吳彬，李玉強

(錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院臨床生物樣本中心，遼寧 錦州 121000)

在全世界范圍內，肺癌是最為常見的惡性腫瘤，其死亡率排在所有癌癥的第一位[1-2]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)一般占到原發(fā)性肺癌的80%～85%，但其5年生存率較低，不足20%[3]。酪氨酸激酶在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著極其重要的作用，以其為藥物靶點的表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)一直是抗腫瘤藥物研發(fā)的重點，隨著這個領域的不斷成熟，EGFR-TKIs成為治療NSCLC患者的重要手段，然而，幾乎所有患者在應用 EGFR-TKIs 治療后一年均會面臨耐藥的問題。EGFR-TKIs耐藥的機制有很多，包括EGFR T790M突變的出現(xiàn)，MET擴增，組織學轉化以及KRAS，BRAF或PIK3CA的突變[4-5]，其中T790M 突變是最常發(fā)生的耐藥機制，不僅是導致繼發(fā)耐藥的主要原因[6]，一代和二代EGFR-TKIs原發(fā)[7]或繼發(fā)耐藥也都與之相關。近年來原發(fā)T790M突變隨著檢測技術的發(fā)展和檢測方法的更新，其檢出率表現(xiàn)出明顯的增加趨勢[8-10]。繼發(fā)T790M突變往往得到臨床的普遍關注和重視，而對原發(fā)T790M突變忽視或關注度不夠，同時大部分研究是從繼發(fā)T790M角度對各種肺癌臨床進行分析研究，鮮有對原發(fā)與繼發(fā)T790M突變兩者在臨床病理上的分析研究。本研究使用ARMS法檢測原發(fā)和繼發(fā)T790M的突變狀態(tài)，并分析其與臨床病理特征的關系，從而為選擇后續(xù)治療方案提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

由2014年1月至2018年12月錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院收治住院，行腫物活檢、手術切除或胸腔積液抽取，并于病理科確診為NSCLC的患者中篩選研究病例374例，將年齡、性別、病理組織分型、吸煙史及臨床分期等臨床病理特征建立成資料庫。參照2015年世界衛(wèi)生組織(WHO)及國際肺癌研究協(xié)會(IASLC)共同修訂的肺和胸膜腫瘤分類標準確定病理組織分型，根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)于2017年1月頒布實施的最新版肺癌TNM分期標準確定臨床分期。納入標準：(1)初次行EGFR檢測的病例從尚未進行過化療或者已經(jīng)進行過化療，但是沒有毒副作用干擾的患者中選取，化療對基因表達情況不產(chǎn)生影響[11]；(2)所有非原發(fā)T790M突變患者均有 EGFR基因18、19或者21 外顯子上敏感位點的突變，并接受EGFR-TKIs(如吉非替尼、埃克替尼等靶向藥)治療。在病情有所進展后，通過穿刺手術取得患者活檢新鮮組織或胸腔積液再次檢測EGFR 基因突變情況，根據(jù)檢測結果將患者分為T790M 突變組和無 T790M 突變組；(3)臨床表征不足(年齡，性別，吸煙狀況，組織學，疾病分類)的患者被排除在研究之外；(4)年齡≥18歲，且自愿簽署知情同意書。每例標本的病理組織學診斷均由兩位高年資病理科醫(yī)師進行評估。研究經(jīng)我院倫理委員會批準，并征得患者或家屬的知情同意。

1.2 突變擴增阻滯系統(tǒng) (amplification refractory mutation system， ARMS)法檢測突變

應用ARMS-PCR法(ABI 7500 熒光定量PCR儀，美國應用生物公司)對EGFR基因進行檢測，檢測范圍涵蓋18、19、20和21這4個外顯子上的29個熱點突變(ADx-ARMS，艾德，YZB/國6377-2014)。根據(jù)EGFR檢測試劑盒的說明書來設置反應參數(shù)，所有實驗都設有陽性對照和陰性對照，保證結果的準確性。最終根據(jù)PCR的擴增曲線及CT值的cut-off值對結果進行判讀。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。比較原發(fā)與繼發(fā)T790M突變與 NSCLC 患者臨床病理特點的關系時，計數(shù)資料采用(%)表示，行連續(xù)校正χ2檢驗或Fisher精確概率法(Fisher’s exact test)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 臨床病理特征

374例NSCLC患者中先后發(fā)生T790M突變的共197例，其中女性T790M突變率高于男性(54.3%>45.7%)；中位年齡為59歲(27～88歲)，小于61歲占比46.7%，大于等于61歲占比53.3%；吸煙患者占比41.7%，不吸煙占比58.4%；病理組織分型中腺癌占比60.9%，非腺癌占比39.1%；TNM分期中Ⅰ～Ⅱ期占比38.6%，Ⅲ～Ⅳ期占比61.4%。T790M突變情況與性別、年齡、吸煙史等方面的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與病理組織分型及TNM分期有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。在374例NSCLC患者中，首次進行EGFR檢測陰性結果有177例，在疾病進展后再次行EGFR基因檢測，均無T790M突變情況。

2.2 原發(fā)與繼發(fā)T790M突變與基因特征的相關性分析

在選取的374例非小細胞肺癌患者初次進行EGFR檢測的結果中發(fā)現(xiàn)單獨L858R發(fā)生突變168例，占非小細胞肺癌患者突變總數(shù)的44.9%；單獨19-del發(fā)生突變159例，占非小細胞肺癌患者突變總數(shù)的42.5%；罕見突變36例，占非小細胞肺癌患者突變總數(shù)的9.6%；雙突變共11例，占非小細胞肺癌患者突變總數(shù)的3%，其中T790M伴L858R突變的7例，T790M伴19-del突變的4例。初次行EGFR檢測未發(fā)生T790M突變的患者接受吉非替尼、厄洛替尼或埃克替尼治療后，病情進展再次進行T790M突變的檢測，發(fā)現(xiàn)T790M突變186例，其中合并L858R突變的50例，合并19-del突變的136例。結果顯示，T790M突變常和EGFR致敏突變一同出現(xiàn)，在原發(fā)T790M突變人群中，與19-del比較，L858R突變常合并T790M突變(63.6% vs 36.4%)，而這一比例在繼發(fā)T790M突變人群中恰恰相反為26.9% vs 73.1%，原發(fā)和繼發(fā)T790M突變在L858R和19-del分布差異存在統(tǒng)計學意義(P=0.009)。

表1 NSCLC患者T790M突變與臨床病理特征的關系

3 討 論

近年來對于非小細胞肺癌靶向藥物的研究隨著精準醫(yī)療時代的到來也變得越來越深入。其中靶向治療的耐藥性給患者的治療帶來了極大的難題，因此耐藥的研究被越來越多的專家學者所重視。EGFR基因21號外顯子上L858R敏感點突變以及19號外顯子上19-del缺失突變這兩種常見突變在臨床上已經(jīng)有較為深入的研究，而針對EGFR T790M突變與臨床病理特征及分子改變情況的研究還不是很多。研究報道繼發(fā)T790M突變率基本在一定范圍內，為45%～60%之間[12-13]，本研究中繼發(fā)T790M突變率為49.7%，與文獻報道一致。然而原發(fā)T790M突變率的數(shù)值波動范圍較大，在不同研究中數(shù)值差異很大，從較低的1%到80%[14-15]。導致原發(fā)T790M突變發(fā)生率波動范圍較大原因可能如下：(1)檢測技術，Sanger法檢測EGFR突變人群原發(fā)T790M突變發(fā)生率在1%～8%[16-18]， AMRS法檢測敏感性在2.75%～6.91%。本研究采用ARMS法進行檢測，檢出原發(fā)T790M突變率為3%，在文獻報道范圍內；(2)檢測標本，原發(fā)T790M在新鮮冰凍標本的突變率高于石蠟包埋福爾馬林固定標本[19]。雖然原發(fā)性EGFR T790M在臨床上是一種少見的情況，但針對這部分患者的治療方案還需要進一步深入研究。隨著檢測技術的不斷發(fā)展，原發(fā)T790M的檢出率也在不斷增加，在臨床治療和指導預后等方面發(fā)揮著越來越重要的作用。

本研究在374例非小細胞肺癌患者中描述了含有原發(fā)與繼發(fā)EGFR T790M突變患者的臨床病理及分子特征。盡管T790M突變可以誘導EGFR-TKIs類藥物耐藥，但是它或許并不能成為誘發(fā)腫瘤的獨立因素，必須與19外顯子缺失及L858R突變共存才能誘導腫瘤發(fā)生。本研究中原發(fā)T790M突變常合并L858R并存，而繼發(fā)T790M突變常合并19-del并存，針對這一研究結果的解釋是19-del較L858R對TKIs敏感性更高[20]，經(jīng)EGFR-TKIs治療后T790M兩次突變或亞克隆更容易在19-del中富集，另一種解釋是L858R突變在促進腫瘤形成中需要更多其他基因改變協(xié)助完成。

總之，原發(fā)與繼發(fā)性T790M突變檢測在肺癌患者中具有巨大的潛在臨床應用價值，隨著這一研究領域的不斷發(fā)展，為患者跟蹤檢測T790M的動態(tài)變化，不僅能及時評估靶向藥物的療效以及預后，同時有利于復發(fā)和轉移的及早發(fā)現(xiàn)，更為患者治療方案的合理化及個體化提供強有力的理論依據(jù)。然而由于本研究為小樣本量的回顧性研究，缺乏大量的研究數(shù)據(jù)予以支撐結論，因此對非小細胞肺癌患者T790M突變的動態(tài)改變在臨床治療中的作用尚需進一步研究證實。我們認為對原發(fā)和繼發(fā)T790M突變進行大樣本的篩查研究十分必要，希望可以明確闡釋T790M動態(tài)變化患者的臨床病理特征及分子改變的相關性。