，4 ℃保存)。將GAPDH作為內(nèi)參，通過比較循環(huán)閾值大小分析mRNA的表達水平。

1.7 Western blot檢測蛋白表達

將所有的睪丸組織用勻漿機均勻研磨后萃取總蛋白，通過BCA試劑盒測量濃度。各組分別取40 μg總蛋白，用10%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳(80～120 V，90 min)，在100 mV恒定電壓下與PVDF膜進行濕轉(zhuǎn)移，在5%牛血清白蛋白中室溫孵育1 h。將1∶500稀釋的anti-CaSR、anti-PI3K和anti-AKT添加到分離的蛋白中，4 ℃孵育過夜。洗滌后在室溫下添加二抗孵育1 h，然后加入化學(xué)發(fā)光試劑進行顯影。利用GAPDH作內(nèi)參，用Image J軟件分析目標(biāo)條帶的灰度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 茶多酚對精索靜脈曲張大鼠睪丸組織的影響

睪丸組織切片HE染色結(jié)果顯示，對照組生精小管內(nèi)的生精細胞排列有序，管腔中有精子；Vc組出現(xiàn)廣泛的上皮損傷，液腔，生精細胞無序分布，睪丸生精功能明顯受損；Vc+TP組損傷情況明顯輕于Vc組，生精細胞排列基本有序，管腔中有少量精子(圖1)。

2.2 茶多酚對精索靜脈曲張大鼠生精細胞凋亡的影響

3組間凋亡指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。對照組有少量的TUNEL陽性生精細胞，凋亡指數(shù)為(5.21±0.86)%；Vc組可廣泛觀察到TUNEL陽性生精細胞，凋亡指數(shù)為(21.09±1.82)%，顯著高于對照組(P<0.05)；Vc+TP組TUNEL陽性生精細胞較Vc組少，凋亡指數(shù)為(12.36±1.05)%，顯著低于Vc組(P<0.05)，見圖1。

黑色箭頭：損傷上皮；紅色箭頭：陽性生精細胞，表示細胞凋亡

2.3 茶多酚對精索靜脈曲張大鼠氧化應(yīng)激水平的影響

3組間MDA和SOD水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Vc組MDA水平顯著高于對照組(P<0.05)，SOD水平顯著低于對照組(P<0.05)；Vc+TP組MDA水平顯著低于Vc組(P<0.05)，SOD水平顯著高于Vc組(P<0.05),見表1。

表1 茶多酚對精索靜脈曲張大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

2.4 茶多酚對精索靜脈曲張大鼠波形蛋白、Cyt-c mRNA的影響

3組間波形蛋白、Cyt-c mRNA水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Vc組波形蛋白mRNA顯著低于對照組及Vc+TP組(P<0.05)，而Cyt-c mRNA顯著高于對照組及Vc+TP組(P<0.05)，見表2。

表2 茶多酚對精索靜脈曲張大鼠波形蛋白、Cyt-c mRNA的影響

2.5 茶多酚對精索靜脈曲張大鼠波形蛋白、Cyt-c蛋白表達的影響

3組間波形蛋白、Cyt-c蛋白表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Vc組波形蛋白表達水平顯著低于對照組及Vc+TP組(P<0.05)，而Cyt-c蛋白表達水平顯著高于對照組及Vc+TP組(P<0.05)，見圖2、表3。

圖2 大鼠睪丸組織Western blot檢測結(jié)果

表3 茶多酚對精索靜脈曲張大鼠波形蛋白、Cyt-c蛋白的影響

3 討論

健康男性人群中精索靜脈曲張的發(fā)生率為15%～20%，且35%～50%的原發(fā)性不育男性和80%的繼發(fā)性不育男性皆患有精索靜脈曲張[8]。靜脈曲張切除術(shù)是治療精索靜脈曲張引起的男性不育的最常用技術(shù)，然而其手術(shù)效果有限。有研究顯示，經(jīng)靜脈切除術(shù)治療的精索靜脈曲張患者精液相關(guān)指標(biāo)僅改善了50%～80%，表明精索靜脈曲張切除術(shù)不能完全恢復(fù)患者生育能力[9]。

精索靜脈曲張主要是由精索靜脈瓣功能異常、靜脈血管損傷等引起的靜脈回流損傷，其通過引起組織灌注異常，導(dǎo)致含氧量降低和氧化應(yīng)激反應(yīng)，進而引起支持細胞和生精細胞損傷，其中氧化應(yīng)激反應(yīng)是導(dǎo)致精索靜脈曲張和生精細胞損傷的關(guān)鍵機制。研究顯示，茶多酚作為一種有效的抗氧化劑，可以緩解心肌缺血引起的心功能受損[10]；在腦缺血大鼠中，氧化應(yīng)激是引起炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡的主要原因，而茶多酚可以通過減少氧化應(yīng)激損傷保護血腦屏障功能，從而緩解神經(jīng)元凋亡[11]。也有研究顯示，茶多酚對生殖細胞損傷的修復(fù)有一定作用，其可以減少由鋁引起的睪丸中支持細胞的損傷和凋亡，從而保護睪丸的功能[12]，還可以通過緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)提高精液中精子濃度，改善精子活力和形態(tài)，從而提高精子質(zhì)量[13]。但是茶多酚對精索靜脈曲張的影響尚不明確，本研究通過部分結(jié)扎左側(cè)腎靜脈構(gòu)建大鼠精索靜脈曲張模型，并經(jīng)茶多酚灌胃治療，結(jié)果顯示茶多酚可以明顯緩解氧化應(yīng)激損傷，抑制生精細胞和支持細胞的凋亡，從而緩解精索靜脈曲張。

為進一步分析茶多酚治療精索靜脈曲張的機制，本研究檢測了波形蛋白mRNA和蛋白、Cyt-c mRNA和蛋白的表達水平。Cyt-c主要存在于線粒體中，而線粒體是有氧呼吸的主要場所，灌注不足、氧氣含量降低和活性氧自由基升高會直接引起線粒體功能受損、線粒體外膜通透性改變，進而引起Cyt-c的外流[14]。線粒體損傷不但會加劇氧化應(yīng)激反應(yīng)，也會直接導(dǎo)致線粒體途徑的凋亡，從而誘導(dǎo)生精細胞和支持細胞凋亡[15]。有研究顯示，減輕線粒體損傷可以緩解精索靜脈曲張引起的生精細胞凋亡[16]。波形蛋白是重要的支持蛋白，在維持睪丸中支持細胞的功能和形態(tài)上發(fā)揮關(guān)鍵作用，并且波形蛋白也具有連接支持細胞和生精細胞的作用[17]。氧化應(yīng)激反應(yīng)會降低波形蛋白的表達[18]，而波形蛋白表達的降低會減少支持細胞和生精細胞的連接，抑制支持細胞的增殖，從而誘導(dǎo)生精細胞凋亡[19]。本研究結(jié)果顯示，精索靜脈曲張大鼠睪丸中Cyt-c水平升高而波形蛋白水平明顯降低，茶多酚干預(yù)后Cyt-c水平降低而波形蛋白水平升高，提示茶多酚可能通過提高波形蛋白的表達恢復(fù)細胞正常形態(tài)和功能，并減少細胞的凋亡。還有研究顯示，茶多酚可以保護線粒體功能，抑制Cyt-c水平，從而減輕胰腺的氧化應(yīng)激損傷[20]。張玉森等[21]的研究顯示，茶多酚可以通過保護線粒體功能緩解阿爾茨海默癥大鼠的神經(jīng)損傷。這提示茶多酚可以通過抑制活性氧調(diào)控氧化應(yīng)激水平，從而保護線粒體功能、抑制Cyt-c的外流及細胞凋亡；此外，茶多酚也可以促進波形蛋白的表達，從而增加支持細胞與生精細胞之間的連接，保護生精細胞的功能，促進精子生成，緩解精索靜脈曲張。

綜上所述，茶多酚可通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護線粒體功能并促進波形蛋白表達，從而抑制生精細胞的凋亡和睪丸損傷，發(fā)揮緩解精索靜脈曲張的作用。但是關(guān)于茶多酚對精索靜脈曲張的療效仍需臨床試驗驗證，其調(diào)控的分子機制值得進一步深入研究。