徐炳欣，許宏磊，王申偉，沈志偉，趙 艷，王 瓊

(1.河南科技大學(xué)附屬許昌市中心醫(yī)院 a.藥學(xué)部，b.腎內(nèi)科，河南 許昌 461000；2.河南省許昌市分子醫(yī)學(xué)重點實驗室，河南 許昌 461000)

他克莫司是臨床治療膜性腎病(membranous nephropathy，MN)最常用的藥物，但該藥治療窗窄且個體間藥動學(xué)差異大[1]。當(dāng)其濃度過低達(dá)不到治療作用，濃度過高則又會引起藥物相關(guān)的毒性反應(yīng)，因此臨床在應(yīng)用他克莫司時常需要血藥濃度監(jiān)測來調(diào)整給藥劑量[2]。血藥濃度監(jiān)測在他克莫司的個體化給藥中占據(jù)重要位置，現(xiàn)階段已是膜性腎病患者在疾病治療中必需的檢測手段。然而，血藥濃度監(jiān)測具有滯后性，且由于個體差異，患者往往需要重復(fù)多次采血監(jiān)測和劑量調(diào)整才能達(dá)到目標(biāo)濃度。因此，如何在患者用藥前針對個體差異進(jìn)行給藥方案制定，是當(dāng)前MN治療中亟待解決的問題?，F(xiàn)有研究[3，4]顯示，他克莫司藥物相關(guān)的基因組學(xué)信息可能對劑量調(diào)整提供指導(dǎo)，研究主要圍繞CYP3 A5*3和多藥耐藥性蛋白(ATP-binding cassette subfamily B member 1，ABCB1)基因多態(tài)性展開。CYP3 A5*3基因多態(tài)性對他克莫司的影響，目前研究結(jié)論較為一致[5]；而ABCB1基因多態(tài)性對他克莫司的影響，當(dāng)前研究尚存在爭議，且多數(shù)研究均以移植術(shù)后患者作為研究對象，針對MN患者的研究目前尚且少見[6]。鑒此，本研究以河南中部漢族MN患者為研究對象，研究ABCB1基因多態(tài)性與MN患者應(yīng)用他克莫司給藥劑量(D)、穩(wěn)態(tài)血藥濃度/給藥劑量比值(C0/D)的關(guān)系，以期為當(dāng)?shù)豈N患者的個體化治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料應(yīng)用前瞻性研究方法，將2016年2月至2019年10月在許昌市中心醫(yī)院腎內(nèi)科住院的102例MN患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查確診為MN；②治療時間大于6個月；③患者為河南中部漢族。排除標(biāo)準(zhǔn)：①不能耐受激素及免疫抑制劑治療者；②合并糖尿病者；③治療期間不能規(guī)律用藥或者臨床資料不全者。本研究經(jīng)許昌市中心醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。所有患者藥物治療方案為他克莫司聯(lián)合激素常規(guī)治療。其中他克莫司膠囊(商品名：普樂可復(fù)；生產(chǎn)廠家：Astellas Ireland Co.Ltd，注冊證號：H20150197)初始給藥方案為1粒/次，2次/天，早餐和晚餐前1個小時內(nèi)給藥，后根據(jù)血藥濃度監(jiān)測結(jié)果調(diào)整給藥劑量。患者均給予潑尼松、五酯軟膠囊、他汀類藥物及抗血小板等藥物治療。30天為一個療程，連續(xù)治療6個療程。

1.2 方法

1.2.1ABCB1基因多態(tài)性檢測方法 采用熒光染色原位雜交技術(shù)檢測受試者ABCB1基因多態(tài)性，受試者于入院后次日清晨用EDTAK2 抗凝的采血管取空腹靜脈血2 ml，取全血100 μl置于900 μl稀釋后的NH4Cl預(yù)處理液(購自北京華夏時代基因科技發(fā)展有限公司)中，渦旋震蕩10 s，靜置5 min后3000 rpm離心5 min，去除上清液留取下層白細(xì)胞備用。取耀金染試劑(購自北京華夏時代基因科技發(fā)展有限公司)30 μl加入白細(xì)胞中得到白細(xì)胞懸液。取白細(xì)胞懸液2 μl加入ABCB1基因(rs1128503、rs2032582、rs1045642)耀金分試劑(北京華夏時代基因科技發(fā)展有限公司)，置入Tl998 A 熒光檢測儀(西安天隆科技有限公司生產(chǎn))，其結(jié)果由Microseq軟件分析和自動判讀。

1.2.2他克莫司血藥濃度檢測方法 受試者按同一給藥方案規(guī)律服藥至少7天后于下一次給藥前半小時抽取空腹靜脈血，置于EDTAK2 抗凝的采血管中，采用均相酶免疫分析法測定他克莫司谷濃度。他克莫司檢測試劑[國食藥監(jiān)械(進(jìn))字2009 第2400651 號]由西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品(上海)有限公司提供。研究所收集的他克莫司谷濃度為受試者服藥6個月時的穩(wěn)態(tài)血藥濃度，并通過電子病歷系統(tǒng)收集患者的給藥劑量[D，mg/(kg·d)]，并以血藥濃度谷濃度(C0)計算C0/D[mg/(ml·d)]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。判定ABCB1(rs1128503、rs2032582、rs1045642)基因各基因型頻率分布是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律采用χ2檢驗，計量數(shù)據(jù)(D和C0/D)不符合正態(tài)分布，以M(P25，P75)表示，三組間比較采用kruskal-Wallis檢驗，兩兩比較均經(jīng)Bonferroni校正。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 受試者一般資料納入研究的102例受試者，男69例，女33例，年齡42～71歲[(56.38±12.51)歲]；合并疾病中，高血壓17例(16.67%)，高脂血癥21例(20.59%)，冠心病8例(7.84%)，有腦卒中史患者11例(10.78%)，甲狀腺疾病15例(14.71%)，受試者他克莫司C0均值為(9.62±1.55)ng/ml，均在目標(biāo)濃度5～15 ng/ml內(nèi)。

2.2 ABCB1基因類型的Hardy-Weinberg遺傳平衡102例受試者，ABCB1 (rs1128503)中野生基因型TT型30例、突變基因型CT型58例，純合突變基因型CC型14例；ABCB1 (rs2032582)中野生基因型TT型29例、突變基因型GT型55例，純合突變基因型GG型18例；ABCB1 (rs1045642)中野生基因型TT型21例、突變基因型CT型48例，純合突變基因型CC型33例。ABCB1 (rs1128503、rs2032582、rs1045642)基因各基因型的實測值與理論值差異無顯著性，符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡，說明本研究納入的樣本具有群體代表性，見表1。

表1 ABCB1基因類型的Hardy-Weinberg遺傳平衡 [n(%)]

2.3 ABCB1基因類型間他克莫司的D和C0/D比較治療6個月后，納入研究受試者他克莫司C0均在5～15 ng/ml。ABCB1 (rs1128503)基因CC型患者的D高于CT型患者和TT型患者，C0/D低于CT型患者和TT型患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；ABCB1 (rs2032582、rs1045642)各基因型之間D、C0/D差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。兩兩比較經(jīng)Bonferroni校正，TT組他克莫司D、C0/D與CC組相比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

3 討論

目前有關(guān)藥物基因組學(xué)指導(dǎo)他克莫司個體化給藥的研究，大多以心臟[7]、肝臟[8]、腎臟[9]等移植術(shù)后患者為研究對象，針對MN患者的研究文獻(xiàn)報道有限。因此，本研究以河南中部漢族MN患者為研究對象，探討影響他克莫司給藥劑量、穩(wěn)態(tài)血藥濃度/給藥劑量比值的遺傳因素，為確定維持正常濃度范圍所需的他克莫司口服劑量提供臨床研究證據(jù)。

研究發(fā)現(xiàn)ABCB1基因有50多個單核苷酸多態(tài)性(SNPs)位點[10]，本研究中主要檢測ABCB1 (rs1128503、rs2032582、rs1045642)三個SNPs位點，是因為文獻(xiàn)報道[11]這三個位點發(fā)生突變對中國人群可能有影響。ABCB1 (rs1128503、rs2032582、rs1045642)基因在不同種族間的突變頻率有較大差異，本研究中ABCB1 (rs1128503)基因突變比例為86.27%，ABCB1 (rs2032582) 基因突變比例為82.35%，ABCB1 (rs1045642) 因突變比例為37.65%，與既往報道[12，13]中的突變比例相一致。

本研究顯示ABCB1(rs1128503、rs2032582、rs1045642) 三個SNPs位點中，只有ABCB1 (rs1128503)基因多態(tài)性對D、C0/D有影響，其中CC型患者的D高于CT型患者和TT型患者，C0/D低于CT型患者和TT型患者。這提示臨床應(yīng)用他克莫司治療MN時，應(yīng)關(guān)注患者ABCB1 (rs1128503)基因多態(tài)性，在維持同樣藥物濃度的前提下，TT型患者可能需要較低的他克莫司給藥劑量。不同ABCB1 (rs1128503)基因類型之間的他克莫司D、C0/D有差異，考慮與ABCB1 (rs1128503)基因多態(tài)性影響他克莫司的體內(nèi)轉(zhuǎn)運過程有關(guān)。ABCB1 (rs1128503)基因位于7號染色體的12號外顯子上，其編碼的P-糖蛋白屬于ATP 結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白，在人體多個器官均有表達(dá)[14]。ABCB1 (rs1128503)基因發(fā)生突變會使P-糖蛋白的表達(dá)降低，進(jìn)而影響藥物從細(xì)胞內(nèi)到細(xì)胞外的轉(zhuǎn)運過程，導(dǎo)致細(xì)胞中的藥物濃度增高[15]。當(dāng)前ABCB1基因多態(tài)性與他克莫司個體化用藥之間的關(guān)系尚存在爭議。馬多玲等[16]以腎移植受試者為研究對象，研究指出ABCB1 (rs1128503)基因多態(tài)性影響他克莫司的C0/D，同樣結(jié)論在胡楠等[17]的研究中也得到驗證，本研究結(jié)論與其基本保持一致。杜雯雯等[18]以肺移植術(shù)后患者為研究對象，研究指出ABCB1(rs1128503、rs2032582、rs1045642)基因多態(tài)性均不影響他克莫司的D與C0/D。魏菁菁等[19]研究顯示，ABCB1(rs1045642)基因多態(tài)性對C0/D有顯著影響，本研究結(jié)論與其不一致。不同研究中的結(jié)論不一致，考慮與納入受試者的疾病狀態(tài)、數(shù)量、基因突變背景等因素相關(guān)。本研究納入受試者較少，后續(xù)需要擴(kuò)大樣本量來得到更為準(zhǔn)確的結(jié)論。

MN的治療是一個較為長期的過程，在用藥前明確不同基因類型患者用藥后D、C0/D之間的差異，對于實現(xiàn)他克莫司的個體化給藥并保障患者用藥安全有效有重要的意義。近年來，隨著藥物基因組學(xué)相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，更多預(yù)測藥物療效的檢測手段應(yīng)用于臨床，為MN患者的臨床治療用藥決策提供了切實可行的指導(dǎo)。本研究明確了ABCB1 (rs1128503、rs2032582、rs1045642)基因多態(tài)性對河南漢族MN患者應(yīng)用他克莫司D、C0/D的影響，臨床醫(yī)師可根據(jù)患者的ABCB1 (rs1128503)基因型初步預(yù)測患者應(yīng)用他克莫司的D、C0/D，據(jù)此做好醫(yī)患溝通并制定個體化的用藥方案，以確保疾病治療的安全有效。

綜上，ABCB1 (rs1128503)基因多態(tài)性與D、C0/D有關(guān)，檢測ABCB1 (rs1128503)基因多態(tài)性可能對MN患者個體化使用他克莫司具有指導(dǎo)價值。但本研究是單中心研究，且研究納入樣本量較小，ABCB1 (rs1128503)基因CC型患者與CT型患者在樣本量有較大差異，這些因素均會導(dǎo)致研究結(jié)論有所偏倚，因此本研究結(jié)論有待多中心、大樣本量的研究予以證實。