（鷹潭市綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江西 鷹潭 335000）

白花蛇舌草為茜草科耳草屬植物白花蛇舌草的干燥全草，具有清熱解毒、消癰散結(jié)、利水消腫等作用，廣泛應(yīng)用于毒蛇咬傷，咽喉腫痛，肺熱喘咳，濕熱黃疸，熱淋澀痛，瘡腫熱癰等的治療。白花蛇舌草的化學(xué)組分比較復(fù)雜，包括多糖、蒽醌類、黃酮類、三帖酸等多種化合物，其中去乙酰車葉草酸甲酯是其主要的有效成分，具有抗菌消炎、利水滲濕、保護(hù)肝臟、抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，也有一定的抵抗誘癌致癌物的作用，此外還有更廣泛的其他生物學(xué)效應(yīng)[1-2]。本研究建立高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定不同產(chǎn)地白花蛇舌草中去乙酰車葉草酸甲酯的含量，方法簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高，可應(yīng)用于白花蛇舌草的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

Waters e2695高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世）；DS-3120超聲波清洗器（天津東康）；MSA225PCE電子天平（賽多利斯）；去乙酰車葉草酸甲酯（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111786-201602）；乙腈為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[3-10]

色譜柱：Waters SymmetryShield RP C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（4:96）；檢測(cè)波長(zhǎng)：236 nm；柱溫：25 ℃；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：10 μl；理論板數(shù)不低于6000（以去乙酰車葉草酸甲酯峰計(jì)）。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取去乙酰車葉草酸甲酯對(duì)照品16.75 mg，置25 ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并定容至刻度，搖勻，即制成0.67 mg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取藥材粗粉6 g，精密稱定，加水煎煮2 h，煎液濾過，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，分次轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 取白花蛇舌草樣品，按2.2.2項(xiàng)方法制成供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，得樣品的液相色譜圖。結(jié)果見圖1。

圖1 HPLC圖譜

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品貯備液5，2.5，1.0，0.5，0.2 ml，分別置于10 ml量瓶中，用流動(dòng)相定容，搖勻，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以濃度（C）為橫坐標(biāo)，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=10 980C-24 969，r=0.9999。結(jié)果表明：去乙酰車葉草酸甲酯在13.4～335.0 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取含去乙酰車葉草酸甲酯的對(duì)照品溶液10 μl，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣5次，以乙酰車葉草酸甲酯的峰面積計(jì)算RSD值，結(jié)果RSD為0.6 %，表明精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批江西產(chǎn)白花蛇舌草粗粉6份，每份6 g，按2.2.2項(xiàng)下方法制備，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，分別計(jì)算去乙酰車葉草酸甲酯的含量，結(jié)果平均含量為0.1288 mg/g，RSD為0.6 %，表明方法的重現(xiàn)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批白花蛇舌草供試品溶液，分別于配制后0，2，4，6，8，10，12，24 h進(jìn)樣測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)下去乙酰車葉草酸甲酯峰面積，并以去乙酰車葉草酸甲酯的峰面積計(jì)算RSD值。結(jié)果RSD為1.1 %，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的白花蛇舌草粉末（過40目篩）6 g，共9份，分別精密加入去乙酰車葉草酸甲酯對(duì)照品溶液1.0，0.5，0.25 ml，再加水200 ml煎煮2 h，煎液濾過，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，分次轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果去乙酰車葉草酸甲酯的平均回收率為99.37 %， RSD為0.3 %，表明方法準(zhǔn)確，見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4 樣品測(cè)定

取不同產(chǎn)地的白花蛇舌草藥材，按2.2.2項(xiàng)下方法處理，2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算去乙酰車葉草酸甲酯的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 波長(zhǎng)的選擇

采用DAD檢測(cè)器3D模式進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示去乙酰車葉草酸甲酯的最大吸收波長(zhǎng)是236 nm，因此確定其檢測(cè)波長(zhǎng)為236 nm。

3.2 提取方式的選擇

考察了藥材粗粉加水煎煮后蒸干用甲醇溶解直接過濾進(jìn)樣、藥材粗粉加水煎煮后濾液用ADS-8大孔樹脂洗脫后蒸干溶解進(jìn)樣、藥材粗粉加水煎煮后濾液用HP-20大孔樹脂洗脫后蒸干溶解進(jìn)樣等方式，結(jié)果顯示藥材粗粉加水煎煮后濾液直接蒸干再用甲醇溶解進(jìn)樣這種方式樣品峰雜質(zhì)少，成分較洗脫方式損失少，方法簡(jiǎn)單，成本低廉，是最佳的提取方式。

3.3 流動(dòng)相的選擇

考察了不同流動(dòng)相甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水-冰醋酸、甲醇-水、乙腈-水對(duì)去乙酰車葉草酸甲酯的分離效果，結(jié)果乙腈-水作流動(dòng)相峰形較好，分離度較高，且流動(dòng)相簡(jiǎn)單，最終確定流動(dòng)相為乙腈-水（4:96）。