楊永富，耿碧男，宋皓月，何橋?qū)?，何明雄，鮑杰，白鳳武，楊世輝

（1 湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，省部共建生物催化與酶工程國家重點實驗室，湖北省環(huán)境微生物工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430062；2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部沼氣科學(xué)研究所，生物質(zhì)能技術(shù)研究中心，四川 成都 610041；3 華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院，生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海 200237；4 上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，微生物代謝國家重點實驗室，上海 200240）

下一代測序（next generation sequencing，NGS）與質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了系統(tǒng)生物學(xué)（systems biology）方法在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，推動了在基因組層面對生物體“基因-RNA-蛋白-代謝-表型”變化規(guī)律與調(diào)控機制的深入研究［1］。在系統(tǒng)生物學(xué)研究的基礎(chǔ)上，通過引入工程學(xué)思想策略，并與現(xiàn)代生物學(xué)、系統(tǒng)科學(xué)及合成科學(xué)進(jìn)行融合，使生物技術(shù)系統(tǒng)化和標(biāo)準(zhǔn)化，形成了在理性設(shè)計指導(dǎo)下重組或從頭合成新的并具有特定功能“人造生命”為目標(biāo)的“合成生物學(xué)”［2-3］。同時，建立了合成生物學(xué)“設(shè)計-構(gòu)建-測試-學(xué)習(xí)”（design-build-test-learn，DBTL）的研究策略，推動了通過理性或半理性改造工業(yè)微生物底盤細(xì)胞，實現(xiàn)“建物致知”與“建物致用”目標(biāo)的研究進(jìn)程。

運動發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis）是一種兼性厭氧革蘭氏陰性菌，具有許多獨特的生理特點和優(yōu)異的工業(yè)生產(chǎn)特性，是目前唯一已知能夠在厭氧條件下利用Entner-Doudoroff（ED）途徑的微生物，具有較高的糖吸收率、乙醇收率和乙醇耐受性等優(yōu)良特性；近年來被作為纖維素類生物質(zhì)生物煉制生產(chǎn)生物能源的細(xì)胞工廠受到重視［4-5］，是美國能源部國家可再生能源實驗室（National Renewable Energy Laboratory，NREL）及大湖生物能源研究中心（Great Lakes Bioenergy Research Center，GLBRC）研究的主要底盤細(xì)胞之一。

盡管已經(jīng)利用運動發(fā)酵單胞菌開展了一系列包括生理、遺傳及代謝工程改造方面的研究，特別是拓寬了其底物利用范圍及產(chǎn)物生成種類，在“建物致用”的目標(biāo)上取得了可喜進(jìn)展，但是與模式微生物菌株相比，運動發(fā)酵單胞菌在生物元件的挖掘與定量、生物元件組裝、邏輯線路構(gòu)建、代謝途徑的時空調(diào)控以及基因組編輯與優(yōu)化等“建物致知”領(lǐng)域剛剛起步。本文簡述了運動發(fā)酵單胞菌作為潛在的細(xì)胞工廠實現(xiàn)工業(yè)產(chǎn)品生產(chǎn)的獨特生理特點，重點總結(jié)了其在平臺化合物、食品和藥品生產(chǎn)等工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用，系統(tǒng)介紹了運動發(fā)酵單胞菌系統(tǒng)生物學(xué)研究進(jìn)展，同時探討了運動發(fā)酵單胞菌現(xiàn)有的遺傳學(xué)方法、技術(shù)與工具等方面的進(jìn)展及瓶頸，以及進(jìn)一步開發(fā)運動發(fā)酵單胞菌作為優(yōu)良底盤細(xì)胞，推動合成生物學(xué)理論研究和實踐應(yīng)用發(fā)展的研究方向。

1 運動發(fā)酵單胞菌的特性及潛在應(yīng)用

1.1 獨特的生理特點

運動發(fā)酵單胞菌最初從墨西哥的龍舌蘭酒（pulque）中分離得到［6］，因其獨特的生理特性和乙醇發(fā)酵生產(chǎn)能力受到研究人員的重視［7］。運動發(fā)酵單胞菌培養(yǎng)過程具有副產(chǎn)物生成少、葡萄糖代謝速率快、對高濃度乙醇（體積分?jǐn)?shù)16%）耐受性好、生長溫度（24～45 ℃）和pH 范圍（4.0～8.0）廣泛且“通常認(rèn)為是安全的”（generally regarded as safe，GRAS）等特性［8-10］（圖1）。表型芯片研究結(jié)果表明，運動發(fā)酵單胞菌的生理特性更接近釀酒酵母而不是細(xì)菌［11］，但是與釀酒酵母相比，運動發(fā)酵單胞菌有著基因組小、對糖的轉(zhuǎn)化率及乙醇收率高等優(yōu)勢［4-5］。另外，研究表明運動發(fā)酵單胞菌具有完整的Mo 固氮酶系統(tǒng)及生物固氮能力，可利用空氣中的氮氣作為唯一氮源生產(chǎn)乙醇且不影響乙醇產(chǎn)量，碳轉(zhuǎn)化率可達(dá)到理論最大值的97%，對該氮代謝途徑的解析有利于進(jìn)一步闡明該菌的生理特征［12-13］。

運動發(fā)酵單胞菌對高乙醇或高糖的耐受性可能和其獨特的細(xì)胞膜成分相關(guān)，在其細(xì)胞膜上含有豐富的磷脂和脂肪酸，膜質(zhì)中的藿烷（hopanoid）含量可高達(dá)總脂質(zhì)的50%，藿烷與脂肪有助于維持細(xì)胞質(zhì)膜的穩(wěn)定與通透性，可能是其高乙醇耐受的原因之一［14］。在乙醇濃度上升或溫度升高時，運動發(fā)酵單胞菌細(xì)胞膜的磷脂和脂肪酸的各組分相對比例會發(fā)生變化，同時膜蛋白含量也增加，從而降低乙醇或溫度升高時對膜流動性的不良影響［15-16］。近期研究表明降低藿烷的含量或改變其極性頭部組分會降低其對乙醇的耐受，且高含量的藿烷有助于菌株對低pH 的適應(yīng)，研究人員結(jié)合細(xì)菌衍生脂質(zhì)體的光譜分析推測藿烷可能通過疏水作用和脂質(zhì)間氫鍵相互作用來穩(wěn)定脅迫環(huán)境下細(xì)菌膜的生理功能［17］。耐低pH 突變株的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)也表明，在酸性pH 環(huán)境下，突變菌株中藿烷合成相關(guān)的基因表達(dá)量高于野生型菌株［18］，證明高含量的藿烷成分有助于突變菌株對酸性pH的耐受。

圖1 運動發(fā)酵單胞菌的重要生理特性及其多樣化的應(yīng)用Fig.1 Physiological characteristics and diverse applications of Z.mobilis

另外，兼性厭氧的運動發(fā)酵單胞菌是目前已知唯一可在厭氧條件下通過ED 途徑代謝葡萄糖、果糖或蔗糖生產(chǎn)乙醇的微生物。通過ED 途徑，運動發(fā)酵單胞菌每代謝一分子的葡萄糖或者果糖只產(chǎn)生一分子的ATP，與釀酒酵母等微生物利用的Embden-Meyerhof-Parnas（EMP）途徑相比，等量糖代謝ATP 生成減少50%［5］。由于ATP 主要通過細(xì)胞生物量的積累而消耗，以維持胞內(nèi)代謝的能量平衡，ED 途徑菌體生物量積累少，大部分碳源（>95%）被轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物乙醇。同時，ED 途徑的酶占細(xì)胞總蛋白的50%左右［19-20］，并且每一個與糖降解有關(guān)的基因都高效表達(dá)，且基本都為組成型表達(dá)［21］。這種特異的糖代謝方式可能是在進(jìn)化過程中為適應(yīng)高糖環(huán)境而形成的，即遺失了EMP 代謝途徑中的關(guān)鍵調(diào)控酶——磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，Pfk）和三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA循環(huán)）中的2個關(guān)鍵酶，蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，Mdh）和酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體（α-ketoglutarate dehydrogenase complex，α-KDGH）。這一快速糖代謝通路的存在，使運動發(fā)酵單胞菌可快速代謝葡萄糖，再加上高效的丙酮酸脫羧酶（pyruvate decarboxylase，Pdc）和乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenaseⅡ，AdhB），使其可以快速生成乙醇。

運動發(fā)酵單胞菌這種獨特的糖代謝途徑可能和其能量產(chǎn)生與生長部分耦聯(lián)的現(xiàn)象相關(guān)，即其能量的產(chǎn)生率和利用率之間不完全關(guān)聯(lián)。運動發(fā)酵單胞菌的呼吸鏈速率很高，比常見的模式微生物大腸桿菌和釀酒酵母要高，但其生物學(xué)功能尚未完全解析［22］。目前的研究顯示運動發(fā)酵單胞菌具有一個結(jié)構(gòu)性呼吸鏈，包括II 型NADH 脫氫酶（Ndh）、輔酶Q10和細(xì)胞色素BD 末端氧化酶，以及一些次要的或仍未確定的成分，呼吸鏈在有氧條件下使用氧作為末端電子受體［23］，運動發(fā)酵單胞菌是少數(shù)已知可以用NADH和NADPH作為呼吸型NADH 脫氫酶電子供體的細(xì)菌之一［24］。另外，葡萄糖和D-乳酸也可以為呼吸鏈提供電子，分別向與膜結(jié)合的葡萄糖脫氫酶和D-乳酸脫氫酶提供電子，這些電子傳遞給輔酶Q10之后，最終傳遞到能夠?qū)⒀鯕膺€原為水的末端氧化酶［25］。同時，盡管運動發(fā)酵單胞菌中存在的F 型ATP 合成酶（FoF1-type ATPase）可以通過質(zhì)子梯度產(chǎn)生ATP［26］，但其氧化磷酸化效率低下或不參與能量的產(chǎn)生。運動發(fā)酵單胞菌這種高效率電子傳遞鏈和低氧化磷酸化效率的現(xiàn)象，可以作為細(xì)菌中的一種呼吸鏈系統(tǒng)模式進(jìn)行研究，揭示其低效率呼吸的原因，理解呼吸鏈組分與能量產(chǎn)生和胞內(nèi)氧化還原平衡之間的關(guān)系［23］。

運動發(fā)酵單胞菌獨特的生理特征除有利于其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用外，還有助于研究人員理解微生物底盤細(xì)胞的代謝。如運動發(fā)酵單胞菌中的EMP 途徑、TCA 循環(huán)和磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，PPP）等途徑不完整，可以通過合成生物學(xué)手段研究不同能量代謝途徑及其組合對底盤細(xì)胞代謝的影響。例如，為了驗證ATP產(chǎn)量對運動發(fā)酵單胞菌生物量積累的影響，研究者嘗試補全EMP 途徑［27-28］，但結(jié)果表明糖代謝受到影響、菌株生長受到抑制、且有甘油等副產(chǎn)物生成，分析認(rèn)為可能是因為內(nèi)源代謝物濃度改變使外源引入的反應(yīng)反向進(jìn)行［28］，這些研究為理解底盤細(xì)胞的代謝環(huán)境如何影響外源基因表達(dá)提供了指導(dǎo)。

1.2 廣泛的底物利用性與優(yōu)良的環(huán)境適應(yīng)性

野生型運動發(fā)酵單胞菌能利用的底物有限，只包括葡萄糖、果糖和蔗糖，無法利用五碳糖，如來自木質(zhì)纖維素水解液中的木糖和阿拉伯糖等［5］。為了擴大其底物利用譜，研究人員通過代謝工程及實驗室適應(yīng)性進(jìn)化（adaptive laboratory evolution，ALE）等不同的策略做了大量的菌株改造工作。如通過引入大腸桿菌中4個與木糖代謝相關(guān)的基因xylA/B、tal和tkt，首次得到了可以利用木糖的重組菌株Z.mobilisCP4（pZB5）［29］。在此基礎(chǔ)上，采用類似策略通過代謝工程手段引入與阿拉伯糖代謝相關(guān)的5個基因，得到了可以利用阿拉伯糖的菌株Z.mobilisCP4（pZB206）［30］。最近一株由Z.mobilisATCC ZW658 通過適應(yīng)性進(jìn)化得到的突變株AD50 可以很好地共利用葡萄糖與木糖，其葡萄糖和木糖共利用時的利用速率分別為1.24 g/（g·h）和1.34 g/（g·h）（以干物質(zhì)計），該突變株是目前最好的葡萄糖和木糖共利用菌株［31］。通過代謝工程手段改造運動發(fā)酵單胞菌，提高菌株對五碳糖利用的研究進(jìn)展可參考此前相關(guān)的綜述文章［5，10］。

除了可以利用純糖進(jìn)行乙醇發(fā)酵外，運動發(fā)酵單胞菌還可以利用多種生物質(zhì)原料經(jīng)過預(yù)處理與酶水解等方法釋放的單糖進(jìn)行乙醇發(fā)酵［10］，如木質(zhì)纖維素生物質(zhì)（玉米秸稈等）、能源作物（甘蔗、甜菜、角豆、甘薯和甜高粱等）、能源植物（如柳枝稷）、工業(yè)廢料（豆粕）、食物殘渣、農(nóng)業(yè)廢料（玉米芯殘渣、米糠、甜高粱秸稈、甘蔗糖蜜、竹殘渣、廢紙渣等）以及藻體生物質(zhì)等［32-46］。研究運動發(fā)酵單胞菌對多種碳來源原料的利用，特別是來自工業(yè)、農(nóng)業(yè)和城市廢棄物的原料，將有助于將廢棄物轉(zhuǎn)化為有價值的生物燃料或化學(xué)品，并促進(jìn)其在不同領(lǐng)域的應(yīng)用。

運動發(fā)酵單胞菌在由高糖引起的高滲條件下仍能生長，在250 g/L葡萄糖或300 g/L蔗糖條件下都能保持生長，只是會有較長的延遲期［47-48］。研究表明，運動發(fā)酵單胞菌可以在高糖環(huán)境下生長，可能與其使用無需耗能的協(xié)助擴散糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和由葡萄糖果糖氧化還原酶（glucose-fructose oxidoreductase，Gfor）轉(zhuǎn)化果糖形成的山梨醇有關(guān)［49-50］。當(dāng)細(xì)胞處于高濃度蔗糖環(huán)境中時，山梨醇在細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)的積累可以高達(dá)1 mol/L，幫助降低外部高滲透壓對細(xì)胞造成的生理傷害［50］。山梨醇除了有利于細(xì)胞在由高糖引起的高滲透壓環(huán)境下生長外，還有助于運動發(fā)酵單胞菌對溫度和乙醇的耐受［47］。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究表明，運動發(fā)酵單胞菌培養(yǎng)于220 g/L 葡萄糖的高糖條件下時，細(xì)胞會通過調(diào)節(jié)與膜通道和轉(zhuǎn)運體、應(yīng)激反應(yīng)機制和代謝途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平來實現(xiàn)對高濃度葡萄糖的響應(yīng)［48］。

運動發(fā)酵單胞菌可以適應(yīng)廣泛的pH范圍（4.0～8.0），尤其是可以在低pH 環(huán)境中生長。2019 年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部成都沼氣科學(xué)研究所何明雄團隊通過多輪常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變，獲得了對乙酸耐受性增強的運動發(fā)酵單胞菌突變株AQ8-1 和AC8-9，在5.0～8.0 g/L 乙酸環(huán)境下這兩個突變株的生長和乙醇產(chǎn)率較野生型均有提升，且通過第3輪ARTP 誘變得到的突變株P(guān)H1-29 可以在pH 4.0或3.5 的環(huán)境下生長，而野生型菌株基本不生長［51］。通過另外一種策略ALE得到的耐低pH突變株3.5M 和3.6M，與野生型ZM4相比，在pH 3.8下的生長速度提高了50%～130%，發(fā)酵時間縮短了4～9 h，乙醇產(chǎn)量提高了20%～63%［18］。這些酸耐受突變菌株的獲得為直接利用酸性水解液進(jìn)行乙醇發(fā)酵奠定了基礎(chǔ)。

運動發(fā)酵單胞菌的兼性厭氧特性為其在工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用提供了便利。此外，由非絮凝菌株Z.mobilisZM4 突變而來的絮凝菌株Z.mobilisZM401 可以在生物反應(yīng)器培養(yǎng)過程中進(jìn)行自絮凝，這一特性可以使細(xì)胞在連續(xù)培養(yǎng)和發(fā)酵條件下不隨發(fā)酵液的排出而流失，提高細(xì)胞密度及生物反應(yīng)器的乙醇生產(chǎn)強度，同時還可增強對抑制物的耐受性，進(jìn)而降低乙醇工業(yè)化生產(chǎn)的成本［4，52］。上海交通大學(xué)白鳳武課題組近期研究結(jié)果表明胞外多糖——纖維素是引起ZM401絮凝的主要物質(zhì)，通過基因序列比對和實驗驗證發(fā)現(xiàn)，引起ZM401自絮凝的主要原因是ZM401 中的纖維素合成基因bcsA（ZMO1083）的上游基因（ZMO1082）中一個胸腺嘧啶（T）的缺失，使ZM401 中的ZMO1082 與ZMO1083 融合形成了一個新基因bcsA_401，同時纖維素合成操縱子bcsABC在絮凝菌株ZM401 中的表達(dá)增高，使得纖維素合成在ZM401菌株中增加，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生絮凝［53-54］。

運動發(fā)酵單胞菌優(yōu)良的環(huán)境適應(yīng)性展示了其作為工業(yè)底盤細(xì)胞的潛力，其對纖維素水解液中抑制物的耐受性也通過不同方法得到了提高。例如過表達(dá)內(nèi)源NADH 氧化酶基因ZMO1885 增強了菌株的糠醛耐受性，且不引起胞內(nèi)輔因子擾動［55］；過表達(dá)內(nèi)源Na+/H+逆向協(xié)同轉(zhuǎn)運體基因nhaA（ZMO0119）增強了菌株對鈉離子和乙酸鈉的耐受［56-57］；通過基因組重排技術(shù)對菌株進(jìn)行多輪改造，得到的重組菌株可以耐受7.0 g/L 的乙酸和3.0 g/L 的糠醛［58］。工程菌株的改造提高了運動發(fā)酵單胞菌的底物利用及產(chǎn)品生產(chǎn)的魯棒性，為其在纖維素乙醇生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)［59-60］。

1.3 不同工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用及研究

與釀酒酵母相比，運動發(fā)酵單胞菌細(xì)胞體積小導(dǎo)致比表面積高，高細(xì)胞比表面積與胞內(nèi)ED 途徑共同影響下，使其葡萄糖代謝速度更快，同時ED 途徑產(chǎn)能水平低使生物量積累少，發(fā)酵過程乙醇對糖的表觀收率高，能耐受高濃度糖和產(chǎn)物乙醇。雖然野生型菌株不能利用木糖等五碳糖，而且木質(zhì)纖維素水解液中的抑制物對其生長以及乙醇發(fā)酵有影響，但是通過代謝工程、合成生物學(xué)及實驗室適應(yīng)性進(jìn)化等手段改造，可以解決這些問題，得到性狀優(yōu)良的菌株［5，60］。NREL 曾與杜邦公司（DuPont）合作，利用運動發(fā)酵單胞菌進(jìn)行纖維素乙醇示范生產(chǎn)技術(shù)開發(fā)。目前利用運動發(fā)酵單胞菌以玉米秸稈為原料通過脫乙酰化和機械研磨處理后的水解液進(jìn)行纖維素乙醇生產(chǎn)，乙醇濃度達(dá)到86 g/L，糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到理論轉(zhuǎn)化率的73.3%［32，61］。運動發(fā)酵單胞菌最近還展示了作為產(chǎn)電菌群的潛力（2.0 mW/m2），在生產(chǎn)乙醇的同時生產(chǎn)電能［62］。

在運動發(fā)酵單胞菌中還實現(xiàn)了多種化合物的生物合成，包括聚羥基丁酸（polyhydroxybutyrate，PHB）、D-乳酸、2，3-丁二醇、山梨醇、乙醛、異丁醇和乳糖酸等［63-75］（表1）。其中：通過引入PHB 合成操縱子phbCAB，實現(xiàn)了PHB 在運動發(fā)酵單胞菌中的積累，可達(dá)0.7%的細(xì)胞干重［74］；通過異源表達(dá)優(yōu)化乙酰乳酸合成酶（Als）、乙酰乳酸脫羧酶（AldC）和丁二醇脫氫酶（Bdh），實現(xiàn)了2，3-丁二醇在運動發(fā)酵單胞菌中的生物合成［76］，通過進(jìn)一步敲除乙醇生產(chǎn)途徑中的丙酮酸脫羧酶（Pdc）阻斷乙醇途徑的改造，使2，3-丁二醇的濃度從10 g/L 提高到120 g/L 以上［65］；通過敲除過氧化物酶基因（cat）并過表達(dá)呼吸鏈中的NADH 脫氫酶基因（ndh），使得乙醛產(chǎn)量達(dá)到1.3 mol/mol（葡萄糖）［66］；通過外源引入由組成型強啟動子Pgap驅(qū)動的2-酮基異戊酸脫羧酶（KdcA），并結(jié)合由誘導(dǎo)型啟動子Ptet驅(qū)動的人工操縱子als-ilvC-ilvD，在運動發(fā)酵單胞菌中成功構(gòu)建了異丁醇生物合成途徑，使異丁醇產(chǎn)量達(dá)到4.0 g/L［63］。近期，何明雄團隊通過引入外源乙烯形成酶（Efe），將運動發(fā)酵單胞菌改造為乙烯生產(chǎn)菌株，最高產(chǎn)率可達(dá)到12.83 nmol/mL（OD600）［67］。此外，多組學(xué)分析還為利用運動發(fā)酵單胞菌的甲基赤蘚糖醇磷酸（methylerythritol phosphate，MEP）途徑生產(chǎn)類異戊二烯提供了參考［25］。

表1 運動發(fā)酵單胞菌可生產(chǎn)的不同化合物名單Tab.1 Biochemicals produced by Z.mobilis

除了用于纖維素乙醇及平臺化合物生產(chǎn)，運動發(fā)酵單胞菌由于其GRAS及副產(chǎn)物低等優(yōu)點，在食品和藥品生產(chǎn)等領(lǐng)域也開始受到重視。在食品應(yīng)用中，釀酒酵母細(xì)胞壁成分被認(rèn)為是可引起炎癥性腸病或克羅恩?。–rohn's disease）的抗原，這種食物過敏反應(yīng)的存在使尋找酵母發(fā)酵替代菌株十分重要［77］。運動發(fā)酵單胞菌可以在發(fā)酵烘焙食品領(lǐng)域作為釀酒酵母的替代菌株，在對釀酒酵母具有不良反應(yīng)的人群中具有潛在的應(yīng)用價值。需要指出的是，野生型運動發(fā)酵單胞菌無法利用小麥面粉中的麥芽糖，因此研究人員通過在面團配方中添加運動發(fā)酵單胞菌能夠利用的蔗糖或與其他可食用微生物共發(fā)酵［78-81］，對運動發(fā)酵單胞菌在面粉發(fā)酵中糖的利用和發(fā)酵效果進(jìn)行了研究。日本福山大學(xué)的Yuji 和Kenzo［79］報道了在蔗糖添加量為5 g/100 g 面粉時有較好的發(fā)酵能力，而較高的蔗糖添加量會降低發(fā)酵性能。意大利米蘭大學(xué)Picozzi 課題組也證明了在每100 g 面粉1 g 或5 g蔗糖的情況下，運動發(fā)酵單胞菌可以有效發(fā)酵面團［80］，并且研究結(jié)果表明添加蔗糖顯著提高了運動發(fā)酵單胞菌的發(fā)酵性能，產(chǎn)氣率和保留率分別為80%和85%，最大面團高度提高了2.6 倍，說明在添加蔗糖的情況下，運動發(fā)酵單胞菌可以有效發(fā)酵面團，從而為無酵母發(fā)酵產(chǎn)品領(lǐng)域提供了新的途徑［78］。

與異型發(fā)酵型乳酸菌（Lactobacillus sanfranciscensis）以1∶1比例共發(fā)酵，為運動發(fā)酵單胞菌無法利用麥芽糖的問題提供了另外一個策略［81］。近期意大利米蘭大學(xué)Musatti 課題組［82］利用代謝組學(xué)，對運動發(fā)酵單胞菌在發(fā)酵小麥面團時產(chǎn)生的主要揮發(fā)性組分等進(jìn)行了測定，結(jié)果表明運動發(fā)酵單胞菌能產(chǎn)生傳統(tǒng)發(fā)酵劑類似的發(fā)酵產(chǎn)物，如乙醇、乙酸和4-羥基-2-丁酮（4-hydroxy-2-butanone），另外運動發(fā)酵單胞菌還能產(chǎn)生壬酸（nonanoic）、十一酸（undecanoic acid）、十六烯醛（2-undecanoic acid）和酒石酸二乙酯（tartaric acid diethyl ester）等，但添加NaCl 會影響發(fā)酵時間和發(fā)酵性能，該研究進(jìn)一步奠定了運動發(fā)酵單胞菌在烘焙食品中應(yīng)用的基礎(chǔ)。

近年來，利用益生元與益生菌的特性和功能造福人類健康已受到更多重視并取得了一定突破［83］，運動發(fā)酵單胞菌在這方面也有很大潛力。運動發(fā)酵單胞菌中含有的果聚糖蔗糖酶（SacB）可以被用于生成果聚糖（levan）和果寡糖（fructooligosaccharides，F(xiàn)OS）等功能性或保健產(chǎn)品。果聚糖在食品和醫(yī)用上具有多種功能，如抗腫瘤［84］、降血壓或作為益生元［85］等。FOS 也是一種益生元，它會導(dǎo)致胃腸道微生物群組成和/或活性發(fā)生特定變化而有益于宿主健康［86-87］。最近的研究還實現(xiàn)了使用果聚糖蔗糖酶來生產(chǎn)另一種益生元蔗果三糖（kestose），并開發(fā)了功能性產(chǎn)品［88］。

運動發(fā)酵單胞菌還是開菲爾酒中主要的細(xì)菌益生菌成分［89］。開菲爾酒是一種由細(xì)菌與酵母共發(fā)酵產(chǎn)生的低酒精度碳酸飲品，也是一種功能性保健飲品，在中國又稱為菌菇（tibicos），在一項對中國天山地區(qū)tibicos進(jìn)行單分子測序的研究中也發(fā)現(xiàn)了運動發(fā)酵單胞菌是其中的一種主要微生物［90］。研究人員在一種大鼠模型中評價了Z.mobilisUFPEDA-202的益生菌特性和安全性，結(jié)果表明Z.mobilisUFEPEDA-202 為無致病性的安全食用菌株，且對小鼠免疫功能有一定的改善作用［91］。近期一項研究評價了定期服用運動發(fā)酵單胞菌發(fā)酵液對便秘患者腸道功能的影響，結(jié)果表明服用帶有菌群的發(fā)酵液有助于改善腸道蠕動，而服用不帶菌群的發(fā)酵液可以有效降低膽固醇和血脂的含量［92］。運動發(fā)酵單胞菌的這些特性推動了其作為益生菌的商業(yè)化生產(chǎn)，標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)酵的運動發(fā)酵單胞菌原料已經(jīng)用于制備藥用膠囊型益生菌［93-94］。

由于運動發(fā)酵單胞菌具有作為底盤細(xì)胞發(fā)展的優(yōu)勢，在藥品開發(fā)中也得到了應(yīng)用。2019 年，德國Farmako公司報道了利用運動發(fā)酵單胞菌開發(fā)的重組菌株Z.cannabinoidis?利用葡萄糖生產(chǎn)大麻素的研究成果，其四氫大麻酚（tetrahydrocannabinol，THC）的成本約為傳統(tǒng)方法的千分之一，大大降低了生產(chǎn)大麻素的成本。與此前報道的利用酵母生產(chǎn)大麻素不同的是，該工藝不需要在合成大麻素后破細(xì)胞提?。?5］，Z.cannabinoidis生產(chǎn)的產(chǎn)物會直接釋放到培養(yǎng)環(huán)境中，從而可以實現(xiàn)連續(xù)培養(yǎng)。Farmako 公司宣稱目前該工藝生產(chǎn)了大約180種不同的大麻素衍生物，包括大麻二酚（cannabidiol，CBD）和THC，每克Z.cannabinoidis可以產(chǎn)生4.5千克THC，同時900 h不間斷生產(chǎn)。

2 運動發(fā)酵單胞菌系統(tǒng)生物學(xué)研究進(jìn)展

2.1 基因組序列與注釋的完成與更新

運動發(fā)酵單胞菌目前共發(fā)現(xiàn)3 個亞種：運動亞種（sp.mobilis）、梨亞種（sp.pomaceae）和弗朗西斯亞種（sp.francensis）。運動發(fā)酵單胞菌各亞種生存的溫度有所不同［96］，運動亞種可于24～45 ℃生存，且由于其發(fā)酵性能最佳被作為模式菌株研究。運動發(fā)酵單胞菌模式菌株ZM4（ATCC31821）的基因組于2005 年首次完成測序（圖2），其基因組由2 056 416 bp 組成，形成一個環(huán)狀染色體［97］；2009 年，利用二代測序技術(shù)和系統(tǒng)生物學(xué)數(shù)據(jù)對其基因組進(jìn)行了修正和更為精準(zhǔn)的基因組重注釋［98］。

隨著測序技術(shù)的發(fā)展及對ZM4 的進(jìn)一步深入研究，2018 年，結(jié)合多個實驗室的研究數(shù)據(jù)對ZM4 基因組進(jìn)行了再次更新，重點研究更新了4 個內(nèi)源質(zhì)粒信息并進(jìn)行了更加準(zhǔn)確的注釋，并探討了特定生長條件下質(zhì)粒的表達(dá)水平及其與宿主環(huán)境適應(yīng)性的關(guān)系［99］。目前，最新的ZM4 基因組包括一個2Mb 的環(huán)狀染色體（2 058 755bp）和4 個32～39kb 的質(zhì)粒（pZM32，32 791bp；pZM33，33 006bp；pZM36，36 494bp和pZM39，39 266bp）［99］。同時，木糖利用重組菌株8b 的基因組也得到了報道，其前期改造引入的兩個木糖利用表達(dá)框被準(zhǔn)確定位，其中Peno_talB-tktA-cat表達(dá)框插入到pZM36 質(zhì)粒上，該質(zhì)粒被重命名為pZM41；而Pgap_xylA-xylB-yiaB'-yiaA'-wecH'-tetA表達(dá)框插入到ZMO1237（ldhA）基因內(nèi)；另外還有65 個SNPs也一同得到鑒定［99］。

圖2 運動發(fā)酵單胞菌系統(tǒng)與合成生物學(xué)研究進(jìn)展Fig.2 Research progress of systems and synthetic biology in Z.mobilis

包括模式菌株ZM4 在內(nèi)，目前運動發(fā)酵單胞菌共有29 個基因組測序項目公開，其中13 個菌株的基因組被完整測序組裝，另外還有3個菌株基因組為Scaffold 狀態(tài)，其余為Contig 狀態(tài)（數(shù)據(jù)來源于NCBI 網(wǎng)站）。各菌株包含2～8 個質(zhì)粒不等，基因組大小在2.01～2.22Mb，部分菌株之間的進(jìn)化關(guān)系及基因組之間的差異也被比較分析［5，100］。相比于模式微生物釀酒酵母（12.12Mb）和大腸桿菌（5.15Mb），運動發(fā)酵單胞菌（2.14Mb）有基因組小的優(yōu)勢，便于開展基因組精簡優(yōu)化及基因組合成，是一個理想的工業(yè)微生物底盤細(xì)胞。

2.2 系統(tǒng)生物學(xué)方法的建立及應(yīng)用

基因組測序為比較基因組學(xué)的研究奠定了基礎(chǔ)，2005 年模式菌株ZM4 基因組測序確定時與Clusters of Orthologous Groups of proteins（COGs）數(shù)據(jù)庫中已測序的其他物種的基因組進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)其1668 個開放讀碼框中有768 個與新鞘氨醇桿菌（Novosphingobium aromaticivorans）高度相似，這一結(jié)果與前期16S rRNA 的測序結(jié)果一致［97］。比較基因組分析，目前作為常規(guī)方法在突變菌株突變位點確定的研究中廣泛應(yīng)用。

基于芯片分析的轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)2009 年在運動發(fā)酵單胞菌中首次應(yīng)用，結(jié)合代謝組學(xué)分析，開展了氧氣對運動發(fā)酵單胞菌發(fā)酵過程影響的研究［101］。研究發(fā)現(xiàn)在有氧與無氧條件下的差異表達(dá)基因有166 個，其中ED 途徑相關(guān)基因在穩(wěn)定期的表達(dá)水平在無氧條件下高于有氧條件，同時微生物生理及代謝組學(xué)數(shù)據(jù)表明在無氧條件下生長快、糖耗快、乙醇產(chǎn)量高、乳酸與乙酸等副產(chǎn)物少，該研究首次利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)并結(jié)合代謝組學(xué)從全局水平解釋了氧氣對運動發(fā)酵單胞菌碳代謝流及最終產(chǎn)物生成的影響［101］?；谛酒治龅霓D(zhuǎn)錄組學(xué)研究，隨后被用于比較運動發(fā)酵單胞菌不同生長環(huán)境下的基因表達(dá)情況，如高糖環(huán)境（220 g/L 葡萄糖）、乙醇脅迫（體積分?jǐn)?shù)5%或6%）、糠醛抑制及乙酸毒性等［48，102-108］，以及研究突變菌株間基因表達(dá)差異，如絮凝菌株ZM401 與非絮凝菌株的差異及乙酸耐受菌株AcR與野生型之間的差異等［53，107］（表2）。

表2 運動發(fā)酵單胞菌系統(tǒng)生物學(xué)研究進(jìn)展總結(jié)Tab.2 Summary of systems biology research progress in Z.mobilis

續(xù)表

隨著NGS 技術(shù)的發(fā)展，基于RNA-Seq 的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析得以建立。與基于基因芯片的技術(shù)相比，RNA-Seq 獲得的信息更多，基因表達(dá)的線性范圍寬，偏好性更?。?20］，在運動發(fā)酵單胞菌中被逐漸使用，如被用來研究質(zhì)?；蛟诓煌瑮l件下的表達(dá)水平、氧氣對代謝的影響、低pH 的耐受機制、氮源中鎂離子濃度對細(xì)胞生長的影響等［18，25，99，118］。近期對RNA-Seq 和基因芯片分析兩種技術(shù)在運動發(fā)酵單胞菌中進(jìn)行了比較研究，對木糖利用菌株8b 在糠醛刺激與脅迫條件下的基因轉(zhuǎn)錄水平研究發(fā)現(xiàn)這兩種轉(zhuǎn)錄組技術(shù)之間有比較高的相關(guān)性，均能用來表征基因表達(dá)水平，但RNA-Seq 技術(shù)能提供更多轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)上的信息［105］。

蛋白質(zhì)組學(xué)與代謝組學(xué)相關(guān)技術(shù)也在運動發(fā)酵單胞菌研究中建立?；谌蚪M磷酸化蛋白質(zhì)組研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有ED 途徑的酶在有氧情況下磷酸化增加［115］，而代謝組學(xué)研究也證明了ED 途徑在運動發(fā)酵單胞菌中為熱力學(xué)有利的途徑，其比大腸桿菌或釀酒酵母中的EMP 途徑有近兩倍的熱力學(xué)優(yōu)勢［114］；近期一項代謝組學(xué)研究表明，有氧培養(yǎng)條件下NADH/NAD+比值降低與磷酸化的糖酵解中間體濃度升高有關(guān)［119］。這些不同組學(xué)研究結(jié)果，促進(jìn)了對運動發(fā)酵單胞菌在不同條件下中心代謝和細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡機制的理解。

除了基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組分析方法單獨使用外，多組學(xué)聯(lián)合分析也被越來越多地用于對運動發(fā)酵單胞菌的研究［25，107，113-114，116，119］，如比較基因組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)合研究運動發(fā)酵單胞菌中突變菌株優(yōu)異表型與基因型之間的關(guān)聯(lián)?；谛酒治龅谋容^基因組雜交技術(shù)（comparative genome hybridization，CGH）與轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了突變菌株AcR乙酸鈉耐受的表型，ZMO0117-ZMO0119之間的1.5kb 缺失導(dǎo)致了Na+/H+轉(zhuǎn)運蛋白（NhaA）過表達(dá)，進(jìn)而通過經(jīng)典遺傳學(xué)研究將乙酸鈉耐受菌株AcR的基因型與表型關(guān)聯(lián)，為工業(yè)菌株改造及突變基因型與表型的關(guān)聯(lián)提供了范例［57］，隨后這一研究思路被用于五碳糖進(jìn)化菌株以及耐酸進(jìn)化菌株的基因型變化研究［18，51，112］。轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組與代謝組等多層次組學(xué)技術(shù)聯(lián)用，解釋了Z.mobilisZM4 對6%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇脅迫反應(yīng)的分子機制［103］。

目前很多的運動發(fā)酵單胞菌研究工作都聯(lián)合使用了不同的組學(xué)技術(shù)，如聯(lián)合使用轉(zhuǎn)錄組與蛋白組鑒定條件特異性基因［107］，揭示Z.mobilisZM4抗多種抑制物的潛在生物標(biāo)志物［113］等。近期結(jié)合轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組等組學(xué)技術(shù)，以類異戊二烯為目標(biāo)產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)暴露在氧氣中會造成4-磷酸甲基赤蘚糖醇代謝途徑中鐵硫輔因子短暫的氧損傷，細(xì)胞通過代謝重構(gòu)將攝取的葡萄糖的18%轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸，并將產(chǎn)生的電子傳遞給電子傳遞鏈以降低氧化應(yīng)激損傷的影響［25］；相同的策略也被用于揭示運動發(fā)酵單胞菌對水解液中抑制物的多種響應(yīng)及影響木糖代謝的可能原因［116］。

除此之外，相關(guān)的表型分析與表型組研究也有報道。2010 年基于特制96 孔板與Biolog 系統(tǒng)的表型芯片分析技術(shù)在Z.mobilisZM4 中得到使用，檢測了ZM4 在2000 種不同條件下的表型，表明運動發(fā)酵單胞菌的生理特性與釀酒酵母更接近，而與通常的細(xì)菌偏離較大［11］。突變體庫適應(yīng)檢測技術(shù)與表型組學(xué)研究也得以開展，美國加州大學(xué)伯克利分校Arkin 課題組通過轉(zhuǎn)座子突變構(gòu)建了帶有DNA 編碼的運動發(fā)酵單胞菌突變體庫，通過后續(xù)的492 個不同實驗檢測確定了1586 個基因與水解液中的抑制物耐受相關(guān)，該結(jié)果表明89%的基因有明顯的表型［121］，為利用突變適應(yīng)度對不同菌株進(jìn)行功能注釋提供了藍(lán)圖［111］。另外一項研究則利用Tn10 轉(zhuǎn)座子突變體庫，分析了運動發(fā)酵單胞菌耐熱相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)耐熱性機制可能與乙醇耐受機制部分重疊，且發(fā)現(xiàn)運動發(fā)酵單胞菌的耐熱機制與E.coli和Arctocephalus tropicalis相似［122］。這些多組學(xué)數(shù)據(jù)以及表型相關(guān)的系統(tǒng)生物學(xué)數(shù)據(jù)聯(lián)合分析，有利于理解生物過程及相關(guān)機制，使系統(tǒng)分析運動發(fā)酵單胞菌在不同條件下關(guān)鍵基因及調(diào)控因子的表達(dá)成為可能，加快菌株代謝工程改造靶點的發(fā)現(xiàn)，便于對運動發(fā)酵單胞菌進(jìn)行再設(shè)計與改造，強化目標(biāo)產(chǎn)品生產(chǎn)，同時這些數(shù)據(jù)與技術(shù)方法也在合成生物學(xué)DBTL循環(huán)的多個環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

2.3 代謝模型的建立與完善

多種組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用和生理生化實驗的開展積累了大量生物學(xué)信息，將數(shù)據(jù)抽象化進(jìn)行數(shù)學(xué)建模是理性設(shè)計進(jìn)行代謝工程改造的基礎(chǔ)，可以用來預(yù)測和理解生物體對設(shè)計行為的響應(yīng)。代謝網(wǎng)絡(luò)模型的重建，尤其是基因組尺度的代謝網(wǎng)絡(luò)模型，可以快速實現(xiàn)生物體在不同條件下代謝的假設(shè)分析，探索新的科學(xué)發(fā)現(xiàn)，為設(shè)計改造細(xì)胞提供全新思路［123］。目前，在包括大腸桿菌和釀酒酵母等多種模式生物中，都建立了高質(zhì)量的基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型，得到了廣泛的應(yīng)用［123-125］。

迄今為止，運動發(fā)酵單胞菌已建立了5個基于不同約束方法和條件的中小型代謝模型和4個全基因組代謝網(wǎng)絡(luò)模型［126-134］。此外，還有一個整合胞外代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的全基因組代謝網(wǎng)絡(luò)模型在美國能源部KBase數(shù)據(jù)庫中完成，尚未公開發(fā)表。這些模型從不同角度對運動發(fā)酵單胞菌的相關(guān)生理特性進(jìn)行了模擬，有助于更好地理解運動發(fā)酵單胞菌的細(xì)胞代謝，為代謝工程改造靶點提供新的設(shè)計策略和指導(dǎo)（表3）。

Pinto 等［135］在2008 年首先提出了運動發(fā)酵單胞菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建與數(shù)據(jù)質(zhì)量及整合相關(guān)的問題和解決辦法，但沒有建立最終模型。隨后韓國高級科學(xué)技術(shù)研究院Lee Sang-Yup團隊［128］首次建立了運動發(fā)酵單胞菌基因組尺度的計量學(xué)代謝網(wǎng)絡(luò)模型ZmoMBEL601，模擬了多種碳源的利用，進(jìn)而通過基因敲除模擬，為有效生產(chǎn)琥珀酸提供了策略。之后又有研究者發(fā)表了兩個基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型iZM363和iEM439［126-127］，其中iEM439 為電荷平衡的模型，該模型通過動態(tài)通量平衡分析，提出能量與生長不耦聯(lián)主要是因為能量用于泵出質(zhì)子以維持pH［126］。韓國成均館大學(xué)Lee Dong-Yup團隊［136］基于基因組代謝網(wǎng)絡(luò)模型iZM411（基于iZM363 更新）分析發(fā)現(xiàn)，敲除pdc（pyruvate decarboxylase）、ldh（lactate dehydrogenase）和pfl（pyruvate formate lyase）基因編碼的丙酮酸消耗反應(yīng)以及cl（citrate lyase）基因可使琥珀酸的摩爾產(chǎn)量增加15 倍，但這些基因組規(guī)模的代謝網(wǎng)絡(luò)模型均無可計算的模型文件，不利于交流更新。最近，伊朗德黑蘭大學(xué)Marashi和Moghimi課題組［129］基于前期已發(fā)表的基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型和最新的注釋、文獻(xiàn)信息以及生理生化數(shù)據(jù)庫，重新建立了一個更新版的基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型iHN446，這一模型修正了已發(fā)表模型的錯誤，并提供了可計算的SBML 文件，為后期基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型的改進(jìn)奠定了基礎(chǔ)。

表3 運動發(fā)酵單胞菌不同尺度代謝模型Tab.3 Metabolic models at different scales established for Z.mobilis

除全基因組尺度的代謝網(wǎng)絡(luò)模型外，由于研究目的不同，在運動發(fā)酵單胞菌中還建立了多個不同的數(shù)學(xué)模型。美國科羅拉多大學(xué)博爾德分校Kompala 課題組［130］根據(jù)運動發(fā)酵單胞菌的酶動力學(xué)數(shù)據(jù)建立了一個小型的動力學(xué)模型，重點研究了戊糖磷酸途徑的異源酶與天然糖酵解途徑的相互作用，為運動發(fā)酵單胞菌最大化利用葡萄糖和木糖，同時最小化表達(dá)外源酶，生產(chǎn)乙醇提供了思路。希臘化學(xué)工程科學(xué)研究所Klapa 團隊［131］基于線性規(guī)劃（linear programming，LP）構(gòu)建了一個中小型計量學(xué)模型，根據(jù)其代謝網(wǎng)絡(luò)的化學(xué)計量連通性，利用LP 對各種生物目標(biāo)（包括能量最大化、乙醇和生物量生產(chǎn)率等代謝邊界）進(jìn)行了分析。

雖然這些模型可以指導(dǎo)實驗設(shè)計，但這些簡化的模型可能忽略了其他主要代謝途徑細(xì)節(jié)而導(dǎo)致不太準(zhǔn)確的預(yù)測。隨著大量的組學(xué)數(shù)據(jù)的積累及計算領(lǐng)域的發(fā)展，將轉(zhuǎn)錄組學(xué)等系統(tǒng)生物學(xué)數(shù)據(jù)整合到代謝網(wǎng)絡(luò)模型，構(gòu)建特定環(huán)境的基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型成為可能［137］。例如通過整合基因組和已發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，江南大學(xué)劉立明課題組［138］建立了光滑念珠菌（Candida glabrata）基因組規(guī)模的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，提高了光滑念珠菌的生長、代謝和基因表達(dá)對環(huán)境刺激調(diào)控行為的理解。蛋白組和代謝組等數(shù)據(jù)也可以被整合進(jìn)入代謝網(wǎng)絡(luò)模型，大腸桿菌最新的iML1515 模型全面整合了多種組學(xué)數(shù)據(jù)，為整合系統(tǒng)生物學(xué)數(shù)據(jù)建立高質(zhì)量代謝網(wǎng)絡(luò)模型提供了典范［124］。根據(jù)整合數(shù)據(jù)類型和優(yōu)化的問題等因素可選擇使用不同的算法，相關(guān)的數(shù)據(jù)整合方法可參考近期綜述文章［137］。

運動發(fā)酵單胞菌研究積累了大量的系統(tǒng)生物學(xué)數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)資源與代謝網(wǎng)絡(luò)模型的整合有助于建立高質(zhì)量的全基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型，幫助系統(tǒng)理解運動發(fā)酵單胞菌相關(guān)表型現(xiàn)象，為代謝工程與合成生物學(xué)理性設(shè)計奠定基礎(chǔ)［139］。在基因組代謝網(wǎng)絡(luò)模型中，生物量組成方程十分關(guān)鍵，反映了參與細(xì)胞生長和維持生命所需成分的必需物質(zhì)資源，一般由模擬細(xì)胞的實際物質(zhì)組成決定，通常包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和代謝所必需的小分子等［140］。通過通量平衡分析（flux balance analysis，F(xiàn)BA）方法模擬生長表型時，最常用的方法是使生物量目標(biāo)函數(shù)（biomass objective function，BOF）反應(yīng)通量最大化，以達(dá)到最好的模擬效果，而生物質(zhì)組成與藥物敏感性、營養(yǎng)需求和某一物種工業(yè)應(yīng)用的生物合成潛力密切相關(guān)，其組成在不同條件下有所不同，因此有必要在不同條件下適當(dāng)調(diào)整生物量組成方程，特別是有機物輔因子［141］。前期已發(fā)表的3 個運動發(fā)酵單胞菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型的生物量組成方程基本一致，但無法計算生成生物質(zhì)。最近更新的iHN446 模型雖然生物量組成一致，但基于代謝物連通性做了一些反應(yīng)更新，使得可以合成生物質(zhì)［129］。在后期整合更多不同條件下的系統(tǒng)生物學(xué)數(shù)據(jù)、對不同條件下的細(xì)胞表型進(jìn)行模擬時需要對生物量反應(yīng)方程做出相應(yīng)的調(diào)整，以提高整合系統(tǒng)生物學(xué)所建立新模型的準(zhǔn)確性。

3 運動發(fā)酵單胞菌底盤細(xì)胞構(gòu)建與合成生物學(xué)研究進(jìn)展

3.1 遺傳改造

在對運動發(fā)酵單胞菌進(jìn)行研究的過程中開發(fā)了多種基因組改造遺傳工具，可以分為隨機突變和理性設(shè)計兩類（圖3）。隨機突變改造屬于正向遺傳改造方法，通常包括物理誘變、化學(xué)誘變、轉(zhuǎn)座子突變（transposon mutagenesis）和ALE 等，誘變后通過篩選得到特定的突變體。希臘雅典大學(xué)Typas 課題組［142］1997 年首次發(fā)現(xiàn)自殺載體上的轉(zhuǎn)座因子可以用來突變運動發(fā)酵單胞菌染色體，進(jìn)而成功利用微型轉(zhuǎn)座子（mini Mu transposon）構(gòu)建了穩(wěn)定的運動發(fā)酵單胞菌營養(yǎng)缺陷型。隨后其他類型的轉(zhuǎn)座子Tn5、Tn10、Tn951和Tn1725以及插入元件ISZm1068［143］也相繼被開發(fā)應(yīng)用，相關(guān)進(jìn)展已被綜述［9-10］。

圖3 運動發(fā)酵單胞菌中使用的遺傳改造方法及代表性結(jié)果Fig.3 Genetic engineering methods developed in Z.mobilis and representative examples

亞硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）、咖啡因（caffeine）和甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate，EMS）等化學(xué)誘變劑在運動發(fā)酵單胞菌中廣泛應(yīng)用，如高乙酸耐受菌株AcR及具有絮凝性狀的菌株ZM401 即通過NTG 誘變篩選獲得［144-145］。物理誘變方法除了常用的紫外誘變（UV）外，最近一種新型的物理誘變方法ARTP被應(yīng)用于運動發(fā)酵單胞菌中，篩選出了可耐受pH 3.5的菌株P(guān)H1-29［51］。ARTP 介導(dǎo)的誘變具有快速、安全且更有效等優(yōu)點，是傳統(tǒng)誘變方法的有力替代。ALE 作為提高菌株生產(chǎn)性狀最有效的誘變方法之一，在運動發(fā)酵單胞菌中也被廣泛應(yīng)用，并且得到了大量耐受增強或魯棒性提高的菌株，例如印度理工學(xué)院Das課題組［31］通過ALE 篩選出目前葡萄糖與木糖共利用效果最好的菌株AD50，利用ALE 篩選優(yōu)良菌株的進(jìn)展可參閱近期綜述文章［9-10，60］。何明雄團隊［58］將基因組改組（genome shifting）技術(shù)用于運動發(fā)酵單胞菌，提高乙酸和糠醛耐受性，得到了可以耐受7 g/L乙酸和3 g/L糠醛的突變菌株。

理性設(shè)計是基于認(rèn)知或從系統(tǒng)生物學(xué)數(shù)據(jù)學(xué)習(xí)推測而來的結(jié)論，將候選生物元件、邏輯線路和代謝途徑轉(zhuǎn)入底盤宿主細(xì)胞或直接對底盤細(xì)胞進(jìn)行改造，通常會使用質(zhì)粒過表達(dá)或基因編輯等方法實現(xiàn)。使用質(zhì)粒載體進(jìn)行內(nèi)、外源基因的表達(dá)是最常使用且方便簡單的方法，在運動發(fā)酵單胞菌中有大量的成功案例，且相關(guān)質(zhì)粒構(gòu)建組裝方法如Gibson 組裝和BioBrick 組裝等也已經(jīng)在運動發(fā)酵單胞菌中建立［5］。此外，通過Golden Gate方法建立了“One-POT”多片段組裝方法，該方法將含有IIS 型限制內(nèi)切酶BbsI 識別和酶切序列的特異性接頭添加到啟動子Padh2、終止子Tpdc和綠色熒光蛋白基因gfp序列兩側(cè)，實現(xiàn)了綠色熒光蛋白表達(dá)的定向組裝并成功使綠色熒光蛋白得以表達(dá)，這一多DNA 片段無痕連接技術(shù)為在運動發(fā)酵單胞菌中多基因多途徑組裝奠定了技術(shù)基礎(chǔ)［146］。

同源重組是基因組編輯中基因插入失活或基因替換的常用方法，在運動發(fā)酵單胞菌中被用于構(gòu)建多株基因失活的菌株，如ndh失活菌株、sacC失活菌株和限制修飾（restriction and modification，R-M）系統(tǒng)失活菌株等［147-150］，同時研究人員使用FLP 重組酶［151］或SacB 篩選的方法［54］消除引入的抗性基因。最近，美國威斯康星大學(xué)麥迪遜分校Kiley 課題組［152］在運動發(fā)酵單胞菌中開發(fā)了基于同源重組和質(zhì)粒丟失的兩步無痕編輯技術(shù)，成功敲除了編碼乳酸脫氫酶基因（ldh）和纖維素合成酶操縱子（bcsABC），插入了鏈孢紅素操縱子，實現(xiàn)了無抗性基因菌株的構(gòu)建。

然而，這些方法步驟較為繁雜，時間周期長，而且編輯效率不高。CRISPR-Cas 技術(shù)作為近年發(fā)展起來的高效快捷基因編輯技術(shù)，已被開發(fā)作為運動發(fā)酵單胞菌基因編輯的方法之一。2017 年四川大學(xué)譚雪梅課題組［153］將CRISPR-Cas9 引入運動發(fā)酵單胞菌，利用從化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenesCICC 10464）中克隆的Cas9 基因，構(gòu)建了pSUZM2a-Cas9 質(zhì)粒，結(jié)合T7 啟動子帶動表達(dá)的單鏈RNA，消除了運動發(fā)酵單胞菌中的內(nèi)源質(zhì)粒。近期利用鏈霉菌（Francisella novicida）中的Cas12a（Cpf1）蛋白在Z.mobilisZM4 中構(gòu)建了可誘導(dǎo)表達(dá)Cas12a 的重組菌株，可以完成RNA 引導(dǎo)的雙鏈DNA 在靶位點的斷裂切割，從而建立了一種高效方便的基因組編輯工具，利用該方法做到了內(nèi)源質(zhì)粒消除、基因敲除、基因插入和單堿基替換，該工具還用于代謝工程，在ZM4 中建立了乳酸生物合成途徑［154］。

基于外源編輯酶的CRISPR-Cas 系統(tǒng)對宿主菌株具有一定的毒性，開發(fā)內(nèi)源CRISPR-Cas 編輯系統(tǒng)是解決這一問題的有效方法。我們最近表征了Z.mobilisZM4 中內(nèi)源I-F 型CRISPR-Cas 系統(tǒng)，建立了一種有效的基于I-F 型CRISPR-Cas 內(nèi)源基因組編輯方法，實現(xiàn)了包括基因刪除和替換（效率為100%）、原位修飾（100%）、大片段刪除（>10kb）及同時進(jìn)行多個基因編輯（18.75%）等多種基因組改造［155］，提高了運動發(fā)酵單胞菌基因編輯改造效率，為合成生物學(xué)底盤細(xì)胞的構(gòu)建提供了有力的技術(shù)支撐，也為其他物種內(nèi)源CRISPRCas編輯系統(tǒng)的建立提供了范例［156］。

運用CRISPR-Cas 技術(shù)進(jìn)行基因編輯后，編輯質(zhì)粒的快速消除成為一個限制多輪基因編輯的瓶頸。傳統(tǒng)上常用的編輯質(zhì)粒消除方法是基于編輯質(zhì)粒的非必需性或毒性，在無抗性培養(yǎng)基中連續(xù)傳代，最終得到基因編輯后編輯質(zhì)粒消除的菌株，但這一方法操作煩瑣、效率低且耗時長，制約了CRISPR-Cas基因組編輯的高效、快速和連續(xù)應(yīng)用。為了解決以上問題，不同的編輯質(zhì)粒消除方法也在不斷嘗試完善，策略之一是將編輯質(zhì)粒的復(fù)制子替換為溫敏復(fù)制子，通過溫度升高抑制溫敏復(fù)制子的復(fù)制來消除編輯質(zhì)粒［157］。通過運用邏輯線路來誘導(dǎo)控制編輯質(zhì)粒gRNA表達(dá)，也是實現(xiàn)編輯質(zhì)粒消除的可行策略，并在其他菌株中得到了應(yīng)用［158］，但目前的誘導(dǎo)型啟動子系統(tǒng)具有不同程度的滲漏，通過突變篩選更加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼T導(dǎo)型啟動子或?qū)ふ倚碌恼T導(dǎo)型啟動子［159］，以及建立結(jié)合轉(zhuǎn)錄與翻譯多層次調(diào)控的邏輯線路［160］，可能是實現(xiàn)編輯質(zhì)粒快速消除的更有效策略。

3.2 多種穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建與應(yīng)用

作為基因工程改造的工具，質(zhì)粒載體應(yīng)用改變了分子生物學(xué)的發(fā)展，通過使用質(zhì)粒將DNA 運輸傳遞到宿主細(xì)胞中，使外源基因直接在質(zhì)粒上表達(dá)或通過同源重組整合到宿主基因組，促進(jìn)了代謝工程和合成生物學(xué)的發(fā)展［161］。質(zhì)粒分為廣泛宿主質(zhì)粒和穿梭質(zhì)粒兩大類，在運動發(fā)酵單胞菌的研究中，已經(jīng)構(gòu)建并不斷改進(jìn)優(yōu)化了多種可以在運動發(fā)酵單胞菌中使用的穿梭質(zhì)粒，推動了運動發(fā)酵單胞菌研究的開展。

穿梭質(zhì)粒構(gòu)建最關(guān)鍵的兩點是具有在大腸桿菌和運動發(fā)酵單胞菌中復(fù)制的復(fù)制子以及合適的篩選標(biāo)記。穿梭質(zhì)粒通常在大腸桿菌中構(gòu)建和擴增，因此經(jīng)典質(zhì)粒的復(fù)制子常被采用，例如pUC系列及pBR 系列質(zhì)粒的復(fù)制子［162-163］。運動發(fā)酵單胞菌中復(fù)制子的尋找一直是研究重點，常用的是對各菌株染色體復(fù)制子或內(nèi)源質(zhì)粒復(fù)制子的克隆和嘗試，例如pSUZM1、pSUZM2和pSUZM3質(zhì)粒的構(gòu)建就分別采用了Z.mobilisZM4 菌株染色體和兩個內(nèi)源質(zhì)粒上的復(fù)制子［163］。運動發(fā)酵單胞菌中可用的篩選標(biāo)記主要分為兩大類：抗性篩選和營養(yǎng)缺陷型篩選。由于運動發(fā)酵單胞菌對一些常用抗生素的耐受性較高，目前采用的抗生素有壯觀霉素（Spe）、四環(huán)素（Tc）、氯霉素（Cm）與卡那霉素（Km），其中Km 需要在高于200 mg/L 濃度下使用［164-165］。營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記篩選的代表是ZM4的泛酸營養(yǎng)缺陷型，由于缺乏編碼天冬氨酸脫羧酶的單一基因panD，使得該營養(yǎng)缺陷型菌株必須在添加有β-丙氨酸的培養(yǎng)基中或者異源表達(dá)panD基因的情況下才可以正常生長，這一營養(yǎng)缺陷型的發(fā)現(xiàn)有助于在運動發(fā)酵單胞菌中通過營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記篩選突變菌株［166］。

目前應(yīng)用于運動發(fā)酵單胞菌的質(zhì)粒主要有兩類來源：一種是將來源于大腸桿菌和運動發(fā)酵單胞菌的質(zhì)粒進(jìn)行整合，得到一個可以同時在大腸桿菌和運動發(fā)酵單胞菌復(fù)制的穿梭質(zhì)粒，這樣的質(zhì)?？梢栽谶@兩種宿主中存在并繁殖［167-168］，但是這類質(zhì)粒往往因為骨架太大，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率不高，在早期研究中使用偏多［169］；另一種是基于革蘭氏陰性細(xì)菌的宿主廣泛性質(zhì)粒［33，136，170-172］，這類質(zhì)粒含有在革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)均可以識別的復(fù)制子及mob基因，可以采用接合轉(zhuǎn)化法將其轉(zhuǎn)化至運動發(fā)酵單胞菌中［57，152］，如常用的pBBR1MCS-2 質(zhì)粒。近年來，根據(jù)不同研究目的，在運動發(fā)酵單胞菌中構(gòu)建了一系列穿梭質(zhì)粒。隨著對質(zhì)粒及抗性基因研究的深入，質(zhì)粒越來越小，例如目前廣泛使用的pEZ15Asp合成穿梭質(zhì)粒，其骨架大小僅為3 kb，含有在大腸桿菌和運動發(fā)酵單胞菌復(fù)制的復(fù)制子，壯觀霉素抗性篩選基因以及BioBrick酶切位點［76］，方便了遺傳操作與代謝途徑構(gòu)建［21，105，162，173-179］。

3.3 影響轉(zhuǎn)化效率的因素及轉(zhuǎn)化效率的提高

高效遺傳轉(zhuǎn)化方法在基因工程改造與基因組精簡改造中起著不可或缺的作用，研究人員在運動發(fā)酵單胞菌中建立了多種遺傳轉(zhuǎn)化方法，常用的是接合轉(zhuǎn)移法和電轉(zhuǎn)化法［5，180］。早在20 世紀(jì)80 年代，研究人員就開發(fā)了可以在運動發(fā)酵單胞菌中使用的接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化法，但是該方法費時且轉(zhuǎn)化效率有菌株特異性［180-181］。2011 年上海交通大學(xué)鐘建江課題組［182］設(shè)計了一種新型載體pHW20a，將接合轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)化效率提高了兩個數(shù)量級，且較之前用于接合轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒載體具有更好的穩(wěn)定性及操作性。隨著電轉(zhuǎn)化技術(shù)在其他菌株中的應(yīng)用，研究人員也在運動發(fā)酵單胞菌中建立了簡單方便的電轉(zhuǎn)化方法，其轉(zhuǎn)化效率在103CFU/μg量級［183］。

低轉(zhuǎn)化效率不利于重組轉(zhuǎn)化子的獲得及相關(guān)突變體文庫的構(gòu)建，澳大利亞新南威爾士大學(xué)Rogers課題組［184］曾嘗試改變電轉(zhuǎn)電壓等電轉(zhuǎn)參數(shù)及電轉(zhuǎn)后的復(fù)蘇培養(yǎng)基與復(fù)蘇時間以提高轉(zhuǎn)化效率，但未獲成功。影響轉(zhuǎn)化效率的因素是多樣的，不同遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的轉(zhuǎn)化效率不同，同一技術(shù)（如電轉(zhuǎn)化法）不同參數(shù)的選擇、感受態(tài)細(xì)胞制備的質(zhì)量（如細(xì)胞收集時期、制備方法和最終細(xì)胞濃度等）以及轉(zhuǎn)化后復(fù)蘇培養(yǎng)基的選擇等都會帶來轉(zhuǎn)化效率的差異。山東大學(xué)張友明課題組［185］使用室溫方法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化效率比在冰上制備的感受態(tài)細(xì)胞高出10 倍，這一方法也在蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）中得到驗證［186］，說明該方法值得在包括運動發(fā)酵單胞菌在內(nèi)的其他菌株中進(jìn)行嘗試。此外，細(xì)胞的物理屏障如細(xì)胞壁或特殊的膜結(jié)構(gòu)也可能妨礙電轉(zhuǎn)化效率，如在制作感受態(tài)細(xì)胞時使用溶菌酶處理阪崎腸桿菌（Cronobacter sakazakii）可以提高其電轉(zhuǎn)化效率［187］。運動發(fā)酵單胞菌特殊的細(xì)胞膜組分中高含量藿烷在提高其對外界環(huán)境耐受的同時，或許是影響其轉(zhuǎn)化效率的一個因素，在未來的研究中可以作為研究方向?qū)ふ肄D(zhuǎn)化效率的突破，如在制備感受態(tài)細(xì)胞時嘗試降低藿烷成分等。

限制修飾R-M 系統(tǒng)可以保護(hù)細(xì)菌免于外來DNA 的入侵，即可以破壞外來DNA 在體內(nèi)的存留［188］。對R-M 系統(tǒng)的破壞，特別是核酸內(nèi)切酶基因的缺失，使得外源DNA 進(jìn)入細(xì)胞后不會由于核酸內(nèi)切酶的識別而被大量的切割而降解，從而可以改變細(xì)菌對外源DNA 的攝取能力。運動發(fā)酵單胞菌前期研究表明，對R-M 系統(tǒng)相應(yīng)基因進(jìn)行敲除會影響質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化率［149-150］。進(jìn)一步研究表明，轉(zhuǎn)化效率受到R-M 系統(tǒng)的影響，不僅僅是轉(zhuǎn)化方法與過程等轉(zhuǎn)化條件參數(shù)。為了防止質(zhì)粒受到宿主R-M 系統(tǒng)的限制，Rogers 課題組［170］在Z.mobilisZM4 的轉(zhuǎn)化過程中使用I 型限制酶抑制劑，發(fā)現(xiàn)可以小幅度提高轉(zhuǎn)化效率，但其轉(zhuǎn)化效率仍處于103CFU/μg 量級。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)將運動發(fā)酵單胞菌中IV 型R-M 系統(tǒng)編碼甲基轉(zhuǎn)移酶和限制性內(nèi)切酶的基因mrr（ZMO0028）失活，可使甲基化質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化效率提高60 倍，且不影響生長率和生物量；而使R-M 系統(tǒng)I 型負(fù)責(zé)識別未甲基化或錯誤甲基化DNA 的S 亞基編碼基因ZMO1933失活，可使非甲基化質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化效率提高30 倍，但會影響細(xì)胞生長［150］。何明雄團隊［149］的研究結(jié)果表明，在突變株Zmmrr和Zm1933中，甲基化穿梭質(zhì)粒pBBR1MCS-tet 的電轉(zhuǎn)化率分別提高了17 倍和2 倍。白鳳武課題組［54］在ZM4 與絮凝菌株ZM401 中實現(xiàn)了ZMO0028和ZMO1933的雙敲除，使得甲基化和非甲基化質(zhì)粒pHW20a 的電轉(zhuǎn)化效率均大幅提升，且雙敲除菌株的生長與乙醇生成以及ZM401 的絮凝性能未受影響。

這些研究結(jié)果之間可能因為使用的質(zhì)粒大小與濃度不同存在一些差異，但可以確定的是運動發(fā)酵單胞菌中R-M 系統(tǒng)會影響甲基化與非甲基化外源質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化效率，可以通過控制內(nèi)源R-M 系統(tǒng)或者外源DNA 甲基化狀態(tài)提高轉(zhuǎn)化率。另外值得一提的是，我們在研究Z.mobilisZM4 內(nèi)源CRISPR-Cas 系統(tǒng)的過程中發(fā)現(xiàn)，用pEZ15Asp 載體轉(zhuǎn)化ZMO0028基因敲除菌株ΔZMO0028時，轉(zhuǎn)化效率為野生型菌株的90 倍，同時在ΔZMO0028的背景下所有基因組編輯操作的效率都得到了顯著提高，單基因敲除的編輯效率均達(dá)到100%（16/16），而大于10 kb 片段敲除的編輯效率從12.5%（2/16）提高到50%（8/16），表明R-M 系統(tǒng)可能不僅影響外源DNA 的轉(zhuǎn)化效率，而且影響CRISPR-Cas 技術(shù)相關(guān)的編輯效率［155］。

3.4 生物元件的預(yù)測與鑒定

在合成生物學(xué)的“設(shè)計”和“構(gòu)建”環(huán)節(jié)中，編碼和非編碼區(qū)域的模塊化生物元件信息是生物系統(tǒng)設(shè)計的重要基礎(chǔ)。在運動發(fā)酵單胞菌中，前期通過經(jīng)典的分子生物學(xué)方法研究確定了一些啟動子［180］?；蚪M序列的發(fā)表以及大量系統(tǒng)生物學(xué)數(shù)據(jù)的積累為生物功能與調(diào)控元件的挖掘及鑒定奠定了基礎(chǔ)［5，60］。sRNA 作為一種反式作用元件，在基因表達(dá)的多個過程中發(fā)揮作用，如細(xì)胞在氧化應(yīng)激、乙醇、溫度或pH 變化等脅迫條件下調(diào)節(jié)多種代謝途徑［189］。美國得克薩斯大學(xué)奧斯汀分校Contreras 課題組［110］通過sRNA 轉(zhuǎn)錄組學(xué)及計算機預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)了運動發(fā)酵單胞菌15 個新的sRNA，并且通過實驗研究表明其中Zms2、Zms6和Zms18 與調(diào)節(jié)應(yīng)對乙醇脅迫相關(guān)。該課題組［190］也通過高通量測序技術(shù)探索sRNA 可能的作用機制，結(jié)合已有轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，開發(fā)了運動發(fā)酵單胞菌REFINE（RNA-seq examiner for phenotype-informed network engineering）系統(tǒng)，為理解sRNA與其他生物元件之間的關(guān)系與作用機制及其在代謝工程實踐中的應(yīng)用提供了有效工具。

轉(zhuǎn)錄本內(nèi)的5'UTR 可以在各種生物體中參與mRNA 表達(dá)水平的調(diào)控，以應(yīng)對各種代謝物或環(huán)境條件變化，例如sRNA 會與目標(biāo)基因的5'UTR相作用，調(diào)控下游基因的表達(dá)［191］。Contreras 團隊與作者課題組合作，利用生物信息學(xué)手段對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了運動發(fā)酵單胞菌中36 個5'UTR 可能與乙醇、乙酸或木糖脅迫相關(guān)，其中UTR_ZMO0347 被證明可調(diào)控其下游基因hfq的表達(dá)，使其在乙醇脅迫條件下的表達(dá)下調(diào)［192］，這一結(jié)果為研究運動發(fā)酵單胞菌在脅迫環(huán)境下細(xì)胞響應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了新的思路。進(jìn)一步研究揭示了運動發(fā)酵單胞菌中sRNA-sRNA 及sRNAprotein 之間相互作用的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，解析了兩個影響乙醇生成sRNA（Zms4 和Zms6）的共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［117］。該研究在運動發(fā)酵單胞菌中首次揭示了sRNA 作用網(wǎng)絡(luò)，通過一組不同的mRNA 靶點和大量的sRNA 協(xié)同，調(diào)控多個參與乙醇代謝相關(guān)的通路。

最近，基于系統(tǒng)生物學(xué)數(shù)據(jù)及雙熒光報告基因系統(tǒng)對運動單胞菌進(jìn)行生物元件預(yù)測、篩選與鑒定的策略得以建立。通過流式細(xì)胞儀檢測包括EGFP、mCherry和RFP等5 種報告基因的熒光強度，建立了基于流式細(xì)胞術(shù)的雙熒光報告基因系統(tǒng)：該系統(tǒng)含有EGFP和opmCherry兩個報告基因，其中EGFP用以表征待測的調(diào)控元件，opmCherry作為內(nèi)參以消除內(nèi)外噪聲；利用該系統(tǒng)進(jìn)一步表征了基于系統(tǒng)生物學(xué)數(shù)據(jù)預(yù)測和生物信息學(xué)方法分析預(yù)測的38 個啟動子和4 個核糖體結(jié)合位點（ribosome binding site，RBS）的強度，實驗結(jié)果與系統(tǒng)生物學(xué)預(yù)測的相關(guān)性較高［21］。與早期著眼于重要功能基因啟動子的研究［193］不同的是，基于系統(tǒng)生物學(xué)數(shù)據(jù)可以預(yù)測篩選不同強度的啟動子，供不同的需要使用。這一研究為利用系統(tǒng)生物學(xué)數(shù)據(jù)篩選潛在調(diào)控元件以及使用雙熒光報告基因系統(tǒng)定量鑒定調(diào)控元件提供了新的策略與方法，我們利用這一策略篩選鑒定了3個內(nèi)源乙醇誘導(dǎo)性啟動子［159］。此外，雙熒光報告基因系統(tǒng)還被用于表征sRNA 與靶基因5'UTR 之間的相互作用［117］。

美國威斯康星大學(xué)麥迪遜分校Landick 課題組［194］近期利用RNA-Seq、TSS-Seq、Term-Seq與Ribo-Seq 等多組學(xué)技術(shù)系統(tǒng)鑒定了運動發(fā)酵單胞菌轉(zhuǎn)錄起始位點和轉(zhuǎn)錄終止位點，并分析確定了運動發(fā)酵單胞菌中σA啟動子?10 和?35 區(qū)域的保守序列為TANNNN 和TTGNNN。與大腸桿菌的?10 區(qū)域保守序列相比，運動發(fā)酵單胞菌的?10 區(qū)域缺少在大腸桿菌中的T-7位點，這與新月柄桿菌（Caulobacter crescentus）相似，說明大腸桿菌?10 區(qū)域的T-7位點不具有普遍性。這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)研究結(jié)果可結(jié)合雙熒光報告基因系統(tǒng)，定量化鑒定運動發(fā)酵單胞菌非編碼區(qū)域的相關(guān)生物調(diào)控元件與邏輯線路，增加可用于合成生物學(xué)研究的生物元件與邏輯線路的種類與數(shù)量，推動運動發(fā)酵單胞菌在合成生物學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展。

4 運動發(fā)酵單胞菌底盤細(xì)胞構(gòu)建展望

4.1 底盤細(xì)胞構(gòu)建

運動發(fā)酵單胞菌具有基因組小、遺傳操作工具基本完備、安全性高、環(huán)境脅迫耐受性強及副產(chǎn)物低等特點，已作為底盤細(xì)胞用于開發(fā)包括纖維素乙醇在內(nèi)的多種平臺化合物的生產(chǎn)（圖1，表1）。碳、氮作為地球生物化學(xué)循環(huán)的重要組成部分，也與地球的能源與環(huán)境相關(guān)，利用生物進(jìn)行碳、氮的固定具有重要意義。

運動發(fā)酵單胞菌具有完整的Mo 固氮酶系統(tǒng)，可以利用氮氣為唯一氮源生長并發(fā)酵生產(chǎn)乙醇［12-13］。天然生物固氮過程受到復(fù)雜的調(diào)控作用，并且進(jìn)化出了獨特的氧保護(hù)機制，雖然目前關(guān)于固氮的合成生物學(xué)有了一定的進(jìn)展，但還屬于理論探索階段［195］。我們在開發(fā)運動發(fā)酵單胞菌內(nèi)源I-F 型CRISPR-Cas 系統(tǒng)時成功敲除了固氮基因簇中的10kb 基因組片段（ZMO1815-ZMO1822），敲除菌株生長未受到明顯影響［155］。美國威斯康星大學(xué)麥迪遜分校Amador-Noguez 課題組［115］提出了運動發(fā)酵單胞菌可能的固氮調(diào)控機制，為固氮調(diào)控的研究奠定了理論基礎(chǔ)。利用運動發(fā)酵單胞菌基因組小及遺傳操作系統(tǒng)成熟等優(yōu)勢，將其作為底盤細(xì)胞推進(jìn)固氮系統(tǒng)中氧保護(hù)機制、固氮基因簇簡化、固氮相關(guān)催化元件和調(diào)控元件的挖掘與鑒定等固氮合成生物學(xué)的研究，是未來值得拓展的研究方向之一。

在運動發(fā)酵單胞菌能夠固氮的前提下，引入外源的固碳途徑，將有可能實現(xiàn)氮氣和二氧化碳的共同利用，利用合成生物學(xué)的手段創(chuàng)造出一種目前自然界尚不多見的可同時固定碳、氮的微生物。過去50 年，人類活動使大氣中CO2的濃度從300 μL/L 以下上升到了413 μL/L，預(yù)計到2045 年會上升至500 μL/L［196］。CO2濃度的不斷升高，將使全球溫度上升，導(dǎo)致冰山和積雪的融化，從而引起海平面的上升，嚴(yán)重影響全球氣候和環(huán)境。利用生物固定CO2進(jìn)行生物能源的生產(chǎn)或綠色生物制造，有利于降低大氣中CO2濃度及由此帶來的各種不利影響。最近以色列魏茨曼科學(xué)研究院的Milo 研究團隊［197］通過外源引入卡爾文循環(huán)中的Rubisco 酶同時共表達(dá)磷酸核酮糖激酶（phosphoribulokinase，Prk）對大腸桿菌進(jìn)行改造，并通過實驗室進(jìn)化使其可以利用CO2為唯一碳源。藍(lán)藻中固碳羧化體相關(guān)基因及蛋白結(jié)構(gòu)的確定，使其得以在大腸桿菌中實現(xiàn)人工合成，也為固定二氧化碳提供了另一種思路［198-200］。北京化工大學(xué)譚天偉教授課題組［201］提出了基于CO2為底物，進(jìn)行第三代生物煉制的綠色生物制造概念，系統(tǒng)分析了目前生物CO2固定途徑和細(xì)胞能源供應(yīng)新模式的兩大關(guān)鍵問題，為細(xì)胞工廠工程化改造提出了前瞻性的指導(dǎo)意見。

運動發(fā)酵單胞菌本身擁有完整的固氮基因簇，利用內(nèi)、外源CRISPR-Cas 基因編輯技術(shù)以及雙熒光報告基因生物元件鑒定系統(tǒng)等研究工具將運動發(fā)酵單胞菌作為底盤細(xì)胞進(jìn)行改造，使其利用二氧化碳和氮氣生產(chǎn)目標(biāo)化合物有很大的潛力（圖4）。需要指出的是，碳、氮的固定都是高耗能的生物過程，而運動發(fā)酵單胞菌的氧化磷酸化產(chǎn)能效率較低，在此過程中，能量的供應(yīng)將是一個具有挑戰(zhàn)性的難點。

圖4 運動發(fā)酵單胞菌底盤細(xì)胞構(gòu)建展望Fig.4 Perspectives on developing Z.mobilis as a chassis cell

4.2 CRISPR-Cas技術(shù)的發(fā)展

CRISPR-Cas 技術(shù)可以快速實現(xiàn)基因組的編輯，是目前廣泛使用的高效基因組編輯技術(shù)。2017 年美國科羅拉多大學(xué)博爾德分校Gill 課題組［202］開發(fā)了CREATE（CRISPR-enabled trackable genome engineering）技術(shù)，可實現(xiàn)對基因組上多基因和多位點的同時編輯，且便于追溯和追蹤基因型與表型的關(guān)系，進(jìn)一步提升了編輯效率。天津大學(xué)王智文課題組［203］將CREATE 技術(shù)用于編輯改造大腸桿菌全局調(diào)控因子，并與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)合研究大腸桿菌的耐藥性。這些研究展現(xiàn)了CRISPR-Cas 技術(shù)多基因同時編輯的能力，但由于CRISPR-Cas 技術(shù)可編輯位點受到PAM 位點的限制，制約了基因組編輯位點的選擇。近期報道的兩種人工改造的Cas 酶（SpG 和SpRY）中的SpRY幾乎可以不受PAM 位點序列限制進(jìn)行編輯，這一突破極大擴展了CRISPR-Cas 系統(tǒng)的編輯能力，同時也為其他類型CRISPR-Cas 系統(tǒng)的改造提供了良好的思路［204］。利用編碼在轉(zhuǎn)座子中的CRISPR-Cas系統(tǒng)，研究人員實現(xiàn)了高效特異的DNA 片段插入，為利用CRISPR-Cas 技術(shù)的基因插入操作提供了又一高效解決方案［205-206］。

基于CRISPR-Cas 開發(fā)的多種CRISPRi/a 基因沉默或激活方法也被廣泛使用。湖北大學(xué)張桂敏課題組［207］在枯草芽孢桿菌中建立了dCas9-α/ω 系統(tǒng)，通過設(shè)計位點特異性gRNA可實現(xiàn)同時激活和抑制不同基因的表達(dá)，展現(xiàn)了CRISPR-Cas 技術(shù)多基因、多方向和多維度同時精準(zhǔn)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的強大能力，為其在其他物種中的擴展應(yīng)用提供了借鑒。除了作為基因表達(dá)調(diào)控的工具，CRISPRCas 還可以用來進(jìn)行基因組尺度的基因型鑒定［208］。清華大學(xué)邢新會和張翀課題組［209］建立了基于CRISPRi的全基因組高通量基因功能研究技術(shù)，該技術(shù)通過建立全基因組gRNA文庫，高效研究包括轉(zhuǎn)錄非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）在內(nèi)全基因組所有基因的功能。Arkin 課題組［210］最近發(fā)表的預(yù)印本研究表明，通過構(gòu)建一個緊湊和全面的CRISPRi 文庫（約33 000 個sgRNA），可覆蓋基因組的所有元件，包括蛋白編碼基因、ncRNA、啟動子和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點等。天津大學(xué)宋浩課題組［211］最新發(fā)表的預(yù)印本將CRISPRi與組學(xué)分析相結(jié)合，確定在多個細(xì)胞過程中起作用的潛在目標(biāo)基因，提升E.coli中脂肪酸的產(chǎn)量，對得到的56 個有益基因進(jìn)行組合改造，使得脂肪酸最終發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到21.6 g/L，為目前E.coli重組菌株中最高。

這些基于CRISPR-Cas 發(fā)展起來的技術(shù)方法，與系統(tǒng)生物學(xué)或高通量檢測等其他技術(shù)結(jié)合后，如CREATE 與轉(zhuǎn)錄組學(xué)的結(jié)合［203］，會進(jìn)一步釋放其強大的功能，是將來菌株改造的發(fā)展方向。目前運動發(fā)酵單胞菌中的內(nèi)、外源CRISPR-Cas 技術(shù)均已建立［153-155］，尤其是內(nèi)源系統(tǒng)的建立會減少外源編輯酶對細(xì)胞的毒性，實現(xiàn)快速的基因編輯，目前已有少量相關(guān)研究開展［156］。但是，內(nèi)源系統(tǒng)較為復(fù)雜，發(fā)揮作用時需要多個相關(guān)蛋白的輔助作用，可能會影響基于內(nèi)源系統(tǒng)的CRISPRa/i或單堿基編輯工具的開發(fā)，所以應(yīng)借鑒以上優(yōu)秀應(yīng)用實例，同時利用內(nèi)源和外源CRISPR-Cas 體系開發(fā)完善運動發(fā)酵單胞菌基因編輯工具，為CRISPR-Cas 技術(shù)在運動發(fā)酵單胞菌中的進(jìn)一步應(yīng)用提供可能。

4.3 高效篩選平臺的建立與應(yīng)用

合成生物學(xué)細(xì)胞工廠設(shè)計研究過程中會有大量中間突變體產(chǎn)生，快速高效分選到理想菌株十分關(guān)鍵。傳統(tǒng)篩選方法往往以目標(biāo)代謝物為主，通量低、效率低、費時、費力且昂貴。高通量或自動化篩選平臺與檢測技術(shù)的建立，可以顯著提升工作效率，減少人為誤差，提高準(zhǔn)確性。目前，已在運動發(fā)酵單胞菌中建立了基于Bioscreen C 的微量生長檢測系統(tǒng)，可同時鑒定200種不同條件對菌株生長的影響［212］；基于Biolog 表型芯片技術(shù)可快速進(jìn)行表型鑒定，一次最多可同時進(jìn)行48 塊96孔板的鑒定［11］。此外，基于微流控的微生物液滴培養(yǎng)儀（microbial microdroplet culture system，MMC）全自動傳代篩選技術(shù)也在運動發(fā)酵單胞菌中建立，可用于改造后優(yōu)勢菌株的快速自動化進(jìn)化篩選［213］。

除了基于細(xì)胞生長等表型進(jìn)行篩選的技術(shù)外，近年來，基于生物傳感的高通量篩選技術(shù)也被廣泛開發(fā)利用，美國伊利諾伊大學(xué)厄巴納-香檳分校趙惠民課題組［214］利用關(guān)鍵代謝物水平轉(zhuǎn)換為熒光信號的遺傳傳感器，應(yīng)用釀酒酵母中的丙二酰輔酶A 傳感器FapR 及其相應(yīng)的操縱子fapO，監(jiān)測活細(xì)胞內(nèi)丙二酰輔酶A 的水平，為酵母的高通量遺傳篩選提供了有效的工具。江南大學(xué)李江華和張娟課題組［215］利用赤蘚糖醇反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子EryD，在解脂耶氏酵母構(gòu)建了能夠在動態(tài)范圍特異性響應(yīng)的傳感器-調(diào)節(jié)器系統(tǒng)，用于快速篩選和鑒定突變體文庫，構(gòu)建了基于生物傳感的赤蘚糖醇高通量篩選方法。上海交通大學(xué)馮雁和楊廣宇課題組［216］利用細(xì)胞膜表面半乳糖透酶（LacY）對底物及糖基化產(chǎn)物通透性的差異建立了首個針對巖藻糖基化酶的單細(xì)胞超高通量篩選技術(shù)平臺。這些基于生物傳感器的高通量篩選方法是目前在運動發(fā)酵單胞菌中所缺乏的，相關(guān)方法的建立可廣泛用于運動發(fā)酵單胞菌突變體和遺傳文庫的篩選、微生物生理學(xué)研究、發(fā)酵條件優(yōu)化和系統(tǒng)生物學(xué)研究，加快生物元件、邏輯線路、代謝途徑及細(xì)胞工廠性能的檢測鑒定。

單細(xì)胞精度的快速分選也是高通量篩選平臺的重要構(gòu)成［217］?；诹魇郊?xì)胞術(shù)的熒光激活細(xì)胞分選（fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS）技術(shù)在微生物代謝工程中應(yīng)用較多，但由于技術(shù)限制，利用FACS 進(jìn)行細(xì)胞分選的結(jié)果尚存在較高的背景噪聲，尤其是應(yīng)用于細(xì)胞大小為10 μm 以下的原核細(xì)胞時，無法高效實現(xiàn)高精度的單細(xì)胞分選，往往需要在分選后再次通過孔板或平板篩選。另外，F(xiàn)ACS 技術(shù)只能根據(jù)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞表面的熒光信號進(jìn)行分選，不能根據(jù)胞外物質(zhì)進(jìn)行分選?；谖⒘骺丶夹g(shù)的熒光激活液滴分選系統(tǒng)（fluorescence activated droplet sorting system，F(xiàn)ADS）則可以根據(jù)胞外分泌物進(jìn)行分選，并方便與其他檢測技術(shù)整合［218］。

中國科學(xué)院青島生物能源與過程所徐健團隊通過耦合單細(xì)胞拉曼光譜和液滴微流控技術(shù)，開發(fā)了拉曼激活單細(xì)胞液滴分選技術(shù)（Ramanactivated single-cell droplet sorting，RADS），該技術(shù)能夠在在無標(biāo)記、無損傷的前提下進(jìn)行單細(xì)胞精度的分選。以生產(chǎn)蝦青素的雨生紅球藻為研究對象，篩選通量可以達(dá)260 個細(xì)胞/min，分選準(zhǔn)確率高達(dá)98.3%，且分選出來的細(xì)胞92.7%能夠正常分裂增殖［219］。近期，該團隊基于自主研發(fā)的介電單細(xì)胞捕獲/釋放的拉曼激活液滴分選技術(shù)pDEPRADS研制了高通量流式拉曼分選儀FlowRACS，可以實現(xiàn)基于分子光譜、非標(biāo)記式、單細(xì)胞精度、高通量流式的酶活篩選［220］。該團隊近期還開發(fā)了一種高覆蓋度的單細(xì)胞拉曼分選測序技術(shù)（Ramanactivated gravity-driven single-cell encapsulation and sequencing，RAGE-Seq），可實現(xiàn)對單個細(xì)菌細(xì)胞的分選與測序，覆蓋度>95%，意味著可以將單個細(xì)菌細(xì)胞的高覆蓋度基因與代謝表型直接關(guān)聯(lián)，為細(xì)菌單細(xì)胞水平的基因型與表型的關(guān)聯(lián)提供了技術(shù)支持［221］。另一個值得關(guān)注的是使用光激活細(xì)胞成像和分類技術(shù)的伯克利之光（Berkeley Lights‘Beacon’）。細(xì)胞在該系統(tǒng)中被隔離培養(yǎng)在體積為皮升的納米流體設(shè)備“筆”上用于生長和分析，每個芯片包含多達(dá)14 000 支“筆”，其中容納了許多單細(xì)胞或菌落，通過熒光定量產(chǎn)物及標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，該技術(shù)可以在納米流體設(shè)備上對單細(xì)胞進(jìn)行克隆分離、細(xì)胞選擇和適當(dāng)?shù)募?xì)胞編輯等操作［222］。

包括運動發(fā)酵單胞菌在內(nèi)的原核生物，對單細(xì)胞精度分選的要求更高，以上這些高通量自動化技術(shù)的擴展應(yīng)用，特別是單細(xì)胞精度的細(xì)胞分選及基于生物傳感的高通量篩選在運動發(fā)酵單胞菌中的應(yīng)用，將大大提升運動發(fā)酵單胞菌候選菌株的分離篩選效率，推動運動發(fā)酵單胞菌高效篩選平臺的建立以及在單細(xì)胞水平的研究。

4.4 精準(zhǔn)代謝調(diào)控的建立

原核生物中有多種精細(xì)調(diào)控機制，保證其對環(huán)境良好的適應(yīng)性，包括基因水平、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯水平和翻譯后水平調(diào)控等。在傳統(tǒng)的代謝工程應(yīng)用中，以使用啟動子在轉(zhuǎn)錄水平和RBS 在翻譯水平的調(diào)控居多，即使用特定強度的啟動子或RBS 對特定的基因進(jìn)行調(diào)控。最近，研究人員提出了在翻譯層面新的調(diào)控機制。江南大學(xué)陳堅課題組［223］通過改變基因N 端編碼序列的45 bp 堿基以調(diào)控基因的翻譯起始效率，應(yīng)用于N-乙酰神經(jīng)氨酸（N-acetyl-neuraminic acid，NeuAc）的合成調(diào)控，成功將NeuAc 的產(chǎn)量提高了3.21 倍。中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所張學(xué)禮團隊［224］首次提出了一種利用起始密碼子組合調(diào)控（combinatorial modulation of initial codons，CMIC）的新策略，在翻譯層面調(diào)節(jié)優(yōu)化代謝途徑，將其應(yīng)用于大腸桿菌中玉米黃素合成途徑的3 個基因crtZ、crtY和crtI，得到一株玉米黃素產(chǎn)量為出發(fā)菌株10倍的重組菌株，CMIC策略只需改變3 bp的序列，將縮小庫容量，從而減小工作量和縮短實驗時間。

以上這類代謝調(diào)控一般稱為靜態(tài)調(diào)控，即無需感知細(xì)胞內(nèi)外的環(huán)境，直接使用組成型元件對調(diào)控基因進(jìn)行過表達(dá)或抑制，甚至還可以直接敲除，但這一過程可能會造成胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)環(huán)境的破壞，且無法對細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的改變作出即時的響應(yīng)，因此研究人員開發(fā)了動態(tài)調(diào)控策略，即通過感應(yīng)相關(guān)信號分子，如外界誘導(dǎo)信號或體內(nèi)代謝物水平，以動態(tài)調(diào)節(jié)代謝通路中基因的表達(dá)水平［225］，如大腸桿菌中被深入研究的多種誘導(dǎo)型啟動子系統(tǒng)，包括乳糖操縱子、色氨酸操縱子以及來源于λ噬菌體的T7轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)和PLPR-Clts857 溫敏啟動子系統(tǒng)等［226］。這類系統(tǒng)在發(fā)酵工業(yè)中得到很好的應(yīng)用，例如內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院曹志軍課題組［227］將PLPR-Clts857 溫敏型啟動子系統(tǒng)用于兩步法發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸，發(fā)酵前期在40 ℃下使溫敏開關(guān)啟動noxE基因的表達(dá)，以消耗NADH 促進(jìn)生物量和丙酮酸的積累，而后在34 ℃關(guān)閉開關(guān)抑制細(xì)胞生長，提高了丙酮酸的產(chǎn)量，最終使丙酮酸的產(chǎn)量達(dá)到了93.0 g/L。

除了高溫誘導(dǎo)調(diào)控外，近期清華大學(xué)陳國強課題組和中國科學(xué)院微生物所婁春波團隊合作開發(fā)了冷誘導(dǎo)型開關(guān)系統(tǒng)，該系統(tǒng)使用一種熱失活的蛋白酶和一種冷失活的TEV 敏感轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄和翻譯后兩個水平調(diào)控基因的表達(dá)，且為了提高系統(tǒng)的嚴(yán)謹(jǐn)性，研究者還向系統(tǒng)引入了一個額外的蛋白水解模塊，以專門降解殘留蛋白或由于泄漏表達(dá)的蛋白，該工作建立了一個高性能的冷誘導(dǎo)系統(tǒng)，用于嚴(yán)格和快速控制基因表達(dá)，使表達(dá)熱不穩(wěn)定重組蛋白成為可能，同時該系統(tǒng)在基礎(chǔ)研究、工業(yè)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面也具有巨大的潛力［160］。基于CRISPR-Cas 的可誘導(dǎo)控制的基因編輯、激活與干擾系統(tǒng)也被實現(xiàn)［211，228-229］，如通過使用誘導(dǎo)型啟動子控制dCas9的表達(dá)或光誘導(dǎo)控制gRNA 的活性［230］，為動態(tài)控制基因?qū)崿F(xiàn)時空調(diào)控提供了又一強有力的工具。最近，研究人員利用光敏核苷酸替換了部分gRNA序列，通過光來實現(xiàn)對DNA 序列的切割，從而實現(xiàn)基因編輯在時間和空間上的調(diào)控，該技術(shù)被稱為cfCRISPR，為靶標(biāo)DNA精準(zhǔn)切割的時空調(diào)控提供了參考［231］。

除了人工誘導(dǎo)動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)外，細(xì)胞自主誘導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)也被逐漸開發(fā)應(yīng)用。日本金澤大學(xué)Tsuge 課題組［232］在谷氨酸棒桿菌中開發(fā)了一個利用厭氧特異性啟動子調(diào)節(jié)碳代謝流的系統(tǒng)，使用乳酸脫氫酶基因（ldhA）的厭氧特異性啟動子替換葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因（pgi）的啟動子，實現(xiàn)了在有氧條件下碳流重定向到PPP 途徑生成大量NADPH 供1，5-戊二胺（1，5-diaminopentane）生產(chǎn)使用的氧響應(yīng)開關(guān)，使1，5-戊二胺的產(chǎn)量、收率、生產(chǎn)速率分別提高了4.6 倍、4.4 倍和2.6 倍，在有氧生長后pgi會自動在厭氧條件下被誘導(dǎo)，使碳流轉(zhuǎn)向糖酵解途徑，繼續(xù)生產(chǎn)琥珀酸，這一方法使通過單一菌株兩步發(fā)酵分階段生產(chǎn)不同化合物成為可能，降低了生產(chǎn)成本。中山大學(xué)劉建忠課題組［233］在大腸桿菌中使用群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）系統(tǒng)動態(tài)調(diào)控4-羥基苯乙酸（4-hydroxyphenylacetic acid，4HPAA）代謝途徑，使4HPAA產(chǎn)量達(dá)到17.39 g/L±0.26 g/L。

在運動發(fā)酵單胞菌中關(guān)于靜態(tài)調(diào)控相關(guān)的研究和使用相對較多，如常用的強啟動子Pgap、Ppdc、Peno和PadhB等，通常用于過表達(dá)目的基因，以調(diào)控目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量或提高對抑制物的耐受性［5，60］。Contreras 教授與作者課題組合作在解析sRNA 和5'UTR 的調(diào)控方面開展了相關(guān)研究［110，117，190，192］，并于最近提出了sRNA-sRNA 及sRNA-protein 之間相互作用的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［117］。關(guān)于運動發(fā)酵單胞菌動態(tài)調(diào)控方面的研究目前尚少，成功應(yīng)用的有四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動子Ptet，該誘導(dǎo)型啟動子首次在運動發(fā)酵單胞菌中應(yīng)用于調(diào)控2，3-丁二醇的生產(chǎn)［76］，隨后也被用于雙熒光報告基因的構(gòu)建［21］和異丁醇生產(chǎn)途徑的調(diào)控［63］。最近，Landick課題組［234］報道了使用lacIq基因和PT7A1-O34啟動子在運動發(fā)酵單胞菌中實現(xiàn)了對發(fā)酵代謝途徑中的關(guān)鍵酶丙酮酸脫羧酶（Pdc）基因的誘導(dǎo)控制，達(dá)到了對運動發(fā)酵單胞菌碳流控制的目的。

在運動發(fā)酵單胞菌中建立精準(zhǔn)的代謝調(diào)控，將有利于更好地在時間和空間上調(diào)控相關(guān)代謝途徑，發(fā)揮其所擁有的優(yōu)勢性能。基于組學(xué)數(shù)據(jù)篩選與雙熒光報告基因系統(tǒng)鑒定的策略［21］，篩選鑒定了運動發(fā)酵單胞菌中內(nèi)源乙醇誘導(dǎo)型啟動子，但對其具體誘導(dǎo)機制及應(yīng)用還需進(jìn)一步研究［159］。在其他菌株中開展的相關(guān)研究及進(jìn)展，為填補運動發(fā)胞單胞菌在這一領(lǐng)域的不足提供了研究思路，是未來值得投入的研究方向。

總之，運動發(fā)酵單胞菌具有安全、環(huán)境適應(yīng)性強、糖及乙醇耐受性高、可在厭氧條件下通過ED 途徑進(jìn)行乙醇發(fā)酵、糖代謝速率快及乙醇收率高等優(yōu)點，已經(jīng)在生物能源、平臺化合物、食品和藥品等不同工業(yè)領(lǐng)域取得了一系列成果。同時，運動發(fā)酵單胞菌基因組小，具有一系列包括內(nèi)、外源CRISPR-Cas 基因編輯系統(tǒng)在內(nèi)的遺傳工具及系統(tǒng)與合成生物學(xué)研究方法，積累了大量的生理、生化及系統(tǒng)生物學(xué)數(shù)據(jù)，有望發(fā)展為一個高效的工業(yè)底盤細(xì)胞，尤其是基于丙酮酸為前體物質(zhì)生產(chǎn)多種平臺化合物的高效細(xì)胞工廠。但是，我們?nèi)孕柙谀壳把芯枯^少的基因時空表達(dá)網(wǎng)絡(luò)與動態(tài)調(diào)控機制等基礎(chǔ)理論研究以及高通量基因編輯與自動化篩選技術(shù)等方面取得更大突破；進(jìn)一步理解制約遺傳轉(zhuǎn)化效率的分子機制，建立提高轉(zhuǎn)化效率的方法策略；揭示影響基因組編輯效率的因素，建立可循環(huán)開展對基因組多位點同時編輯的高效CRISPR-Cas 基因編輯體系及單堿基編輯方法；結(jié)合生物信息學(xué)及機器學(xué)習(xí)等方法從多組學(xué)數(shù)據(jù)中挖掘生物元件，優(yōu)化包括雙報告基因系統(tǒng)在內(nèi)的生物元件定量檢測體系，豐富生物催化與調(diào)控元件庫；建立生物元件、邏輯線路、代謝途徑高通量組裝與性能檢測方法；整合運動發(fā)酵單胞菌生理、生化及多組學(xué)數(shù)據(jù)，建立數(shù)字細(xì)胞模型，指導(dǎo)包含防泄漏生物安全體系在內(nèi)的安全、高效細(xì)胞工廠的理性設(shè)計及應(yīng)用。