張言慧，高先嶺，黃 魁，郭青青，袁建國*

（1.山東國力生物科技有限公司，山東 濟南 250014； 2.山東國力生物技術研究院，山東 濟南 250101）

由于大腸桿菌遺傳學背景較清楚，生長速度快，培養(yǎng)基條件要求較低，容易實現(xiàn)高密度培養(yǎng)等特點，長期以來是商業(yè)生產(chǎn)重要目的基因的表達系統(tǒng)[1-2]。為了獲得高水平的基因表達產(chǎn)物，綜合考慮控制轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性及向胞外分泌等多方面因素，設計了許多具有不同特點的表達載體，以滿足表達不同性質(zhì)、不同要求的目的蛋白需要[3]。此外，宿主系統(tǒng)本身的特性也是重要的研究對象[4]。

大腸桿菌BL21 (DE3)及其衍生菌株是目前重組蛋白表達使用最廣泛的菌株[5]。與其他革蘭陰性菌一樣，大腸桿菌有細胞內(nèi)膜與細胞外膜之分，并將細胞分成兩部分空間：細胞質(zhì)與細胞周質(zhì)，通常重組大腸桿菌表達的重組蛋白存在于細胞質(zhì)。細胞質(zhì)內(nèi)可溶性重組蛋白易受大腸桿菌內(nèi)源性蛋白酶降解，導致表達水平低下。形成包涵體的重組蛋白可有效避免內(nèi)源性蛋白酶的降解，且分離純化方便，分離效率高，但重組蛋白的復性較困難。當含有二硫鍵的重組蛋白正確折疊成空間構(gòu)象的時候，需利用某些信號肽和前肽序列，將重組蛋白分泌至細胞周質(zhì)或細胞外的培養(yǎng)液中[6]。這不但有利于重組蛋白的分離純化，也能減少內(nèi)源性蛋白酶降解，周質(zhì)分泌可獲得具有天然一級結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物。同時氧化性的周質(zhì)間隙可模擬真核細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)環(huán)境，便于新生肽鏈折疊成天然結(jié)構(gòu)，從而獲得具有完全生物學活性的重組蛋白。但是，由于周質(zhì)空間容量有限，及重組蛋白的不完全跨膜轉(zhuǎn)運，使周質(zhì)分泌表達的重組蛋白表達量低，表達量稍高時容易形成包涵體，并易發(fā)生二硫鍵錯配，而分泌到胞外可很好地解決這些問題[7]。

1 重組大腸桿菌相關產(chǎn)品

由于生物藥有高活性、高特異性和低毒性等特點，市場發(fā)展前景廣闊。2015～2019年中國生物藥市場規(guī)模從1453億元增長至3172億元，預計2020年我國生物藥市場規(guī)模將達到3870億元。利用重組大腸桿菌可生產(chǎn)多種蛋白質(zhì)/多肽類生物藥，這些生物藥被廣泛用于臨床治療多種疾病，表1列舉了近年以大腸桿菌作為表達宿主生產(chǎn)的蛋白質(zhì)藥物。

表1 大腸桿菌作為表達宿主生產(chǎn)的生物藥物[1]

借助基因編輯技術，通過基因敲除，質(zhì)粒導入等手段改變大腸桿菌的代謝途徑，可生產(chǎn)大量的生物化學產(chǎn)品。表2列出了由大腸桿菌生產(chǎn)的一些生物化學產(chǎn)品。

表2 大腸桿菌生產(chǎn)的生物化學產(chǎn)品[8-13]

2 重組大腸桿菌表達載體的特點

目前普遍使用的表達質(zhì)粒是多個復制子、啟動子、選擇性標記、多克隆位點及融合蛋白移除策略組合的結(jié)果[14]。在產(chǎn)業(yè)化中，大腸桿菌宿主菌應用較成熟的有：BL21系列、JM109系列、W3110系列和K802系列等，常用的啟動子有Ptrp、Ppho、PL、PR、Ptac、Plac等，質(zhì)粒如pET、pBV220、pRK1、pRLK14等。不同宿主菌與質(zhì)粒往往有一定的選擇匹配性。大腸桿菌生產(chǎn)重組蛋白常用的啟動子見表3。

表3 大腸桿菌生產(chǎn)蛋白藥物通常所用的啟動子[15-16]

目前，重組大腸桿菌的工業(yè)化發(fā)酵主要采用營養(yǎng)源誘導、溫度誘導、IPTG（丙基硫代半乳糖苷，isopropyl β-D-thiogalactoside）和乳糖誘導3種方式，現(xiàn)分別概述如下。

2.1 營養(yǎng)源誘導

營養(yǎng)源誘導啟動子包括phoA、ugp、mgl及araB等，此種表達方式受培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)無機磷濃度（Pi）、糖原或生物素調(diào)控，其調(diào)控機制類似于Plac表達系統(tǒng)[17]。其他尚有pH及溶氧誘導調(diào)控型，雖然其中一些表達系統(tǒng)的應用例子還不多，但已顯示出很好的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

2.2 溫敏性啟動子誘導

溫敏性啟動子有PL、PR或其雜合啟動子PLPR等。發(fā)酵培養(yǎng)溫度采用溫度傳感器檢測并閉環(huán)控制。對于采用溫敏型啟動子的大腸桿菌重組菌，溫度檢測與控制十分關鍵。在發(fā)酵過程中溫度陡然升高，使細胞內(nèi)的酶活性加強，代謝加快，但當溫度持續(xù)較高時，會引起細胞內(nèi)一些酶活性降低或變性，細胞活力逐漸減弱，甚至死亡，即產(chǎn)生細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)性變化。因此采用溫敏型啟動子菌株表達外源蛋白，誘導時間較短，適用于培養(yǎng)規(guī)模較小的重組蛋白發(fā)酵。

溫度控制策略通常以30 ℃或37 ℃開始培養(yǎng)大腸桿菌到所需的細胞密度，再升溫至42 ℃進行誘導培養(yǎng)。對于溫敏型表達系統(tǒng)，最佳的發(fā)酵過程控制方法是在42 ℃高溫誘導培養(yǎng)1 h后，采用溫度逐漸下降的變溫策略，誘導時間可明顯延長，表達水平明顯提高[18]。

2.3 IPTG及乳糖誘導

采用IPTG誘導發(fā)酵的重組菌，IPTG濃度應控制在亞適量水平，濃度過高導致細胞中毒，濃度過低引起啟動子啟動程度減弱，從而影響外源蛋白高效表達。另外IPTG存在于發(fā)酵液中時，對重組蛋白純化亦帶來一定難度。

產(chǎn)業(yè)化規(guī)模應用的大腸桿菌表達系統(tǒng)菌株絕大多數(shù)為IPTG誘導型，常用的啟動子有Ptac和Plac等。當大規(guī)模生產(chǎn)時，IPTG的使用成本也是重組蛋白產(chǎn)業(yè)化主要原材料成本之一，因而發(fā)展了用乳糖替代IPTG誘導的發(fā)酵工藝。由于IPTG對細胞生長有一定的抑制作用，在使用時濃度一般只需誘導啟動子（Ptac或Plac）啟動則足夠，啟動子過度啟動并不能達到高效表達外源蛋白的目的。Silaban等[19]研究認為當IPTG濃度增大時，將使細胞生長速率下降，導致細胞生長的穩(wěn)定期提前到來，甚至加速細胞死亡。Luciana等[20]認為用IPTG誘導細胞表達重組蛋白將改變細胞生長過程和細胞的能量庫。

由于IPTG對細胞有一定的毒害作用、大規(guī)模發(fā)酵價格昂貴和蛋白質(zhì)藥物純化操作難度增加等原因，在實際大規(guī)模發(fā)酵時，一般均采用乳糖替代IPTG[21]。乳糖與其他碳源比例是關鍵因素，乳糖濃度過小，由于甘油等碳源對啟動子產(chǎn)生阻遏作用或抑制作用，使啟動子不能啟動或啟動強度不夠，易造成不表達或低水平表達；而乳糖濃度過大，會使得菌體只利用乳糖，造成碳源浪費，一般乳糖濃度約為2 g/L。

3 重組大腸桿菌的代謝特性

3.1 不同大腸桿菌宿主對碳源的代謝特征

作為培養(yǎng)基中最廣泛采用的碳源，葡萄糖和甘油在一定水平上影響大腸桿菌的生理特性[22]（見圖1）。葡萄糖通過磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）途徑進入細胞內(nèi)，與此同時磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸[23]。大腸桿菌通過3個途徑分解葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)楸牵ㄌ墙徒馔緩?、ED途徑和PP途徑[24]。大腸桿菌BL21和大腸桿菌JM109兩種菌株利用葡萄糖做碳源時，當碳源代謝流經(jīng)過丙酮酸時，若超過了三羧酸循環(huán)處理能力即產(chǎn)生乙酸，其聚集有培養(yǎng)基和菌株特異性[25]。大腸桿菌BL21作為宿主細胞表達重組蛋白有優(yōu)勢，JM109產(chǎn)生的乙酸濃度高于BL21，且當細胞密度增加時兩個菌株的乙酸聚集速率均降低[26]。甘油在甘油脫氫酶（GDH）和二羥丙酮激酶（DHAK）的催化下轉(zhuǎn)變?yōu)槎u丙酮磷酸進入糖酵解途徑[27]。在利用甘油作為碳源轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸或丙酮酸時，產(chǎn)生的氧化還原當量是葡萄糖的兩倍。甘油轉(zhuǎn)化為琥珀酸或乙醇是氧化還原平衡過程。

圖1 大腸桿菌耗氧發(fā)酵條件下中心代謝途徑圖示[22]

3.2 乙酸與比生長速率對發(fā)酵的影響

大腸桿菌發(fā)酵過程中易產(chǎn)生副產(chǎn)物乙酸，發(fā)酵液中乙酸濃度過高將抑制細胞生長和重組蛋白生產(chǎn)率[28]，來自于中心代謝途徑的產(chǎn)物將與乙酸生成途徑相競爭。在指數(shù)生長期乙酸激酶（ackA）是生成乙酸的主要途徑，在穩(wěn)定期丙酮酸氧化酶（poxB）途徑占據(jù)優(yōu)勢[29]（見圖1）。由于在誘導前和誘導后不同菌體比生長速率μ值對細胞生長和蛋白表達有協(xié)同影響，可在誘導前無乙酸抑制條件下進行補料分批實驗，從而避免乙酸對細胞生長和重組蛋白生產(chǎn)的抑制。Valiollah等[30]研究了4種不同補料分批模式中細胞生長和重組蛋白表達的變化特征，得出結(jié)論：生物質(zhì)對底物的得率Yx/s受μ的影響；由于外源蛋白過量表達，生物質(zhì)的生產(chǎn)率受誘導后μ的高度影響。

提高重組大腸桿菌的發(fā)酵水平可從兩個方面入手，即提高菌體密度和單位菌體生產(chǎn)的外源基因產(chǎn)物。通過補料分批發(fā)酵可實現(xiàn)大腸桿菌的高密度培養(yǎng)。大腸桿菌高密度細胞發(fā)酵條件下的乙酸代謝，低pH培養(yǎng)條件下低于高pH培養(yǎng)條件下的乙酸濃度。在低葡萄糖濃度條件下，當葡萄糖消耗速率下降時，乙酸開始被利用，且異檸檬酸裂解酶（aceA）的活性增加[31]。另外，質(zhì)粒的穩(wěn)定性是影響大腸桿菌補料分批培養(yǎng)過程中重組蛋白生產(chǎn)的另一個重要的因素。研究結(jié)果表明：發(fā)酵過程中以較高的μ進行培養(yǎng)，可降低質(zhì)粒丟失率[32]，進而提高外源基因的表達水平。

3.3 丙酮酸及乙醛酸循環(huán)的代謝特征

大腸桿菌中存在磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶（由pck基因編碼）和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（由ppc基因編碼），二者是由多拷貝質(zhì)粒上的tac啟動子控制的。這兩個酶同時過表達，會激發(fā)氧氣和葡萄糖的消耗，并降低生長得率，導致丙酮酸和乙酸大量分泌。消除這種效應可通過敲除質(zhì)粒上的pck或者ppc基因，或通過突變使這兩個酶失活實現(xiàn)[33]。丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A是通過丙酮酸甲酸裂解酶（PFL）的作用[34]（見圖1）。

乙醛酸循環(huán)主要的控制點是異檸檬酸脫氫酶（IDH）的激活和去激活。當大腸桿菌利用乙酸作為碳源時，約75 % IDH處于去激活狀態(tài)，可導致異檸檬酸濃度增加，從而使異檸檬酸裂解酶發(fā)揮作用[35]。另外，當TCA循環(huán)通量低并有乙酸存在時，細胞內(nèi)乙醛酸循環(huán)支路的異檸檬酸裂解酶也會被激活。

4 重組大腸桿菌的發(fā)酵調(diào)控

研究重組大腸桿菌培養(yǎng)過程中的特點，特別是重組菌和宿主菌的生長速率、底物消耗速率、產(chǎn)物生成速率、質(zhì)粒穩(wěn)定性等動力學規(guī)律，是重組大腸桿菌發(fā)酵過程優(yōu)化的重要基礎[36]。通過分批培養(yǎng)、補料分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)進行有關動力學研究，對制定的優(yōu)化控制策略加以驗證和調(diào)整改進。重組大腸桿菌的代謝活動可利用一些宏觀變量觀察和跟蹤。雖然細胞水平代謝活動是肉眼無法直接觀察的，但pH、溶氧、氧消耗速率、二氧化碳釋放速率、呼吸商、菌體細胞生長、糖耗、氮耗等宏觀變量的變化提供了代謝活動的線索，反映了重組菌代謝流的狀況，是發(fā)酵工藝控制和干預依據(jù)，也是發(fā)酵過程放大的重要依據(jù)[37-38]。配置多種傳感器、利用計算機采集數(shù)據(jù)并控制的發(fā)酵罐是進行有關研究的關鍵手段[39]。

重組大腸桿菌表達系統(tǒng)（宿主菌、外源基因、載體等）不同時，發(fā)酵培養(yǎng)表現(xiàn)的代謝過程特征也不同。有些可通過發(fā)酵過程的操作優(yōu)化（補料策略、環(huán)境條件優(yōu)化等）使細胞代謝正常，獲得高效表達；有些可能是基因背景原因無法實現(xiàn)高效表達[40]。

5 結(jié)語

外源基因在重組大腸桿菌中表達水平的高低是一個綜合性的問題。目的基因的選擇、遺傳密碼的偏愛性、表達載體的選擇、酶切位點的選擇等這些基因?qū)用娴囊蛩厥亲罨A的。pH、溶氧、氧消耗速率、二氧化碳釋放速率、呼吸商以及菌體細胞生長、糖耗、氮耗等宏觀變量的變化及調(diào)控是大腸桿菌表達系統(tǒng)產(chǎn)業(yè)化的重要保障。而大腸桿菌代謝途徑基因表達水平對于前述研究具有重要的指導意義。目前已出現(xiàn)多種真核表達系統(tǒng)，但重組大腸桿菌憑借其自身的諸多優(yōu)勢，仍然是基礎研究和商業(yè)生產(chǎn)重組蛋白及生化產(chǎn)品的強大工具。隨著分子生物學新技術的不斷涌現(xiàn)，大腸桿菌表達系統(tǒng)必將在實驗研究及工業(yè)生產(chǎn)應用中發(fā)揮更大的作用。