金文剛，陳小華，耿敬章,姜鵬飛，裴金金

1(陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中，723001)2(大連工業(yè)大學(xué) 國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連，116034)

漢中市地處中國陜西南部，秦嶺-巴山之間得天獨(dú)厚的生態(tài)環(huán)境使其自古成為貢茶、名優(yōu)茶的知名產(chǎn)地，茶樹種植有4000多年的歷史[1-3]。漢中市有西鄉(xiāng)縣、南鄭縣、勉縣、寧強(qiáng)縣、鎮(zhèn)巴縣、城固縣、略陽縣、洋縣等8個(gè)產(chǎn)茶縣，茶園面積超過5.33萬hm2，總產(chǎn)量接近3萬t，產(chǎn)值超過20億元[1]。為了改變漢中市茶葉品牌多、亂、雜，市場知名度不高，產(chǎn)品競爭力不強(qiáng)的局面，漢中市政府將原有的“午子仙毫”、“定軍茗眉”、“寧強(qiáng)雀舌”等20多個(gè)品牌實(shí)行了“統(tǒng)一品名，統(tǒng)一工藝、統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)”，整合為“漢中仙毫”一個(gè)綠茶品牌[2]。近年來，“漢中仙毫”先后獲得國家質(zhì)檢總局認(rèn)定的國家地理標(biāo)志產(chǎn)品，中國茶葉區(qū)域公用品牌最具發(fā)展力品牌以及中國國際茶葉博覽會綠茶類金獎(jiǎng)等榮譽(yù)，受到了國內(nèi)外消費(fèi)者的高度贊譽(yù)[2-3]。每年清明節(jié)前后，市場上“漢中仙毫”綠茶琳瑯滿目，銷售價(jià)格差異較大(600～4 000 元/kg)。如何對“漢中仙毫”產(chǎn)地質(zhì)量進(jìn)行客觀評估，對于維護(hù)消費(fèi)者的知情權(quán)、經(jīng)濟(jì)利益以及管理“漢中仙毫”品牌具有重要意義。

香氣物質(zhì)是衡量茶葉品質(zhì)的關(guān)鍵因子，對茶葉風(fēng)味、等級評定及大眾消費(fèi)導(dǎo)向等都具有重要作用[4-6]。人類已從茶葉揮發(fā)性成分中鑒定出的香氣物質(zhì)多達(dá)700余種，主要包括醇類、醛類、酮類、酸類、酯類、酚類以及雜環(huán)類化合物等，這些成分構(gòu)成了茶葉呈香的重要化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)[7-13]。目前，茶葉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分析方法已非常成熟，已報(bào)道的方法包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatograph-mass spectrometry,GC-MS)[8,12]、氣相色譜-嗅聞(gas chromatograph-olfactometry,GC-O)[12-13]、氣相-離子遷移譜(gas chromatograph-ion mobility spectrometer,GC-IMS)[7,9]等技術(shù)，結(jié)合固相微萃取、風(fēng)味提取物稀釋、重組及感官分析可實(shí)現(xiàn)對茶葉揮發(fā)性氣味成分的定性、定量分析。與主流的GC-MS技術(shù)相比，GC-IMS是近年來出現(xiàn)的較新?lián)]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分離和檢測技術(shù)，該技術(shù)整合了氣相與離子遷移譜在分離和檢測方面的優(yōu)勢，具有樣品制備簡單、靈敏度高、分辨率高、操作簡便、分析高效和風(fēng)味物質(zhì)可視化等特點(diǎn)[7,9,14]，尤其適合食品中揮發(fā)性有機(jī)化合物的痕量分析與檢測，應(yīng)用范圍和優(yōu)勢不斷被報(bào)道。

在茶葉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)方面，李俊杰等[9]采用GC-IMS結(jié)合頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，對手筑茯磚茶“發(fā)花”(發(fā)酵)和干燥過程中揮發(fā)性組分的變化進(jìn)行分析，共檢測出7類共57種有機(jī)化合物，結(jié)合主成分分析可實(shí)現(xiàn)不同加工階段茯磚茶風(fēng)味物質(zhì)的區(qū)分;江津津等[15]利用GC-IMS技術(shù)對不同成熟期新會茶枝柑皮制得的4 種柑普茶揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了定性分析，發(fā)現(xiàn)芳樟醇、α-松油醇、香蘭素、α-蒎烯等化合物是柑普茶區(qū)別于其他普洱茶的特征風(fēng)味化合物，可依據(jù)這類特征化合物的含量對新會柑普茶進(jìn)行快速分類鑒別；JIN等[16]發(fā)現(xiàn)GC-IMS技術(shù)在福建烏龍茶風(fēng)味鑒別中具有高度敏感性，可實(shí)現(xiàn)鐵觀音、大紅袍茶樣的產(chǎn)地區(qū)分。此外，有關(guān)利用GC-IMS技術(shù)對綠茶揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)定性分析、指紋圖譜建立等研究也已被不斷報(bào)道[7,17-18]。上述相關(guān)研究為GC-IMS技術(shù)在不同品牌、種類和產(chǎn)地茶葉的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)定性分析、質(zhì)量控制等方面積累了較好的研究基礎(chǔ)。

前期研究表明[11]，漢中炒青綠茶中共鑒定出66種香氣化合物，其中含量高的化合物有吲哚、2-乙?；?2-噻唑啉、茉莉酮、香葉醇、葫蘆巴內(nèi)酯等；香氣特征分析顯示，漢中炒青的香氣特征以焦糖香氣為主，其次為花香氣、豆香氣和藥香氣，關(guān)鍵香氣化合物有芳樟醇、葫蘆巴內(nèi)酯、吲哚、香草醛、α-紫羅酮和4-羥基-2,5-二甲基3(2H)呋喃酮等。此外，課題組還利用GC-MS和GC-O從漢中紅茶中分析出了73種香氣化合物，鑒定了24種關(guān)鍵香氣成分[12-13]。在不同產(chǎn)地茶葉風(fēng)味物質(zhì)方面，郭建軍等[8]采用頂空-固相微萃取和GC-MS技術(shù)分析了貴州不同產(chǎn)地綠茶的香氣組成，12種綠茶共鑒定出75種香氣化合物。然而漢中市不同產(chǎn)地的“漢中仙毫”綠茶揮發(fā)性氣味成分是否存在差異，尚未見相關(guān)報(bào)道?；诖?，本研究利用GC-IMS技術(shù)對漢中市5個(gè)主要綠茶產(chǎn)地(南鄭、鎮(zhèn)巴、西鄉(xiāng)、勉縣、寧強(qiáng))清明節(jié)前制作的“漢中仙毫”綠茶氣味成分進(jìn)行分析，旨在為今后“漢中仙毫”綠茶品質(zhì)控制、產(chǎn)地質(zhì)量區(qū)分與品牌管理提供理論和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用“漢中仙毫”綠茶樣品，分別于2020年3月下旬至4月初采自陜西省漢中市5個(gè)縣區(qū)，由制茶師經(jīng)攤放、殺青、揉捻和干燥標(biāo)準(zhǔn)工藝制作為市售一級商品綠茶，封口包裝后低溫運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室于0～4 ℃下保藏，樣品信息見表1。

表1 不同產(chǎn)地“漢中仙毫”樣品信息Table 1 Sample information of Hanzhong Xianhao from different places

1.2 GC-IMS測試方法

1.2.1 頂空進(jìn)樣條件

頂空孵化溫度90 ℃；孵化時(shí)間1 min；采用振蕩加熱方式加熱；頂空進(jìn)樣針溫度95 ℃；進(jìn)樣量500.0 μL，不分流模式；載氣：高純N2(純度≥99.99%)；清洗時(shí)間0.5 min。

1.2.2 GC條件

色譜柱溫度40 ℃；運(yùn)行時(shí)間20 min；載氣：高純 N2(純度≥99.99%)；流速：初始 5.0 mL/min，保持 10 min 后在 5 min 內(nèi)線性增至 150 mL/min。漂移管長度5 cm；管內(nèi)線性電壓400 V/cm。

1.2.3 IMS條件

柱溫60 ℃；漂移氣：N2(純度≥99.99%)；流速150 mL/min；IMS 探測器溫度45 ℃；分析時(shí)間30 min。

每個(gè)產(chǎn)地“漢中仙毫”綠茶樣品精密稱取0.5 g，加入90 ℃熱水，放入20.0 mL頂空進(jìn)樣瓶中，90 ℃孵化1 min，頂空進(jìn)樣后用 FlavourSpec?風(fēng)味分析儀直接測試，每個(gè)樣品做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，經(jīng) G.A.S 公司開發(fā)的軟件分析獲得樣品中揮發(fā)性有機(jī)物的差異譜圖；然后利用軟件自帶的NIST和IMS數(shù)據(jù)庫對氣味成分進(jìn)行定性分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用風(fēng)味儀LAV(laboratory analytical viewer)和 Reporter、Gallery Plot、Dynamic PCA三個(gè)插件分析數(shù)據(jù)結(jié)果，通過內(nèi)置GC×IMS Library Search NIST數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫對樣品氣味成分進(jìn)行定性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地“漢中仙毫”茶湯GC-IMS氣味成分譜圖分析

利用FlavourSpec?風(fēng)味分析儀，對來自漢中市南鎮(zhèn)區(qū)、勉縣、西鄉(xiāng)縣、鎮(zhèn)巴縣和寧強(qiáng)縣5個(gè)不同產(chǎn)地“漢中仙毫”沖泡后茶湯氣味成分進(jìn)行了分析。圖1是由該儀器自帶LAV分析軟件中的Reporter插件程序獲得的不同產(chǎn)地“漢中仙毫”茶湯氣味成分3D譜圖。紅色垂直線表示離子峰，離子峰兩側(cè)的每個(gè)點(diǎn)代表1種揮發(fā)性有機(jī)物，顏色的深淺表示含量的高低。1種化合物可能會產(chǎn)生1、2個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)(代表單體、二聚體或三聚體)，具體取決于氣味濃度和性質(zhì)[14]。從色彩觀察可知，5種不同產(chǎn)地“漢中仙毫”茶湯的GC-IMS三維譜圖非常相似，肉眼難以直觀進(jìn)行區(qū)分(圖1)。

將圖1的三維GC-IMS譜圖投影到二維平面俯視圖見圖2，可直接進(jìn)行不同產(chǎn)地“漢中仙毫”氣味物質(zhì)成分的差異性對比分析。

圖1 不同產(chǎn)地“漢中仙毫”茶湯GC-IMS三維譜圖Fig.1 Three dimensional GC-IMS spectra of Hanzhong Xianhao tea infusion from different places注：圖中字母NZ、MX、ZB、XX和NQ代表茶葉樣品分別來自南鄭、勉縣、鎮(zhèn)巴、西鄉(xiāng)和寧強(qiáng)(下同)

a-原始譜圖；b-差異對比譜圖圖2 不同產(chǎn)地“漢中仙毫”茶湯GC-IMS二維譜圖Fig.2 Two dimensional GC-IMS spectra of Hanzhong Xianhao tea infusion from different places

由圖2可知，5個(gè)不同產(chǎn)地“漢中仙毫”綠茶樣品揮發(fā)性氣味成分可通過GC-IMS技術(shù)實(shí)現(xiàn)很好地分離，不同產(chǎn)地“漢中仙毫”綠茶沖泡后茶湯呈現(xiàn)出不同的GC-IMS特征譜信息，且不同產(chǎn)地“漢中仙毫”茶湯中部分氣味物質(zhì)濃度出現(xiàn)升高或降低，顯示出了較明顯的差異(圖2-b中紅色框中所示)其原因可能是茶樹地理分布、海拔、生態(tài)環(huán)境、制茶工藝條件等因素造成，不同區(qū)域茶葉樣品揮發(fā)性成分含量的不同[7-8,16]。郭建軍等[8]利用GC-MS分析表明，貴州六大產(chǎn)茶區(qū)12種代表性綠茶揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)也呈現(xiàn)出一定的差異性；林若川等[17]研究發(fā)現(xiàn)，通過GC-IMS技術(shù)可對綠茶樣品進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)定性鑒別，并探討了該技術(shù)與GC-MS的優(yōu)缺點(diǎn)，指出GC-IMS技術(shù)具有樣品前處理簡單、快速的特點(diǎn)。

2.2 “漢中仙毫”GC-IMS揮發(fā)性氣味成分定性分析

通過比較特征性風(fēng)味物質(zhì)的保留時(shí)間和遷移時(shí)間，使用外標(biāo)正酮C4-C9作為參考[14-16]，計(jì)算每種揮發(fā)性物質(zhì)的保留指數(shù)，通過 GC-IMS 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配,從而對揮發(fā)性氣味物質(zhì)進(jìn)行定性分析。圖3中顯示的數(shù)字、標(biāo)記點(diǎn)代表定性分析出的一種揮發(fā)性氣味物質(zhì)。根據(jù)軟件內(nèi)置的NIST 2014氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫與G.A.S.的IMS遷移時(shí)間數(shù)據(jù)庫，可以明確定性的揮發(fā)性物質(zhì)有61種單體及部分物質(zhì)的二聚體，包括醛類30種、酮類12種、酯類7種、醇類6種、呋喃類4種和 酸類2種，其中鑒定的單體、二聚體的化學(xué)式和CAS號相同，僅形態(tài)不同，結(jié)果如表2所示，圖3中數(shù)字編號與表2中揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)相互對應(yīng)。

圖3 “漢中仙毫”茶湯揮發(fā)性氣味物質(zhì)離子遷移譜定性分析Fig.3 IMS qualitative analysis of volatile compounds of Hanzhong Xianhao tea infusion

2.3 不同產(chǎn)地“漢中仙毫”茶湯氣味指紋圖譜

為了更直觀地對比不同產(chǎn)地“漢中仙毫”茶湯中揮發(fā)性氣味物質(zhì)的差異性，選取每個(gè)產(chǎn)地茶湯樣品平行測試3次,獲得GC-IMS二維圖譜中所有待鑒定信號峰，生成不同產(chǎn)地“漢中仙毫”氣味物質(zhì)指紋圖譜，如圖4所示。每1行代表一個(gè)樣品(從上至下分別為南鄭、勉縣、鎮(zhèn)巴、西鄉(xiāng)、寧強(qiáng))，每1列代表不同樣品中相同的揮發(fā)性物質(zhì)(紅色信號越深，表示該物質(zhì)質(zhì)量濃度相對越高)，指紋圖譜上有兩個(gè)相同名字的是單體和二聚體。不同產(chǎn)地“漢中仙毫”茶湯揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)顯示出了較大差異(圖中紅色框區(qū)域)，其中“漢中仙毫”茶湯的揮發(fā)性氣味物質(zhì)以酮類、醛類、酯類物質(zhì)占主導(dǎo)。來源于南鄭產(chǎn)區(qū)的茶葉，苯甲酸甲酯、2,6-二甲基4-庚酮質(zhì)量濃度相對較高；勉縣產(chǎn)區(qū)茶葉，2,5-二甲基呋喃、2-戊基呋喃、苯乙醛、正己醇、2-乙基呋喃、2-辛烯醛、丙酮質(zhì)量濃度相對較高，而二甲基丁醛質(zhì)量濃度最低；鎮(zhèn)巴產(chǎn)區(qū)茶葉，2,3-乙酰丙酮、2-己烯醛、2,4-二烯醛、2-戊酮質(zhì)量濃度相對較高；西鄉(xiāng)產(chǎn)區(qū)茶葉，庚醛、正丁醛、甲基丙醛(單體、二聚體)、2-丁酮質(zhì)量濃度相對較高；寧強(qiáng)產(chǎn)區(qū)茶葉，丁基丙酸、戊醛、甲基異丁基酮、乙酸乙酯、戊醇、1-辛烯-3-醇、3-辛醇、2-庚醇、(E)-2-庚烯醛質(zhì)量濃度相對較高。這些關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味化合物，可能對于不同產(chǎn)地“漢中仙毫”茶湯氣味物質(zhì)具有一定影響。

表2 “漢中仙毫”茶湯中揮發(fā)性物質(zhì)定性分析Table 2 Qualitative analysis of volatile compounds of Hanzhong Xianhao tea infusion

續(xù)表2

對西湖龍井綠茶的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)定性定量進(jìn)行分析時(shí)，不同研究人員得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在較大差異，不同產(chǎn)地茶葉或者同一類型茶葉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，可能由于原料產(chǎn)地、加工方法等不同存在較大差異[19-20]。盡管本研究中通過GC-IMS只分析鑒定出“漢中仙毫”茶湯中61種風(fēng)味化合物，還有29種化合物由于數(shù)據(jù)庫信息不完善沒有能夠定性，這也是GC-IMS技術(shù)在其他食品揮發(fā)性氣味物質(zhì)分析的共同局限性[7,14,21-23]。

圖4 不同產(chǎn)地“漢中仙毫”茶湯氣味指紋譜圖Fig.4 Fingerprint of volatile organic compounds of Hanzhong Xianhao tea infusion from different places

2.4 不同產(chǎn)地“漢中仙毫”茶湯氣味物質(zhì)主成分分析

有研究通過GC-IMS圖譜數(shù)據(jù)結(jié)合主成分分析，根據(jù)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對不同產(chǎn)地水蜜桃[22]、羊肉[23]、黃酒[24]產(chǎn)地進(jìn)行區(qū)分。目前，GC-IMS技術(shù)已經(jīng)在茶葉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析中也顯示了一定的優(yōu)勢，可用于等級、產(chǎn)地和茶樹品種的鑒別、區(qū)分[7,16,18]。本研究根據(jù)“漢中仙毫”茶湯GC-IMS色譜數(shù)據(jù)，不同產(chǎn)地“漢中仙毫”揮發(fā)性氣味指紋圖譜，采用主成分分析探究其用于產(chǎn)地區(qū)分的可行性。由圖5可知，主成分1和主成分2累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到73%，同一產(chǎn)地“漢中仙毫”氣味物質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)大致聚集在一起，不同產(chǎn)地“漢中仙毫”可以較好地得到區(qū)分，且沒有明顯重疊區(qū)域，說明采用GC-IMS技術(shù)結(jié)合主成分分析，可實(shí)現(xiàn)不同產(chǎn)地“漢中仙毫”揮發(fā)性氣味成分的較好區(qū)分。

圖5 不同產(chǎn)地“漢中仙毫”茶湯氣味指紋主成分分析Fig.5 PCA score of fingerprint of volatile organic compounds in Hanzhong Xianhao tea infusion from different places

茶葉質(zhì)量分類的不確定性，直接關(guān)系著茶農(nóng)、加工銷售企業(yè)以及消費(fèi)者經(jīng)濟(jì)利益。不同產(chǎn)地、等級茶葉價(jià)格相差很大，因此亟需快速、準(zhǔn)確、便捷的方法對茶葉的產(chǎn)地質(zhì)量進(jìn)行評估[25-26]。GC-IMS作為一種新興風(fēng)味物質(zhì)分析方法，具有響應(yīng)迅速、操作簡單、快速、檢測結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。其基于氣相分離與離子遷移譜的聯(lián)用，克服了單一氣相色譜方法的不足，在離子遷移管中進(jìn)行二次分離，可大大提高儀器分辨能力和靈敏度，可應(yīng)用于大多數(shù)復(fù)雜體系中特征風(fēng)味有機(jī)揮發(fā)組分的快速檢測、識別及指紋圖譜可視化等[14,21]。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，GC-IMS技術(shù)在福建烏龍茶風(fēng)味鑒別中具有高度敏感性，可實(shí)現(xiàn)鐵觀音、大紅袍茶樣的產(chǎn)地區(qū)分[16]。本研究發(fā)現(xiàn)GC-IMS指紋圖譜可用于不同產(chǎn)地“漢中仙毫”的較好區(qū)分，與文獻(xiàn)報(bào)道中利用GC-IMS結(jié)合主成分分析，鑒定不同等級、產(chǎn)地、區(qū)域綠茶揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)基本一致[7,16,18]。

3 結(jié)論

采用GC-IMS技術(shù)對不同產(chǎn)地“漢中仙毫”茶湯揮發(fā)性氣味物質(zhì)進(jìn)行分析，共分析鑒定了61種揮發(fā)性有機(jī)化合物，包括一些物質(zhì)的二聚體?！皾h中仙毫”茶湯的揮發(fā)性氣味物質(zhì)主要包括醛類30種、酮類12種、酯類7種、醇類6種、呋喃類4種和酸類2種。來源于南鄭產(chǎn)區(qū)的茶葉，苯甲酸甲酯、2,6-二甲基4-庚酮質(zhì)量濃度相對較高；來源于勉縣的茶葉，2,5-二甲基呋喃、2-戊基呋喃、苯乙醛、正己醇、2-乙基呋喃、2-辛烯醛、丙酮質(zhì)量濃度相對較高，而二甲基丁醛質(zhì)量濃度最低；來源于鎮(zhèn)巴產(chǎn)區(qū)的茶葉，2,3-乙酰丙酮、2-己烯醛、2,4-二烯醛、2-戊酮質(zhì)量濃度相對較高；來源于西鄉(xiāng)產(chǎn)區(qū)的茶葉，庚醛、正丁醛、甲基丙醛(單體、二聚體)、2-丁酮質(zhì)量濃度相對較高；來源于寧強(qiáng)產(chǎn)區(qū)的茶葉，丁基丙酸、戊醛、甲基異丁基酮、乙酸乙酯、戊醇、1-辛烯-3-醇、3-辛醇、2-庚醇、(E)-2-庚烯醛質(zhì)量濃度相對較高。這些關(guān)鍵的揮發(fā)性風(fēng)味化合物，可能對于不同產(chǎn)地“漢中仙毫”茶湯氣味產(chǎn)生重要影響。不同產(chǎn)地“漢中仙毫”茶湯揮發(fā)性氣味成分氣相-離子遷移譜呈現(xiàn)出一定差異，通過主成分分析可較好地實(shí)現(xiàn)產(chǎn)地區(qū)分。本研究獲得了“漢中仙毫”揮發(fā)性氣味成分的指紋圖譜，可視化呈現(xiàn)出了不同產(chǎn)地“漢中仙毫”氣味物質(zhì)的差異，對今后“漢中仙毫”品質(zhì)控制、產(chǎn)地區(qū)分與品牌管理提供了參考。