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        越冬期間水體氨氮對紅螯螯蝦生理功能的影響研究

        2021-03-17 05:29:38韋永春遲美麗賈永義劉士力鄭建波顧志敏
        科學(xué)養(yǎng)魚 2021年2期
        關(guān)鍵詞:親蝦高濃度越冬

        程 順,韋永春,李 飛,遲美麗,賈永義,劉士力,鄭建波,顧志敏

        (浙江省淡水水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 湖州 313001)

        紅螯螯蝦又名澳洲淡水龍蝦,比普通蝦生長速度快、規(guī)格大、出肉率高,且膽固醇含量僅為普通蝦的70%,是一個具有較高增養(yǎng)殖潛力且深受消費(fèi)者青睞的品種。在21 世紀(jì)初,浙江省淡水水產(chǎn)研究所從澳大利亞引進(jìn)紅螯螯蝦,并進(jìn)行了親蝦培育、人工越冬等一系列研究,為室內(nèi)規(guī)?;绶N繁育的開展打下了基礎(chǔ)。但目前蝦苗批量化供應(yīng)能力的不足及蝦苗價格過高等瓶頸阻礙著紅螯螯蝦市場的擴(kuò)大,造成這一現(xiàn)狀的原因之一是紅螯螯蝦親蝦在室內(nèi)越冬過程中進(jìn)行室內(nèi)小水體培育,環(huán)境的變化極易影響水質(zhì)指標(biāo),進(jìn)而造成親蝦體質(zhì)的下降及生長與繁殖的受限。

        在紅螯螯蝦親蝦室內(nèi)越冬過程中,水體中的氨氮主要由殘餌、蝦體排泄物等含氮有機(jī)物分解產(chǎn)生,是主要的脅迫因子之一。目前大部分的研究關(guān)注氨氮急性脅迫下蝦的成活率,可是在實(shí)際生產(chǎn)中一般氨氮不會達(dá)到致死的濃度,而低于致死濃度的氨氮也會對蝦的生長與存活產(chǎn)生影響,這是由于機(jī)體在受到氨氮連續(xù)刺激且超過機(jī)體調(diào)節(jié)閾值時,其抗氧化系統(tǒng)遭到破壞、組織結(jié)構(gòu)發(fā)生病變所致。因此,必須在探討氨氮致死濃度的同時,分析氨氮對組織器官的損傷及對抗氧化指標(biāo)、免疫相關(guān)指標(biāo)、能量代謝指標(biāo)的影響,以便更好地指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)中的水質(zhì)管理,改善親本在越冬期間的生長狀況。

        一般紅螯螯蝦親蝦從外塘移入溫室初期,氨氮會達(dá)到0.4 毫克/升左右,需要經(jīng)過一段時間才能穩(wěn)定在0.2 毫克/升以下。因此,本試驗(yàn)在確定氨氮脅迫下螯蝦96 小時半致死濃度和安全濃度后,分別設(shè)置空白對照、低濃度、中濃度和高濃度氨氮試驗(yàn)組,同時結(jié)合組織切片、酶活性檢測方法分析肝胰腺結(jié)構(gòu)以及相關(guān)抗氧化指標(biāo)、免疫相關(guān)指標(biāo)、能量代謝指標(biāo)變化,從組織和生理生化水平探討氨氮脅迫對紅螯螯蝦的影響,旨在為紅螯螯蝦親蝦越冬及生態(tài)養(yǎng)殖過程中的水質(zhì)管理提供科學(xué)依據(jù)。

        一、材料與方法

        1.試驗(yàn)材料

        試驗(yàn)用蝦均采自浙江省淡水水產(chǎn)研究所綜合試驗(yàn)基地,選取越冬期間體色正常、健康活潑、規(guī)格相近的紅螯螯蝦親蝦。

        2.試驗(yàn)方法

        采用常規(guī)生物急性毒性試驗(yàn)法,研究0~200毫克/升氨氮濃度對紅螯螯蝦親蝦的急性毒性,得到24~96 小時的死亡率,并通過概率單位法計算半致死濃度以及安全濃度。然后結(jié)合紅螯螯蝦親蝦越冬的生產(chǎn)實(shí)際,分別設(shè)置對照組(0 毫克/升)和低濃度(0.4 毫克/升)、中濃度(1.0 毫克/升)、高濃度(2.0 毫克/升)3 個試驗(yàn)組,每組設(shè)置3個平行。用分析純氯化銨試劑配制試驗(yàn)組總氨氮濃度。挑選紅螯螯蝦親蝦隨機(jī)移入水槽中。試驗(yàn)期間停止投餌,并每隔12 小時進(jìn)行換水及總氨氮濃度監(jiān)測,使總氨氮濃度穩(wěn)定,水溫為(22±1)℃,24小時連續(xù)微充氣以保證溶氧充足。

        氨氮脅迫96 小時后采集樣品。每次從各組水槽中隨機(jī)取螯蝦的肝胰腺并保存于波恩氏液及液氮中。波恩氏液保存的樣品常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)橫切,切片厚度為6微米,HE染色,顯微鏡觀察并拍照。液氮保存的樣品之后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存。按每克待測樣組織加入9毫升生理鹽水的比例配制組織勻漿,研磨后轉(zhuǎn)移至離心管中,4℃下以3 000 轉(zhuǎn)/分離心10 分鐘,取上清液分裝后放入4℃冰箱暫存,用于測定抗氧化指標(biāo)如超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、免疫相關(guān)指標(biāo)如酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)活性,測定能量代謝指標(biāo)如甘油三酯(TG)水平。酶活指標(biāo)均采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。

        3.數(shù)據(jù)處理

        試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用Excel、SPSS進(jìn)行處理,統(tǒng)計結(jié)果以平均值與標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示。

        二、結(jié)果

        1.氨氮脅迫急性毒性試驗(yàn)

        采用常規(guī)生物急性毒性試驗(yàn)法研究氨氮對紅螯螯蝦96 小時的半致死濃度以及安全濃度,結(jié)果顯示紅螯螯蝦的死亡率隨氨氮濃度及脅迫時間的增加而增加。同時,通過SPSS 的概率單位法計算得到氨氮對紅螯螯蝦96 小時的半致死濃度為56.84毫克/升,安全濃度(SC)為5.68毫克/升。

        此外,筆者發(fā)現(xiàn)在氨氮高于50毫克/升的條件下,死亡前的紅螯螯蝦首先是活力減弱,有時身體向后上方急退,然后失去平衡,四肢無力,最后側(cè)臥于水底,隨即死亡。

        2.氨氮脅迫對肝胰腺組織學(xué)的影響

        組織切片觀察發(fā)現(xiàn),對照組上皮細(xì)胞無斷裂,排列整齊,分支管狀腺之間的結(jié)締組織較多而互相聯(lián)系;低濃度組(0.4 毫克/升)與對照組形態(tài)一致,也未出現(xiàn)形態(tài)學(xué)的改變;中濃度組(1.0 毫克/升)的肝小管排列開始混亂,各肝小管大小出現(xiàn)差異,肝小管間距離變大,但總體上變化不明顯;高濃度組(2.0 毫克/升)肝小管的整體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變化,即肝小管排列混亂,各肝小管大小出現(xiàn)差異,基膜變得不整齊,肝小管間的結(jié)締組織減少,細(xì)胞出現(xiàn)裂解,產(chǎn)生空泡化。總體上,在96 小時內(nèi),隨著氨氮質(zhì)量濃度的增加,紅螯螯蝦肝胰腺內(nèi)的肝小管排列趨于混亂,大小出現(xiàn)差異,肝小管間的結(jié)締組織也隨之減少,細(xì)胞出現(xiàn)裂解,產(chǎn)生空泡化,在高濃度組(2.0 毫克/升)中的變化相對明顯。因此,中濃度氨氮(1.0毫克/升)對蝦的肝胰腺造成了輕微損傷,高濃度氨氮(2.0毫克/升)對蝦的肝胰腺造成了較大的損傷。

        3.氨氮脅迫對肝胰腺內(nèi)酶活力的影響

        酶活檢測結(jié)果表明,在氨氮為0~2.0毫克/升范圍內(nèi),抗氧化指標(biāo)SOD 活性為33.77~38.08 單位/毫克,且隨氨氮質(zhì)量濃度的升高而降低,其中氨氮為1.0~2.0 毫克/升組的SOD 值顯著低于氨氮為0 毫克/升的對照組(P<0.05);而MDA 則相反,為1.73~2.20單位/毫克,且隨氨氮質(zhì)量濃度的升高而升高,其中高濃度氨氮組(2.0毫克/升)的MDA值顯著高于其他3 組(P<0.05)(表1)。在氨氮為0~2.0 毫克/升范圍內(nèi),免疫相關(guān)指標(biāo)ACP 值為84.89~119.16 單 位/毫 克 、 AKP 值 為 25.87~80.17 單位/毫克,且均隨氨氮質(zhì)量濃度的升高而降低,4個氨氮組的ACP、AKP值均呈顯著差異(P<0.05),高濃度氨氮組(2.0 毫克/升)的值最低(表2)。在氨氮為0~2毫克/升范圍內(nèi),能量代謝指標(biāo)TG值為0.16~0.23毫摩/克,且隨氨氮質(zhì)量濃度的升高而降低,但4 個氨氮組的TG 值無顯著差異(P>0.05)(表3)。除MDA 外,總體上抗氧化能力、免疫相關(guān)指標(biāo)及能量代謝相關(guān)指標(biāo)均隨氨氮質(zhì)量濃度的升高而降低,高濃度氨氮組(2.0 毫克/升)的抗氧化能力、免疫相關(guān)指標(biāo)及能量代謝相關(guān)指標(biāo)最低。中濃度氨氮組(1.0 毫克/升)及高濃度氨氮組(2.0 毫克/升)的 SOD 值、ACP 值、AKP 值顯著低于對照組(0毫克/升)(P<0.05),高濃度氨氮組(2.0 毫克/升)的 MDA 值、ACP 值、AKP 值顯著低于其他3組(P<0.05)。

        表1 抗氧化指標(biāo)檢測情況

        表2 免疫相關(guān)指標(biāo)檢測情況

        表3 能量代謝指標(biāo)檢測

        三、分析與討論

        紅螯螯蝦對氨氮有較強(qiáng)的耐受力,其96 小時半致死濃度為56.84 毫克/升,安全濃度為5.68 毫克/升。這要高于對蝦類及沼蝦類,與克氏原螯蝦接近,說明紅螯螯蝦有在水質(zhì)條件較差的環(huán)境中生存的能力。可是在紅螯螯蝦親蝦越冬過程中,氨氮的異常升高仍是一個重要的脅迫因子,因?yàn)楫?dāng)氨氮達(dá)到一定質(zhì)量濃度時,紅螯螯蝦雖然不會死亡,但對其生長、蛻殼、攝食、繁殖、體質(zhì)等都會產(chǎn)生影響。呂曉燕等(2010)認(rèn)為氨氮要嚴(yán)格控制在一定范圍內(nèi),以防氨氮脅迫對紅螯螯蝦機(jī)體的損害,因?yàn)榘钡{迫不僅會引起蝦體的中毒,也會嚴(yán)重降低蝦的免疫力與抗病力。根據(jù)急性毒性試驗(yàn)中蝦臨死前的中毒表現(xiàn),筆者猜測氨氮對紅螯螯蝦體內(nèi)器官及生理生化水平均產(chǎn)生了負(fù)面影響。于是筆者在氨氮為0~2毫克/升范圍內(nèi)進(jìn)行了肝胰腺組織切片的觀察、抗氧化指標(biāo)及免疫指標(biāo)的檢測,并認(rèn)為紅螯螯蝦在一定質(zhì)量濃度的氨氮環(huán)境下,其器官功能、抗氧化能力、免疫能力等均會產(chǎn)生變化。

        首先,高氨氮導(dǎo)致的肝胰腺的生理功能受損是使蝦生命力降低的重要原因。通過組織切片觀察,肝小管上皮細(xì)胞的排列變得混亂,在中、高氨氮組,尤其在高氨氮組,細(xì)胞出現(xiàn)裂解,產(chǎn)生空泡化,證明了氨氮對肝胰腺的組織結(jié)構(gòu)有損害,若長期處于此環(huán)境條件下,將影響其生理功能而致肝胰腺病變,進(jìn)而破壞機(jī)體的新陳代謝,制約其越冬期間的生長及繁殖。

        其次,不同氨氮條件下,紅螯螯蝦體內(nèi)的抗氧化及免疫指標(biāo)不同,從而導(dǎo)致蝦的體質(zhì)下降。本次研究表明,紅螯螯蝦的抗氧化指標(biāo)、免疫相關(guān)指標(biāo)及能量代謝相關(guān)指標(biāo)均隨氨氮質(zhì)量濃度的升高而降低,其中高濃度氨氮組(2 毫克/升)的抗氧化能力、免疫相關(guān)指標(biāo)均顯著低于對照組(0 毫克/升)。有研究表明,在脅迫條件下,蝦通過調(diào)節(jié)體內(nèi)SOD 活性,從而減輕超氧化物自由基的損害,抑制脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的積累,保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,在氨氮為0~2毫克/升范圍內(nèi),抗氧化指標(biāo)SOD活性隨氨氮質(zhì)量濃度的升高而降低,而MDA則相反,隨氨氮質(zhì)量濃度的升高而升高,其中氨氮為1~2 毫克/升的SOD 值顯著低于無氨氮脅迫組(P<0.05),氨氮為2毫克/升組的MDA 值顯著高于其他組(P<0.05)。因此,氨氮對紅螯螯蝦抗氧化系統(tǒng)有影響,這種損傷隨著氨氮質(zhì)量濃度的升高而加劇。本次研究與蘆光宇等(2014)的研究結(jié)果相一致,即抗氧化酶活性隨著氨氮脅迫水平增加表現(xiàn)出先激活后抑制的趨勢,說明抗氧化酶既可因污染的暴露而產(chǎn)生適應(yīng)性誘導(dǎo)反應(yīng),也可因污染的毒性作用而產(chǎn)生中毒反應(yīng),并推測這是造成紅螯螯蝦器官損傷的重要原因。ACP 和AKP 的活性變化能夠一定程度指示機(jī)體的免疫狀況。蔣琦辰等(2013)在對紅螯螯蝦的氨氮脅迫研究中發(fā)現(xiàn),3 天脅迫后隨著氨氮的升高,其活性的變化相似,高質(zhì)量濃度組ACP及AKP的值都顯著降低,并認(rèn)為高氨氮脅迫能抑制免疫相關(guān)酶的活性,對免疫系統(tǒng)造成損害。本試驗(yàn)結(jié)果表明,4 個組的 ACP、AKP 值均差異顯著(P<0.05),其中氨氮濃度為2 毫克/升組的值最低,因此筆者認(rèn)為紅螯螯蝦機(jī)體的免疫力隨氨氮質(zhì)量濃度的升高而降低。

        在進(jìn)行紅螯螯蝦親蝦室內(nèi)越冬時需要對水質(zhì)進(jìn)行定期監(jiān)測,避免氨氮過高而影響機(jī)體的正常功能。當(dāng)氨氮不穩(wěn)定或突然升高時,必須進(jìn)行針對性應(yīng)對,當(dāng)氨氮超過0.4 毫克/升,甚至超過1 毫克/升時,建議進(jìn)行以下操作:首先是立即換水,快速降低氨氮質(zhì)量濃度;其次,鑒于過高氨氮會導(dǎo)致機(jī)體抗氧化指標(biāo)、免疫相關(guān)指標(biāo)等的變化,可潑灑應(yīng)激靈、免疫增強(qiáng)劑等產(chǎn)品,以降低親蝦的應(yīng)激反應(yīng),保持親蝦生理生化指標(biāo)的穩(wěn)定;第三,鑒于過高氨氮會導(dǎo)致機(jī)體免疫力的降低及肝胰腺的損傷,可在投喂的飼料中摻入大蒜素、螺旋藻粉、多礦寶等提高機(jī)體免疫力及護(hù)肝的產(chǎn)品,以增強(qiáng)親蝦的抗病力及維持肝胰腺等臟器的正常工作;最后,可在水中加入EM 菌等進(jìn)行調(diào)水,以穩(wěn)定水質(zhì),避免氨氮再次升高。長期穩(wěn)定、正常的氨氮質(zhì)量濃度將有助于提高紅螯螯蝦親蝦的越冬成活率,并維護(hù)親蝦的體質(zhì),是親蝦順利完成室內(nèi)越冬的基礎(chǔ)條件。

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