王曼，楊琛，覃曉玉，康孟杰，郝桂芳，王承明

(華中農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術學院，湖北 武漢，430070)

鲊肉粉是指將粉碎的秈米、豬肉、辣椒、鹽和香辛料混勻，在微生物作用下，發(fā)酵而成的傳統(tǒng)米肉復合制品，在我國鄂、湘、川、黔、渝等地區(qū)頗受歡迎，距今已有數(shù)千年的食用歷史[1-2]。目前，鲊肉粉制作以農(nóng)家傳統(tǒng)制作方式為主，利用附著在原料表面的微生物進行發(fā)酵，無法保證產(chǎn)品穩(wěn)定性和安全性。因此，篩選優(yōu)良菌株對于鲊肉粉工業(yè)化生產(chǎn)、縮短發(fā)酵生產(chǎn)周期具有重要意義。

肉制品發(fā)酵菌種主要是乳酸菌和凝固酶陰性葡萄球菌[3]，這2類微生物與發(fā)酵肉制品的顏色、質地、風味有很大關系[4]。乳酸菌可通過降低產(chǎn)品的pH值而延長食品的貨架期、抑制病原菌和腐敗菌生長[5]、縮短發(fā)酵周期，同時還可利用碳水化合物產(chǎn)生有機酸，賦予發(fā)酵產(chǎn)品獨特的酸味和口感[6]。葡萄球菌可以降解蛋白質和脂肪，形成特有的香氣和風味[7-9]，還具有抑制脂肪和蛋白質氧化，延緩發(fā)酵制品酸敗的作用。國內外對于葡萄球菌的研究已有諸多報道，在西式發(fā)酵香腸中木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)和肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)等是最具優(yōu)勢的種類[10]，而在中式發(fā)酵香腸中表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)和模仿葡萄球菌(Staphylococcussimulans)等更具有優(yōu)勢[11]。此外，巴氏葡萄球菌(Staphylococcuspasteuri)和沃氏葡萄球菌(Staphylococcuswarneri)也是發(fā)酵肉制品中常見的種屬。為了彌補單一菌株發(fā)酵的不足，通常將乳酸菌和凝固酶陰性葡萄球菌進行復配，可以使產(chǎn)品風味更豐富。

本研究從自然發(fā)酵鲊肉粉中篩選發(fā)酵性能優(yōu)良的乳酸菌和葡萄球菌，研究葡萄球菌的安全性和耐藥性、乳酸菌產(chǎn)酸能力和抑菌能力以及所有菌株的耐鹽性、耐亞硝酸鹽性等生物學特性，并通過形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析鑒定菌株，為鲊肉粉接種發(fā)酵提供優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 實驗原料

鲊肉粉，實驗室自制；微量鑒定管，杭州濱河試劑公司；青霉素、復方新諾明、氯霉素、林可霉素、氨卡西林、卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、紅霉素、環(huán)丙沙星，比克曼生物科技有限公司；革蘭氏染色試劑、16 g/L中性紅水溶液、1 g/L甲苯胺藍、NaCl、NaNO2等，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

蛋白酶檢測培養(yǎng)基、脂肪酶檢測培養(yǎng)基、硝酸鹽還原培養(yǎng)基、氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基[12]；MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、MSA瓊脂培養(yǎng)基、NB肉湯培養(yǎng)基、DNA酶瓊脂、乙酰胺肉湯、脫纖維羊血、兔血漿，青島海博生物技術有限公司。

1.1.3 儀器設備

分析天平(BS 224 S)，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；酸度計(FE 20)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；生化培養(yǎng)箱(SPX-150BⅢ)，中國泰斯特儀器有限公司；可見分光光度計(722型)，上海菁華科技儀器有限公司；單人凈化工作臺(SW-CJ-1D)，蘇州凈化設備有限公司；全自動滅菌器(Zealway GR-60DA)，武漢遞熱愛生物科技有限公司；熒光顯微鏡(Leica DM 3 000)，德國Leica 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株初篩

首先對葡萄球菌進行安全性篩選。

溶血實驗：將葡萄球菌培養(yǎng)物接種于血平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，篩選無溶血圈的菌株。

凝固酶實驗：將葡萄球菌培養(yǎng)物接種到兔血漿中，37 ℃培養(yǎng)24 h，篩選無凝固酶的菌株。

DNA酶實驗：將葡萄球菌培養(yǎng)物接種于平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，在培養(yǎng)基表面滴加1 mol/L鹽酸，篩選無透明環(huán)的菌株。

藥敏性實驗：將菌液涂布于固體培養(yǎng)基上，將藥敏紙片放在培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，篩選無耐藥性的菌株[13]。

將篩選出的葡萄球菌和乳酸菌進行如下實驗：

產(chǎn)黏實驗：挑取單菌落進行觀察，篩選不產(chǎn)黏的菌株。

發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣實驗：滴加細菌培養(yǎng)物于葡萄糖產(chǎn)氣生化管中，37 ℃培養(yǎng)24 h，變黃者為陽性，無變化者為陰性，篩選產(chǎn)酸不產(chǎn)氣的菌株。

產(chǎn)氨實驗：將質控菌液加入乙酰胺肉湯中，37 ℃培養(yǎng)24 h，滴加鈉氏試劑3～5滴。呈磚紅色為陽性，呈黃色為陰性，篩選不產(chǎn)氨的菌株。

產(chǎn)H2S實驗：滴加細菌培養(yǎng)物于硫化氫生化管中，37 ℃培養(yǎng)24 h，變黑者為陽性，無變化者為陰性，篩選不產(chǎn)H2S的菌株。

過氧化氫酶實驗：滴加3%(體積分數(shù))的H2O2溶液于細菌培養(yǎng)物的試管中，產(chǎn)氣泡為陽性，反之為陰性。

氨基酸脫羧酶實驗：37 ℃培養(yǎng)接種物24 h，呈紫色者為氨基酸脫羧酶試陽性，呈黃色為陰性，同時做氨基酸脫羧酶對照試驗，篩選無氨基酸脫羧酶的菌株。

1.2.2 菌株復篩

硝酸鹽還原酶實驗[14]：將培養(yǎng)物接種到培養(yǎng)基中，陰性仍為紫色，陽性則變成磚紅色，篩選硝酸鹽還原酶陽性菌株。

蛋白酶和脂肪酶水解實驗：蛋白酶和脂肪酶活性實驗參考趙俊仁等[15]的方法進行測定。

抑菌試驗：將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌涂布在MRS培養(yǎng)基上，打孔器打孔，加入50 μL乳酸菌離心上清液，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈大小。

拮抗實驗：在平板上進行十字交叉劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌株生長情況。

1.2.3 優(yōu)良菌株的生物學特性

生長曲線和產(chǎn)酸能力：參考潘曉倩等[16]的方法測定菌株生長曲線及產(chǎn)酸能力。

葡萄球菌耐酸性測定：將菌株分別接種到pH值為4、5、6、7、8、9的NB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后測其OD600值。

菌株耐鹽性測定：將菌株分別接種到含0%、2%、4%、6%、8%、10%(質量分數(shù))NaCl的MRS、NB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后測其OD600值。

菌株耐亞硝酸鹽性測定：將菌株接種到含0、50、100、150 mg/kg NaNO2的MRS、NB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后測其OD600值。

1.2.4 優(yōu)良菌株的鑒定

形態(tài)學鑒定：觀察培養(yǎng)基平板上的菌落形態(tài)，包括形狀、大小、顏色等。

16S rDNA鑒定：采用PCR擴增方法，送至江蘇金唯智有限公司測序，將測序序列與GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫進行BLAST同源性對比分析。

1.2.5 統(tǒng)計分析

每個實驗3次平行，用Origin 8.5軟件進行數(shù)據(jù)處理，MEGA 7.0軟件構建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選結果

從鲊肉粉中共分離純化出52株葡萄球菌和62株乳酸菌。首先對葡萄球菌進行安全性檢測，其中溶血陰性、血漿凝固酶陰性、DNA酶陰性、不具耐藥性的葡萄球菌36株。按照肉制品發(fā)酵劑篩選標準，對葡萄球菌和乳酸菌做一系列篩選實驗，篩選出不產(chǎn)黏、不產(chǎn)H2S、發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣、氨基酸脫羧酶陰性、硝酸鹽還原酶陽性的菌株，最終得到2株產(chǎn)細菌素、抑菌效果好的乳酸菌菌株，2株具有蛋白酶和脂肪酶活力的葡萄球菌菌株，篩選得到的4株菌株的實驗結果如表1所示。

表1 篩選葡萄球菌菌體形態(tài)及生理生化實驗結果Table 1 Results of mycelia morphology and physiological biochemical test

葡萄球菌的脂肪酶和蛋白酶活性有助于發(fā)酵肉制品特殊風味的形成；發(fā)酵肉制品中的乳酸菌需要無脂肪酶和蛋白酶活性[17]，如果其具有蛋白質降解活性，則可能縮短產(chǎn)品的貨架期，產(chǎn)生腐敗現(xiàn)象[18]，而具有脂肪降解活性的乳酸菌會使產(chǎn)品在儲存銷售過程中出現(xiàn)酸敗味[19]。實驗發(fā)現(xiàn)，S6、S7、A1、C7之間無拮抗作用，可作為鲊肉粉發(fā)酵菌株使用，將葡萄球菌與乳酸菌復配制成復合發(fā)酵劑，來彌補單一菌種發(fā)酵的不足。

2.2 優(yōu)良菌株的生物學特性

2.2.1 菌株生長及產(chǎn)酸情況

將篩選得到的4株菌進行培養(yǎng)，分析生長情況，生長曲線如圖1-a所示，乳酸菌A1、C7和葡萄球菌S6、S7表現(xiàn)出相似的生長趨勢，0～2 h內為延滯期，從2 h后進入對數(shù)生長期，在10 h后進入生長平穩(wěn)期，這表明篩選得到的乳酸菌和葡萄球菌具備良好的生長特性?？焖佼a(chǎn)酸是衡量乳酸菌發(fā)酵劑品質的重要指標之一。產(chǎn)酸速率快可縮短發(fā)酵生產(chǎn)周期，并使乳酸菌迅速成為優(yōu)勢菌群，抑制有害菌及致病菌的生長，提高產(chǎn)品的生物安全性[20]。由圖1-b可知，2株乳酸菌產(chǎn)酸能力較強，24 h內pH值由5.7下降至3.6，主要是對數(shù)期產(chǎn)酸較多。pH值迅速降低有利于抑制腐敗微生物的生長，保證肉制品品質。從生長性能和產(chǎn)酸速度2方面考慮，可以將乳酸菌A1和C7作為鲊肉粉的發(fā)酵菌種。

a-生長曲線；b-產(chǎn)酸能力圖1 菌株的生長曲線和產(chǎn)酸能力Fig.1 Growth curve and acid-producing capacity of strains

2.2.2 葡萄球菌耐酸性測定

在發(fā)酵肉制品中，通常需要將乳酸菌與葡萄球菌進行復配，制成復合發(fā)酵劑。因此，篩選的葡萄球菌應具有一定的耐酸性能，適應低pH值[21]。葡萄球菌在不同酸性條件的生長情況如圖2所示。

圖2 不同pH值下菌株的吸光度Fig.2 Comparison of tolerance of strains to difference pH value

隨著pH值由4增加到9，2株葡萄球菌的生長能力均呈現(xiàn)先增加后下降，在pH值為6時生長能力最強，其OD600值均達到1.5以上，在pH值4～5，2株葡萄球菌能較好生長，說明其能適應偏酸性的發(fā)酵環(huán)境，具有作為鲊肉粉發(fā)酵劑的潛力。

2.2.3 菌株耐食鹽性測定

發(fā)酵肉制品中含鹽量較高，添加量一般為6%(質量分數(shù))。食鹽可以防腐、增強肉的保水力，同時也會對發(fā)酵菌株生長產(chǎn)生一定的影響，因此需要測試篩選菌株的耐鹽性。從圖3中可知，隨著NaCl質量分數(shù)的增加，菌株受到了不同程度的影響，生長力下降。乳酸菌A1和C7在NaCl質量分數(shù)為6%時生長良好，在NaCl質量分數(shù)為8%時吸光值在0.1左右，生長受到抑制。葡萄球菌S6和S7在NaCl質量分數(shù)10%時也能良好的生長，說明葡萄球菌S6和S7具有較強的耐鹽性。鲊肉粉中的NaCl質量分數(shù)為3%，因此，4株菌株都可以作為鲊肉粉的發(fā)酵菌株。

圖3 不同鹽含量下菌株的吸光度Fig.3 Comparison of tolerance of strains to difference concentration of NaCl

2.2.4 菌株耐亞硝酸鹽性測定

亞硝酸鹽可以改善發(fā)酵肉制品的色澤，一般要求用來生產(chǎn)肉品發(fā)酵劑的微生物可耐100 mg/kg NaNO2。從圖4可以看出，隨著NaNO2質量分數(shù)的升高，對乳酸菌A1和C7的生長抑制逐漸增強。在100 mg/kg時，菌株尚可良好生長，當NaNO2質量分數(shù)為150 mg/kg時，乳酸菌生長受到了嚴重的抑制。在0～50 mg/kg時，隨著質量分數(shù)的升高，對葡萄球菌S6和S7的抑制顯著增加，在50～150 mg/kg時，菌株的生長抑制變化小，這與劉夏煒[22]的研究結果一致。由此可知，4株菌株都可以作為鲊肉粉發(fā)酵菌株。

圖4 不同亞硝酸鹽添加量下菌株的吸光度Fig.4 Comparison of tolerance of strains to difference concentration of NaNO2

2.3 菌株鑒定

2.3.1 形態(tài)學特征

篩選菌株的菌落形態(tài)見表2，通過革蘭氏染色，鏡檢結果如圖5所示，乳酸菌A1、C7呈桿狀，葡萄球菌S6、S7呈串狀。

表2 四株菌的形態(tài)學特征Table 2 Morphological characteristics of four strains

圖5 菌株A1、C7、S6、S7革蘭氏染色顯微形態(tài)Fig.5 Gram staining micromorphology of strains A1,C7,S6,S7

2.3.2 菌株的16S rRNA序列測定及系統(tǒng)進化樹的構建

菌株的PCR產(chǎn)物凝膠電泳分析結果如圖6所示，擴增出約1 500 bp的DNA片段，條帶清晰，無雜帶。用MEGA 7.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹，在GenBank中進行同源性比對，結果如圖7所示。A1、C7與GenBank中植物乳桿菌的16S rDNA序列相似性達99%以上，可初步確認為植物乳桿菌。

M-Marker；Y-陰性對照；1-A1；2-C7；3-S6；4-S7圖6 提取DNA模板的PCR擴增反應圖譜Fig.6 PCR amplification response spectrum of DNA template

a-植物乳桿菌A1、C7;b-沃氏葡萄球菌S6;c-巴氏葡萄球菌S7圖7 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strains

菌株S6、S7的16S rRNA分別與GenBank中沃氏葡萄球菌、巴氏葡萄球菌的16S rDNA序列相似性達99%以上，可初步確認S6為沃氏葡萄球菌，S7為巴氏葡萄球菌。

3 結論

本研究從自然發(fā)酵鲊肉粉中篩選出4株發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株，通過16S rDNA序列分析可知，2株乳酸菌均為植物乳桿菌，2株葡萄球菌分別是沃氏葡萄球菌和巴氏葡萄球菌。植物乳桿菌A1、C7產(chǎn)酸能力強、生長速度快，葡萄球菌S6、S7耐酸且能產(chǎn)生脂肪酶和蛋白酶，4株菌對食鹽和亞硝酸鹽均具有較好的耐受性，研究結果為鲊肉粉接種發(fā)酵提供理論支撐。后期工作將篩選得到的菌株接種到鲊肉粉中，進行鲊肉粉的混菌發(fā)酵的進一步研究。