朱偉，趙文亮，何凱

（1 中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院，深圳市精密工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518055；2中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院，粵港澳人機(jī)智能協(xié)同系統(tǒng)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室 廣東 深圳 518055）

生物技術(shù)是應(yīng)用生物學(xué)、化學(xué)和工程學(xué)的基本原理，使用生物體（包括微生物、動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞）或其成分（細(xì)胞器和酶）來(lái)改進(jìn)產(chǎn)品、改良植物和動(dòng)物，或基于特殊用途而培養(yǎng)微生物的技術(shù)［1-5］。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的飛速發(fā)展，基因工程、細(xì)胞工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程以及生化工程所取得的成果被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、輕化工等重要領(lǐng)域。

在現(xiàn)代生物技術(shù)迅速發(fā)展的進(jìn)程中，基因工程是現(xiàn)代生物工程技術(shù)的核心，其最突出的優(yōu)點(diǎn)是打破了物種之間常規(guī)育種的界限，原核生物與真核生物之間、動(dòng)物與植物之間，甚至人與其他生物之間的遺傳信息得以重組和轉(zhuǎn)移［6-8］。在整個(gè)基因工程技術(shù)操作流程中，對(duì)外源目標(biāo)基因的分離、克隆以及對(duì)目標(biāo)基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究構(gòu)成了下游基因工程常規(guī)操作的基礎(chǔ)，例如重組目標(biāo)基因表達(dá)的結(jié)構(gòu)和引入外源基因［9-10］。其中克隆挑取環(huán)節(jié)工作量很大，一個(gè)工業(yè)微生物改造項(xiàng)目通常需要挑取數(shù)萬(wàn)個(gè)菌落，傳統(tǒng)的人工挑取效率相對(duì)較低，操作者很容易遺漏目標(biāo)菌落或主觀選擇判斷，從而降低了實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的客觀性和科學(xué)性，使用機(jī)器人來(lái)代替人工克隆挑取操作已成為主流發(fā)展趨勢(shì)［11］。

歐美國(guó)家在生物圖像識(shí)別處理和計(jì)算運(yùn)動(dòng)控制方面具有較深入的研究，對(duì)克隆挑取機(jī)器人的研制起步較早。1990 年美國(guó)加利福尼亞州立大學(xué)Lawrence Berkeley 實(shí)驗(yàn)室結(jié)合圖像識(shí)別處理系統(tǒng)，采用帶有12 個(gè)挑針的轉(zhuǎn)輪完成了150 菌落/時(shí)的快速挑取［12］。1992 年英國(guó)MRC Laboratory of Molecular Biology 研制出同時(shí)具有菌落挑取和微孔板移動(dòng)功能的克隆挑取系統(tǒng)，挑取速度為853 菌落/時(shí)［13］。2009 年美國(guó)亞利桑那州立大學(xué)工程實(shí)驗(yàn)室采用12 挑針的旋轉(zhuǎn)輪，配備三個(gè)直線(xiàn)運(yùn)動(dòng)軸，挑取速度達(dá)1200菌落/時(shí)［14］。隨著克隆挑取技術(shù)的不斷發(fā)展，一些大型生物醫(yī)療器械公司也開(kāi)始涉足此方面的研究，其中國(guó)際市場(chǎng)成熟產(chǎn)品占有率比較高的有瑞士TECAN 公司研制的Freedom EVO工作站（包含克隆挑取功能）、英國(guó)KBiosyetems公司開(kāi)發(fā)的K 系列挑取機(jī)器人、美國(guó)Hudson Robotic 公司開(kāi)發(fā)的Rapid Pick 系列和Molecular Devices 公司開(kāi)發(fā)的Qpix 系列菌落挑選機(jī)器人，最大挑取速度超過(guò)3000菌落/時(shí)［15-17］。

我國(guó)在該方面的研究較晚，相比國(guó)外相應(yīng)研究成果較少，與國(guó)外同類(lèi)型儀器仍有較大差距。2003 年北京機(jī)械工業(yè)自動(dòng)化研究所研制了包含96個(gè)挑針的挑取頭和8通道的微量移液系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)克隆挑取和自動(dòng)分液的功能，仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段［18-19］。本文基于國(guó)外傳統(tǒng)克隆挑取機(jī)器人永久式金屬針頭挑取方案具有挑取效率低、消毒不徹底、制造成本高等缺點(diǎn)進(jìn)行了改造，提出采用一次性挑針挑取菌落以提高工作效率及挑取結(jié)果科學(xué)性的方案。

1 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)基本原理

克隆菌落挑取機(jī)器人主要是由視覺(jué)、控制和執(zhí)行三個(gè)系統(tǒng)構(gòu)成。視覺(jué)系統(tǒng)主要是將培養(yǎng)皿中菌落轉(zhuǎn)換成圖像數(shù)字信號(hào)，然后通過(guò)圖像信號(hào)的處理，識(shí)別出目標(biāo)菌落［20-22］?？刂撇呗允菍?duì)已經(jīng)識(shí)別出的菌落進(jìn)行坐標(biāo)轉(zhuǎn)換，將目標(biāo)菌落的圖像坐標(biāo)轉(zhuǎn)換成世界坐標(biāo)，然后對(duì)菌落挑取路徑進(jìn)行優(yōu)化，完成目標(biāo)菌落的挑取排序。執(zhí)行系統(tǒng)主要是根據(jù)識(shí)別出的菌落坐標(biāo)，控制器控制執(zhí)行機(jī)構(gòu)完成挑針挑取任務(wù)，然后接種到96孔板中［23-25］。圖1為克隆挑取設(shè)備完成單個(gè)克隆挑取所經(jīng)歷的過(guò)程。

克隆挑取機(jī)器人當(dāng)前的技術(shù)路線(xiàn)是使用圖像處理和機(jī)器視覺(jué)技術(shù)來(lái)完成目標(biāo)菌落的圖像采集和定位，安裝在機(jī)械臂上的針狀金屬頭用于將目標(biāo)菌落挑取到96 孔板中，然后使用蒸餾水、醫(yī)用酒精和加熱器分別對(duì)挑針進(jìn)行清洗、消毒和高溫滅菌［26-29］。但是目前傳統(tǒng)技術(shù)路線(xiàn)具有以下缺點(diǎn)：

（1）現(xiàn)有的克隆挑取機(jī)器人采用的永久性金屬針頭要求較高的加工精度，制造成本相應(yīng)有所提高；

（2）由于金屬針頭在工作過(guò)程中清洗消毒后循環(huán)使用，工作過(guò)程中可能存在消毒不徹底的因素，降低了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和科學(xué)性；

圖1 克隆挑取設(shè)備單個(gè)克隆挑取經(jīng)歷過(guò)程Fig.1 Single clone-selecting process

（3）由于金屬針頭每次循環(huán)過(guò)程中都需要高溫消毒，增加了能量消耗和單位挑取時(shí)間。

基于上述缺點(diǎn)本文改進(jìn)了挑選的方法，提出了一種使用一次性竹簽式針頭進(jìn)行菌落挑選的方式，有效地解決了傳統(tǒng)主流技術(shù)存在的上述問(wèn)題：

（1）竹簽式針頭為木質(zhì)材料，制造成本比較低，其直徑大約是金屬針頭5倍左右，其要求的裝配精度也相對(duì)較低；

（2）竹簽式針頭只用一次后就更換新的針頭，從根源上消除了傳統(tǒng)金屬針頭消毒不徹底的問(wèn)題；

（3）由于竹簽式自動(dòng)菌落挑選儀針頭是一次性的，對(duì)挑針預(yù)先經(jīng)過(guò)批量高溫滅菌處理后即可投入使用，從而節(jié)省了每次循環(huán)的能量消耗和消毒時(shí)間。

針頭傳送機(jī)構(gòu)和針頭夾取及點(diǎn)樣機(jī)構(gòu)相對(duì)其他機(jī)構(gòu)精度要求不高，且需要短時(shí)間內(nèi)大行程運(yùn)動(dòng)，故這兩個(gè)機(jī)構(gòu)優(yōu)先選用氣缸驅(qū)動(dòng)。由于在挑取過(guò)程中針頭夾取及點(diǎn)樣機(jī)構(gòu)隨轉(zhuǎn)盤(pán)驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)轉(zhuǎn)動(dòng)，為防止氣管之間纏繞選用了氣動(dòng)旋轉(zhuǎn)接頭來(lái)解決此問(wèn)題。圖2 全面展示了機(jī)器人的5 部分主要機(jī)構(gòu)，各機(jī)構(gòu)關(guān)系如圖3所示。

圖2 克隆挑取機(jī)器人基本結(jié)構(gòu)Fig.2 Basic structure of the clone-selecting robot

圖3 各構(gòu)件及系統(tǒng)關(guān)系圖Fig.3 Design for the clone-selecting robot

2 控制系統(tǒng)設(shè)計(jì)

考慮到菌落挑取對(duì)精度的要求，本課題中轉(zhuǎn)盤(pán)驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)和培養(yǎng)皿平面運(yùn)動(dòng)導(dǎo)軌機(jī)構(gòu)均由伺服電機(jī)驅(qū)動(dòng)。由于控制電機(jī)數(shù)目比較多，執(zhí)行中間環(huán)節(jié)配備了多個(gè)傳感器對(duì)其檢測(cè)定位，并且對(duì)菌落進(jìn)行圖像處理后需要計(jì)算機(jī)對(duì)菌落位置轉(zhuǎn)換進(jìn)行大量計(jì)算，故本課題優(yōu)先選用工控機(jī)-運(yùn)動(dòng)控制卡-CCD 相機(jī)對(duì)設(shè)備進(jìn)行控制［30］。圖2 中各構(gòu)件和各控制系統(tǒng)的關(guān)系如圖3所示。

控制系統(tǒng)可以被分為六個(gè)模塊，分別是工控機(jī)模塊、CCD 相機(jī)模塊、運(yùn)動(dòng)控制卡模塊、伺服驅(qū)動(dòng)模塊、輸入信號(hào)模塊和輸出信號(hào)模塊。其結(jié)構(gòu)關(guān)系如圖4 所示，每個(gè)模塊的功能描述如下：

圖4 控制系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖Fig.4 Design for the control unit

（1）工控機(jī)模塊 負(fù)責(zé)CCD 相機(jī)采集圖像的分析處理工作，負(fù)責(zé)整個(gè)設(shè)備資源的調(diào)動(dòng)，使設(shè)備穩(wěn)定有序的運(yùn)轉(zhuǎn)。具體完成的任務(wù)包括基于圖像處理軟件HexSight 對(duì)采集的圖像進(jìn)行處理，并進(jìn)行被識(shí)別對(duì)象坐標(biāo)的提取。

（2）CCD相機(jī)模塊 負(fù)責(zé)采集克隆菌落圖像。

（3）運(yùn)動(dòng)控制卡模塊 負(fù)責(zé)對(duì)電機(jī)的控制；板卡還用于接收一些設(shè)備的運(yùn)行信息，比如軸狀態(tài)、軸速度和軸運(yùn)行時(shí)間等。

（4）伺服驅(qū)動(dòng)模塊 該模塊負(fù)責(zé)驅(qū)動(dòng)電機(jī)工作，伺服電機(jī)負(fù)責(zé)帶動(dòng)十字滑臺(tái)運(yùn)動(dòng)來(lái)完成定位，帶動(dòng)轉(zhuǎn)盤(pán)轉(zhuǎn)動(dòng)來(lái)完成間歇運(yùn)動(dòng)。

（5）輸入信號(hào)模塊 負(fù)責(zé)接收光電信號(hào)的輸入，包括十字滑臺(tái)和轉(zhuǎn)盤(pán)的原點(diǎn)信號(hào)、十字滑臺(tái)的限位信號(hào)、檢測(cè)傳送機(jī)構(gòu)中挑針有無(wú)及氣缸狀態(tài)輸入信號(hào)。

（6）輸出信號(hào)模塊 負(fù)責(zé)控制電磁閥實(shí)現(xiàn)對(duì)挑針上下行和氣爪張閉的控制。

計(jì)算機(jī)和執(zhí)行機(jī)構(gòu)之間是通過(guò)與運(yùn)動(dòng)控制卡相連的端子板上的I/O 接口來(lái)傳送數(shù)據(jù)，運(yùn)動(dòng)控制卡與執(zhí)行機(jī)構(gòu)之間以光電耦合方式實(shí)現(xiàn)通信，大大增強(qiáng)了通信的抗干擾能力，運(yùn)動(dòng)控制卡可以同時(shí)控制多個(gè)軸聯(lián)動(dòng)運(yùn)行，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)如圖5（a）所示。本課題設(shè)備占用與其配套的端子板上輸入端口有16 個(gè)，輸出端口有11 個(gè)，各端口分別與控制卡相連的端子板連接，圖5（b）為端子板連接實(shí)物圖，各I/O 口定義如表1、表2所示。

控制系統(tǒng)硬件連接布局如圖6 所示。系統(tǒng)工作流程主要由取針-挑取-接種-落針?biāo)牟糠謩?dòng)作組成，各氣爪、氣缸運(yùn)行過(guò)程如圖7 所示，其中1、2、3 號(hào)氣缸位置保持不動(dòng)，1～8號(hào)氣爪順時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)實(shí)現(xiàn)克隆挑取整個(gè)過(guò)程。當(dāng)8 個(gè)氣爪工位滿(mǎn)載循環(huán)運(yùn)行時(shí)，各號(hào)氣爪上挑針的功能如表3 所示，整個(gè)系統(tǒng)工作流程如圖8 所示。

3 克隆挑取實(shí)驗(yàn)研究

為了驗(yàn)證結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和控制系統(tǒng)的可靠性，本實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌為例，將其從培養(yǎng)皿挑取并接種到96 孔板中。將控制系統(tǒng)中電機(jī)、電磁閥、傳感器上電后其配帶的軟件便會(huì)識(shí)別到各終端的狀態(tài)，圖9為控制系統(tǒng)上電后軟件檢測(cè)的輸入、輸出設(shè)備元件狀態(tài)，由圖可知各連接設(shè)備正常。

表1 各輸入端口地址分配及功能表Tab.1 Address allocation and function of the input ports

圖5 控制卡原理及端子板接線(xiàn)圖Fig.5 Control principle and terminal board for the signal input and output

表2 各輸出端口地址分配及功能表Tab.2 Address allocation and function of the output ports

圖6 控制系統(tǒng)硬件連接圖Fig.6 Hardware for the control system

圖7 氣缸、氣爪位置關(guān)系及運(yùn)行過(guò)程Fig.7 Position and the operation process of the cylinder and pneumatic gripper

表3 滿(mǎn)載循環(huán)工作各氣爪上挑針功能Tab.3 Picking function of the needles on each pneumatic gripper in a full-load working cycle

圖8 控制系統(tǒng)工作流程圖Fig.8 Working flowsheet for the control system

使用Halcon 軟件對(duì)相機(jī)拍攝后的菌落圖像進(jìn)行菌落識(shí)別和篩選后（圖10），便可定位各目標(biāo)菌落對(duì)應(yīng)的像素點(diǎn)在圖像上的坐標(biāo)（圖11），然后對(duì)相機(jī)進(jìn)行標(biāo)定從而實(shí)現(xiàn)像素坐標(biāo)系到世界坐標(biāo)系的轉(zhuǎn)換，本課題選用的是Hexsight公司提供的圖像處理軟件，將相機(jī)拍攝的菌落照片上傳到該軟件上后經(jīng)過(guò)標(biāo)定及坐標(biāo)轉(zhuǎn)換就得到了每個(gè)菌落的世界坐標(biāo)［31］，如圖12所示。

確定控制系統(tǒng)、相機(jī)標(biāo)定及坐標(biāo)轉(zhuǎn)換無(wú)誤后，啟動(dòng)電機(jī)、氣缸隨程序設(shè)定步驟依次運(yùn)行，取針-挑取-接種-落針?biāo)膫€(gè)步驟如圖13 所示。為了檢測(cè)挑取效果，現(xiàn)以其中三個(gè)菌落為例來(lái)檢驗(yàn)設(shè)備挑取準(zhǔn)確性。隨機(jī)取培養(yǎng)皿中三個(gè)目標(biāo)菌落進(jìn)行挑取，挑取結(jié)果表4 及圖14 所示，結(jié)果顯示平均挑取誤差為0.03 mm，遠(yuǎn)小于菌落平均直徑2 mm，滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求。

圖9 控制系統(tǒng)狀態(tài)顯示圖Fig.9 Display of the control system

圖10 菌落圖像識(shí)別及篩選Fig.10 Colony image recognition and screening

4 結(jié)論與展望

本文在綜合分析克隆菌落挑取機(jī)器人國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀后，設(shè)計(jì)了一款多針、轉(zhuǎn)盤(pán)式的菌落挑取機(jī)器人，采用模塊化的設(shè)計(jì)方法，提出克隆菌落挑取機(jī)器人的總體設(shè)計(jì)方案。然后對(duì)各個(gè)功能模塊進(jìn)行具體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，進(jìn)而對(duì)菌落挑取視覺(jué)定位系統(tǒng)進(jìn)行設(shè)計(jì)，最后通過(guò)控制系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和關(guān)鍵零部件的選型計(jì)算完成樣機(jī)的制作，在樣機(jī)的基礎(chǔ)上選用大腸桿菌進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了克隆菌落挑取機(jī)器人功能模塊的可行性、菌落挑取視覺(jué)定位算法的可行性與準(zhǔn)確性。通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，得出如下結(jié)論：

（1）本文提出的基于取針-挑取-接種-落針?biāo)牟焦ぷ髁鞒痰囊淮涡蕴翎樋寺√羧》桨竷H需挑取前對(duì)挑針進(jìn)行一次批量消毒，摒棄了傳統(tǒng)設(shè)備工作中對(duì)金屬挑針清洗、消毒兩項(xiàng)中間環(huán)節(jié)（如摘要圖所示）。采用多針、轉(zhuǎn)盤(pán)式結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)滿(mǎn)足了取針-挑取-接種-落針?biāo)墓の煌瑫r(shí)進(jìn)行，大大提高了挑取效率。

（2）選擇采用基于PCI 總線(xiàn)模式控制的“工控機(jī)+運(yùn)動(dòng)控制卡+CCD 相機(jī)”的開(kāi)放式運(yùn)動(dòng)控制交互方法，并提出了控制系統(tǒng)整體結(jié)構(gòu)框架，對(duì)控制系統(tǒng)的各個(gè)模塊進(jìn)行設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)證明樣機(jī)可實(shí)現(xiàn)多軸聯(lián)動(dòng)點(diǎn)位運(yùn)動(dòng)，圖片數(shù)字信號(hào)的接收與傳送，傳感器數(shù)字信號(hào)與控制卡之間信號(hào)的相互傳遞。

（3）基于Halcon、HexSight 圖像處理軟件平臺(tái)設(shè)計(jì)的視覺(jué)定位系統(tǒng)可行且視覺(jué)定位精度滿(mǎn)足設(shè)計(jì)要求。菌落挑取視覺(jué)定位算法準(zhǔn)確地建立了以像素為單位的圖像坐標(biāo)系與以毫米為單位的世界坐標(biāo)系之間的轉(zhuǎn)換關(guān)系，快速準(zhǔn)確計(jì)算出目標(biāo)菌落的世界坐標(biāo)，平均定位精度為0.03 mm。執(zhí)行機(jī)構(gòu)可以精確挑取指定菌落并接種到96 孔板中，證明了一次性挑針挑取方式的可行性。

隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)還有些待改進(jìn)的地方，也是后續(xù)研究工作的幾個(gè)方面。

圖11 各目標(biāo)菌落面積及幾何中心坐標(biāo)Fig.11 Target colony area and geometric center coordinates

圖12 相機(jī)標(biāo)定及坐標(biāo)轉(zhuǎn)換Fig.12 Camera calibration and coordinate conversion

（1）在保證能夠滿(mǎn)足加工工藝的情況下，可以增加轉(zhuǎn)盤(pán)上的工位，減小培養(yǎng)皿下方直線(xiàn)模組尺寸，從而減小克隆挑取機(jī)器人轉(zhuǎn)盤(pán)的轉(zhuǎn)動(dòng)角距和直徑，降低設(shè)備整體重心，使之結(jié)構(gòu)更加緊湊，運(yùn)行更加快捷。

圖13 運(yùn)行步驟實(shí)物圖Fig.13 Process operation

圖14 選定目標(biāo)菌落及其挑取結(jié)果Fig.14 Target colonies selected and their analysis

（2）對(duì)于含有單種菌落的培養(yǎng)皿而言，目前控制和圖像識(shí)別系統(tǒng)只能挑取能夠識(shí)別到的所有菌落，無(wú)法在控制界面上人工指定目標(biāo)菌落點(diǎn)動(dòng)挑取，也無(wú)法對(duì)挑取目標(biāo)菌落的大小、間距、數(shù)量、灰度值等特征進(jìn)行動(dòng)態(tài)設(shè)定范圍內(nèi)挑取。

（3）對(duì)于含有多種菌落的培養(yǎng)皿而言，目前控制和圖像處理系統(tǒng)還無(wú)法通過(guò)識(shí)別菌落顏色、大小、邊緣形狀等特征對(duì)指定單種或多種進(jìn)行選擇性挑取。

（4）對(duì)培養(yǎng)皿中菌落圖像識(shí)別處理后，工控機(jī)會(huì)得到一系列菌落坐標(biāo)，其排列順序影響著執(zhí)行機(jī)構(gòu)運(yùn)動(dòng)的總行程，進(jìn)而會(huì)影響挑取效率，故需要設(shè)計(jì)一套算法使之能夠計(jì)算出每次挑取培養(yǎng)皿中目標(biāo)菌落對(duì)應(yīng)的最佳挑取路徑。

表4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Experimental results