王桂娟

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種常見的破壞性和危及生命的疾病，其特征在于大動脈中纖維元素和脂質(zhì)的積累［1］。血管平滑肌細胞（Vascular smooth muscle cell，VSMC）是構(gòu)成動脈血管壁的主要細胞成分，調(diào)控增殖、遷移和凋亡等異常細胞功能促進AS 的形成和發(fā)展［2］。然而，VSMC 對AS 影響的詳細分子機制仍不清楚。研究表明，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）通過調(diào)控血管生成影響AS斑塊的形成和發(fā)展［3］。微小RNA（microRNA，miRNA）是長度為18～24 個核苷酸的非編碼RNA分子，通過與靶基因的3'非翻譯區(qū)（3'untranslated regions，3'UTR）結(jié)合來抑制翻譯或誘導mRNA 切割。最近，許多研究表明miRNA 通過調(diào)控VSMC的增殖、遷移、表型轉(zhuǎn)換和體內(nèi)血管重塑等參與AS 的進展［4］。miR-20a 屬于miR-17-92 簇，在多種惡性腫瘤中發(fā)揮作用，包括結(jié)腸癌、前列腺癌、胃癌和肺癌等［5］。然而，迄今為止，miR-20a 在VSMC中的生物學功能尚未明確闡明。本研究探究miR-20a 對VSMC 活性和遷移及VEGF 表達的影響以及可能的機制，以期為AS 的治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 細胞系和主要試劑

人主動脈血管平滑肌細胞系T/G HAVSMC（美國ATCC）；SmGM-2 培養(yǎng)基（瑞士龍沙集團有限公司）；胎牛血清、胰蛋白酶（賽默飛世爾科技公司）；RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；除抗體外Western blot 檢測所需試劑（上海碧云天生物技術(shù)研究所）；miR-20a mimics 及mimics NC（上海吉瑪制藥有限公司）；脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen 公司）；Real-time PCR Kit檢測試劑盒（上海研卉生物科技有限公司）；CCK-8試劑盒（日本同仁化學研究所）；Transwell 下室（美國BD 公司）；VEGF、CNN1 抗體（美國NEB 公司）；辣根過氧化酶標記的二抗（美國CST 公司）；熒光素酶報告基因檢測試劑盒（美國Promega 公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)

人血管平滑肌細胞培養(yǎng)在含5%滅活胎牛血清的SmGM-2 培養(yǎng)液中，置于體積分數(shù)5%CO2、37℃、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞生長融合度達90%以上時以胰蛋白酶消化傳代，指數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 細胞分組和轉(zhuǎn)染

將對數(shù)生長期的VSMC 分為空白對照（Con）組、陰性對照（miR-NC）組和轉(zhuǎn)染（miR-20a）組共3組。VSMC 接種到24 孔板中，于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，待細胞生長匯合度達50%時，將脂質(zhì)體2000與miR-20a mimics 或mimics NC 以2.5∶1 的比例混合，并加入到24 孔板的細胞中，轉(zhuǎn)染miR-20a mimics 的VSMC 記為miR-20a 組，轉(zhuǎn)染mimics NC 的VSMC 記為miR-NC 組，未做轉(zhuǎn)染處理的VSMC 記為Con 組。各組細胞在37℃培養(yǎng)箱孵育6 h 后更換為5%胎牛血清的SmGM-2 培養(yǎng)液。

1.4 Real-time 檢測

收集轉(zhuǎn)染48 h 后3 組VSMC，RNA 提取試劑盒分別提取總RNA，并將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用Real-time PCR Kit 檢測試劑盒進行Real-time PCR。miR-20a 正向引物5′-CACCTCGAGCCTGCTATTTCCTTCAA-3′，反向引物 5′-GAG AATTCAGTAACAGGACAGTTTG-3′。VEGF 正向引物5′-ATCTTCAAGCCGTCCTGTGTGC-3'，反向引物5′-CAAGGCTCACAGTGAACGCT-3′。CNN1 正向引物5′-AAGGGCGGAACATCATTGGGCT-3′，反向引物5′-CTCGAAGATCTGCCGCTTGGT-3′。反應(yīng)結(jié)束后讀取Ct 值，采用相對定量2-△△Ct法計算目的基因相對表達量。

1.5 Western blot 檢測細胞中PCNA 和Ki-67 蛋白表達水平

使用RIPA 裂解緩沖液分別從3 組VSMC 中提取蛋白質(zhì)，并通過12%十二烷基硫酸鈉聚-丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride membranes，PVDF）上。在37℃下用5%脫脂牛奶封閉2 小時，將膜與一抗孵育過夜：VEGF（1∶1 000 稀釋），CNN1（1∶800 稀釋）。隨后將膜與1∶2 000 稀釋的相應(yīng)二抗室溫孵育2 h。以GAPDH 的蛋白質(zhì)水平作上樣對照，使用ECL 試劑盒顯影，獲取各蛋白條帶，采用Image J 軟件分析各組VSMC 中VEGF 和CNN1 蛋白相對表達量。

1.6 CCK-8 法檢測

對數(shù)期的VSMC 以8×103個/孔接種到96 孔板中，按照上述1.3 法轉(zhuǎn)染和分組，分別在轉(zhuǎn)染0、24、48、72 h 時向每孔細胞加入10 μL CCK-8 溶液，37℃孵育2 h，使用酶標儀測定490 nm 波長處吸光度值（OD 值）。

1.7 Transwell 實驗

三組VSMC 以胰酶消化，制成單細胞懸液，取100 μL 細胞懸液接種到Transwell 小室的上室，在下室中添加含10%胎牛血清的SmGM-2 培養(yǎng)液，放置在37℃培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)48 h。采用多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下觀察穿膜細胞，隨機選取5 個視野技術(shù)穿膜細胞數(shù)。

1.8 熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

通過生物信息學在線軟件TargetScan 等預測結(jié)果顯示miR-20a 與CNN1 mRNA 3′-UTR 存在靶向結(jié)合位點。根據(jù)預測結(jié)果將CNN1 3′-UTR 及突變結(jié)合位點分別插入到psiCHECK-2 熒光素酶載體上（該部分由上海生工生物工程有限公司完成），分別記為CNN1-Wt 和CNN1-Mut 熒光素酶重組載體。將miR-20a mimics 或mimics NC 與重組載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至VSMC，48 h 后使用熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定螢火蟲和海腎熒光素酶活性，以螢火蟲熒光素酶活性作為內(nèi)部對照計算細胞相對熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料均以（±s）表示，多組間差異比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組VSMC 中miR-20a 的表達量比較

與miR-NC 組（0.96±0.09）相比，miR-20a 組（3.16±0.32）VSMC 中miR-20a 的相對表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而Con 組（1.00±0.10）中miR-20a 的相對表達量無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 各組VSMC 中VEGF 表達量比較

Western blot 檢測結(jié)果：與miR-NC 組相比，miR-20a 組VSMC 中VEGF mRNA 和蛋白相對表達量均明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而Con 組中VEGF 的表達無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1，表1。

圖1 Western blot 檢測3 組VSMC 中VEGF 蛋白表達Figure 1 Western blot detection of VEGF protein expression in 3 groups of VSMC

表1 3 組VSMC 中VEGF mRNA 和蛋白相對表達量比較（±s）Table 1 Comparison of the relative expression of VEGF mRNA and protein in the 3 groups of VSMC（±s）

表1 3 組VSMC 中VEGF mRNA 和蛋白相對表達量比較（±s）Table 1 Comparison of the relative expression of VEGF mRNA and protein in the 3 groups of VSMC（±s）

組別Con miR-NC miR-20a F 值P 值VEGF mRNA 1.00±0.11 0.98±0.10 2.64±0.25 289.660 0.000 VEGF 蛋白0.26±0.03 0.25±0.03 0.67±0.07 231.448 0.000

2.3 各組VSMC 活性比較

與miR-NC 組相比，miR-20a 組VSMC 活性在轉(zhuǎn)染24、48、72 h 時均明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而Con 組中VSMC 活性無明顯改變，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 3 組VSMC 在不同時間點OD 值（λ=490 nm）比較（±s）Table 2 Comparison of OD values（λ=490 nm）of 3 groups of VSMC at different time points（±s）

表2 3 組VSMC 在不同時間點OD 值（λ=490 nm）比較（±s）Table 2 Comparison of OD values（λ=490 nm）of 3 groups of VSMC at different time points（±s）

組別Con miR-NC miR-20 F 值P 值0 h 0.20±0.02 0.18±0.02 0.20±0.02 3.000 0.069 24 h 0.44±0.04 0.42±0.04 0.52±0.05 13.263 0.000 48 h 0.61±0.06 0.59±0.06 0.74±0.07 14.802 0.000 72 h 0.79±0.08 0.78±0.08 0.96±0.09 13.220 0.000

2.4 各組VSMC 遷移能力比較

與miR-NC 組相比，miR-20a 組VSMC 穿膜細胞數(shù)明顯增多（P＜0.05），而Con 組中VSMC 穿膜細胞數(shù)無明顯改變（P＞0.05）。見表3。

表3 3 組VSMC 穿膜細胞數(shù)比較（±s）Table 3 Comparison of the number of VSMC penetrating cells in the 3 groups（±s）

表3 3 組VSMC 穿膜細胞數(shù)比較（±s）Table 3 Comparison of the number of VSMC penetrating cells in the 3 groups（±s）

組別Con miR-NC miR-20a F 值P 值遷移細胞數(shù)62.04±6.10 59.25±6.24 113.36±10.58 133.251 0.000

2.5 miR-20a 對CNN1 的靶向關(guān)系驗證

Western blot 檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖2A），與miR-NC組相比，miR-20a 組VSMC 中CNN1 mRNA 和蛋白表達明顯下調(diào)（P＜0.05），而Con 組中CNN1 的表達無明顯變化（P＞0.05）。生物信息學軟件分析結(jié)果顯示（圖2B），CNN1 的3′UTR 與miR-20a 存在互補結(jié)合堿基位點。熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示（圖2C），miR-20a mimics 能夠顯著抑制CNN1-Wt 細胞的相對熒光素酶活性（P＜0.05），而對CNN1-Mut 細胞的相對熒光素酶活性無明顯抑制作用（P＞0.05）。

圖2 miR-20a 靶向調(diào)控CNN1Figure 2 miR-20a targets and regulates CNN1

3 討論

AS 是由于脂肪、血栓、碳酸鈣和結(jié)締組織在血管沉積導致的一種慢性動脈疾病，也是全世界死亡率和發(fā)病率的主要原因。目前關(guān)于AS 治療策略包括藥物治療、外科手術(shù)和綜合治療，但未能取得良好的治療效果［6］。因此迫切需要探究AS 的發(fā)病機制，對開發(fā)新的有效的AS 治療手段具有十分重要的意義。AS 的發(fā)病機制極其復雜，近年來隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)VSMC 的增殖和遷移涉及AS 進展的所有階段［7］。VEGF 是一類特殊的細胞因子，廣泛存在于心、腦、肝等組織和細胞中，在維持VSMC 結(jié)構(gòu)和功能上均具有重要作用［8］。VEGF可通過調(diào)控血管生成，導致VSMC 異常增生，最終誘發(fā)AS 的形成和發(fā)展。近年來已經(jīng)描述了miRNA 在控制VSMC 增殖和遷移中的調(diào)節(jié)作用［9］。此外，越來越多的證據(jù)表明miRNA 與VSMC的功能密切相關(guān)［10-11］。據(jù)報道，異常的miRNA 表達與動脈粥樣硬化的發(fā)展有關(guān)［12］。miRNA 在調(diào)節(jié)VSMC 中的作用有助于了解動脈粥樣硬化的分子機制，為AS 的診斷和治療策略提供新的作用靶點。

miR-20a 位于chr13orf25 內(nèi)含子的染色體13q31 上，miR-20a 的表達失調(diào)參與多種癌癥的發(fā)展。Fan 等人通過微陣列數(shù)據(jù)分析表明在增殖的VSMC 中miR-20a 異常高表達，推測miR-20a 可能與VSMC 活性有關(guān)［13］。一項研究顯示，miR-20a 在調(diào)節(jié)卵巢癌OVCAR3 細胞的順鉑耐藥和通過激活EMT 促進細胞遷移中具有重要作用［14］。miR-20a在肝癌組織和細胞系中均低表達，恢復其表達可抑制肝癌HepG2 細胞的增殖、遷移和侵襲［15］。以上這些數(shù)據(jù)提示miR-20a 可調(diào)控細胞的遷移能力。本實驗與以上研究類似。Deng 等人研究發(fā)現(xiàn)，VEGF 可通過激活Akt 和Erk 信號通過刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞中miR-31 和miR-20a 的表達［16］。在本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達miR-20a 的VSMC 中VEGF mRNA 和蛋白表達均明顯升高。以上實驗數(shù)據(jù)提示過表達miR-20a 可能通過上調(diào)VEGF 的表達及VSMC 的活性和遷移能力參與AS 的發(fā)展。CNN1 在多種惡性腫瘤中呈低表達，是一種廣譜腫瘤診斷標記物。本實驗通過生物信息學軟件預測發(fā)現(xiàn)，CNN1 可能是miR-20a 一個直接靶基因，熒光素酶報告基因測定證實miR-20a 直接結(jié)合VEGF-A mRNA 的3′-UTR。且Real-time PCR 和Western blot 檢測結(jié)果表明過表達miR-20a 可顯著抑制CNN1 的表達。本實驗結(jié)果提示miR-20a 可能通過靶向調(diào)控CNN1 影響VSMC 活性和遷移以及VEGF 的表達。

總之，本實驗結(jié)果顯示過表達miR-20a 可促進VEGF 的表達及VSMC 活性和遷移，其作用機制可能與miR-20a 靶向負調(diào)控CNN1 的表達有關(guān)。本研究提供了對AS 發(fā)展中miR-20a 功能的進一步理解，為開發(fā)新的AS 治療手段提供一定的實驗基礎(chǔ)。