韋璐，黃杰，杜麗娟，孫欽菊，王永芳，寧恩創(chuàng)*

（1.廣西大學(xué)，廣西南寧530000；2.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530000）

香蕉是芭蕉科（Musaceae）芭蕉屬（Musa L.）植物所結(jié)果實。香蕉香氣濃郁，營養(yǎng)價值高，含有豐富的氨基酸、有機酸、多酚、總黃酮等活性物質(zhì)[1]。研究表明，香蕉具有抗氧化、降血糖、降血脂、提高免疫力等多種保健功能[2-3]。香蕉因其獨特的香味和豐富的營養(yǎng)價值被人們喜愛，香蕉極不耐儲藏，容易氧化褐變，香蕉加工是保存香蕉的有效手段。目前市場上的香蕉加工產(chǎn)品以香蕉片、香蕉飲料為主。開發(fā)高值化、具有競爭力的香蕉深加工產(chǎn)品有助于我國香蕉產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展。

果醋是以水果或果品加工下腳料為主要原料，經(jīng)酒精發(fā)酵釀制而成的酸性產(chǎn)品。果醋不僅具有水果常見的營養(yǎng)素，還在發(fā)酵過程中產(chǎn)生具有特殊功效的次生代謝產(chǎn)物，具有降脂、降糖[4]等保健作用。固定化發(fā)酵是指將微生物高度密集地固定在活性炭、玉米芯等載體上，微生物在適宜條件下迅速增殖的生物技術(shù)。經(jīng)固定化后的微生物在發(fā)酵過程中可重復(fù)利用，簡化了菌種擴大培養(yǎng)過程，縮短發(fā)酵時間，節(jié)約生產(chǎn)場地，提高設(shè)備利用率和生產(chǎn)率，易于實現(xiàn)自動化控制和生產(chǎn)連續(xù)化，所得產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定[5]，已廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)及醫(yī)藥等各領(lǐng)域[6]，目前國內(nèi)外尚未見采用此法生產(chǎn)香蕉醋的研究報道。

本研究以酒精度4%vol～5%vol 的香蕉果酒為原料，選用市售優(yōu)良的醋酸菌，采用玉米芯吸附包埋法進行固定化醋酸菌發(fā)酵，研究香蕉醋發(fā)酵過程中主要成分的含量變化，以及這些變化對成品風(fēng)味品質(zhì)的影響，為香蕉醋品質(zhì)評價提供參考依據(jù)，同時為香蕉醋的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論指導(dǎo)和技術(shù)經(jīng)驗，豐富市場果醋種類。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香蕉果酒：廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院果酒生產(chǎn)車間；玉米芯：市購；醋酸菌：陜西易騰達有限公司；牛血清白蛋白溶液：Luminex 公司；沒食子酸（分析標(biāo)準(zhǔn)品）、蘆丁（分析標(biāo)準(zhǔn)品）：上海源葉生物科技有限公司；考馬斯亮藍G250：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；福林酚、無水碳酸鈉、無水乙醇、茚三酮、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、葡萄糖、磷酸二氫鈉、3，5-二硝基水楊酸、無水亞硫酸鈉、酒石酸鉀鈉、苯酚、硫酸、鄰苯二甲酸氫鉀、磷酸、檸檬酸（均為分析純）：西隴化工股份有限公司。

MC-SH2112 電磁爐：廣東美的生活電器制造有限公司；電爐：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；HWS-26 電熱恒溫水浴鍋：上海齊欣科學(xué)有限公司；XHC 渦旋混合器：江蘇金怡儀器科技有限公司；3H16RI 智能高速離心機：湖南赫西儀器裝備有限公司；BCD645WKPZM電冰箱：合肥美的電冰箱有限公司；DNP-9272 電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C pH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；WZS32 手持阿貝折光儀：上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司；T6 型新世紀(jì)紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；YTD-200 固定化細胞連續(xù)反應(yīng)器：陜西易騰達釀造科技有限公司；TZE-60L 高效節(jié)能霧化蒸煮器（電熱）：廣州市準(zhǔn)食品機械有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 香蕉醋制備工藝

1.2.1.1 工藝流程

固定化載體→醋酸菌活化→醋酸固定化發(fā)酵→過濾→香蕉醋

1.2.1.2 操作要點

1）固定化載體：選用無黑芯、無異味、不發(fā)霉的玉米芯作固定化載體，滅菌后加入固定化反應(yīng)器中，玉米芯填滿反應(yīng)器的2/3 以上。

2）醋酸菌活化：按0.1%～0.5%（以發(fā)酵液質(zhì)量計）的添加量計算醋酸菌添加量，將醋酸菌均勻的撒在玉米芯上，開啟物料泵將香蕉酒泵入發(fā)酵罐，開啟發(fā)酵罐循環(huán)泵，當(dāng)醋床溫度升溫至35 ℃左右并保持不變時，活化完畢。

3）固定化發(fā)酵：設(shè)定冷卻泵啟動溫度為36.5 ℃，冷卻泵停止溫度為35.5 ℃。將酒精度為4%vol～5%vol香蕉酒分批泵入固定化反應(yīng)器中進行發(fā)酵，檢測發(fā)酵過程中的酒精度和酸度值，當(dāng)酒精度降為0%vol 時完成一批香蕉醋發(fā)酵階段，將香蕉醋泵入儲罐后，再按同樣的方法進行下一批的香蕉醋發(fā)酵。

1.2.2 測定方法

樣液預(yù)處理：定期從固定化連續(xù)反應(yīng)器中取適量發(fā)酵液，在8 000 r/min，0～5 ℃的離心機中離心15 min，取上清液作為待測液。

1.2.2.1 pH 值、酸度和酒精度的測定

pH 值：采用pH 計直接測定[7]。

酸度：采用氫氧化鈉滴定法測定[6]。酒精度：采用蒸餾法測定[8]。

1.2.2.2 透光率、褐變值和可溶性固形物的測定

透光率：取適量待測液，在波長670 nm 處由分光光度計直接測得。

褐變值：參考黎星辰等[9]的研究方法。

可溶性固形物：采用阿貝折光儀直接測定。

1.2.2.3 蛋白質(zhì)含量的測定

采用考馬斯亮藍法測定[10]。

1.2.2.4 還原糖和總糖含量的測定

還原糖：采用二硝基水楊酸法（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS 法）測定[11]。

總糖：采用苯酚-硫酸法測定[12]。

1.2.2.5 多酚含量的測定

采用福林酚法測定[13]。

1.2.2.6 總黃酮含量的測定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法測定[14]。

1.2.2.7 氨基酸含量的測定

參考GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測定》[15]。

1.2.2.8 有機酸含量的測定

有機酸含量測定采用高效液相色譜法[16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)測定3 次以上，采用Origin 8.5、SPSS 19.0軟件進行圖片繪制和數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 香蕉醋發(fā)酵過程中pH 值、酸度和酒精度的變化

酸味是香蕉醋的主要感官指標(biāo)，取決于有機酸的種類和含量。總酸的含量和pH 值的變化反映了香蕉醋中有機酸的含量，體現(xiàn)香蕉醋的品質(zhì)。在香蕉醋的發(fā)酵過程中，醋酸菌將酒精轉(zhuǎn)換成醋酸，因此發(fā)酵液的酒精度能反應(yīng)香蕉醋的發(fā)酵程度。香蕉醋發(fā)酵過程中pH 值、酸度和酒精度的變化見圖1。

圖1 香蕉醋發(fā)酵過程中pH 值、酸度和酒精度的變化Fig.1 Changes of pH，acidity and alcohol during the fermentation of banana vinegar

由圖1 可知，香蕉醋的主發(fā)酵時間為6 d。隨著發(fā)酵時間的增加，發(fā)酵液pH 值呈波動下降趨勢，由3.69逐漸降至3.55?？偹嵩诎l(fā)酵期間整體呈上升趨勢，由1.25 g/100 mL 升至3.80 g/100 mL。香蕉醋發(fā)酵過程中，不同時期總酸的增加幅度不同，發(fā)酵前4 d，總酸含量上升較快，在第4 天時總酸含量達到3.48 g/100 mL，比第0 天提高了169.23%；4 d～6 d，總酸上升緩慢，發(fā)酵結(jié)束時香蕉醋的總酸含量為3.80 g/100 mL，比第4 天時提高了28.57%。酒精度在香蕉醋發(fā)酵期間呈波動下降趨勢，發(fā)酵前4 d，酒精度由4.55%vol 迅速下降至0.41%vol，下降了90.99%，4 d～6 d，酒精度緩慢下降至0%vol，表明香蕉醋固定化發(fā)酵已達終點，前發(fā)酵階段結(jié)束，此后進入陳釀階段。

在香蕉醋發(fā)酵期間，醋酸菌以酒精為底物，在乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的作用下將酒精氧化成乙酸，隨著氧化的進行，發(fā)酵液中酒精含量減少，乙酸含量增加，因此發(fā)酵液pH 值降低，這一發(fā)酵趨勢和Arianna Roda 等[17]的研究結(jié)果一致。發(fā)酵期間，當(dāng)發(fā)酵液的酒精度低于1%vol 時，酒精度下降變緩，對應(yīng)的pH 值和總酸含量變化不明顯，發(fā)酵結(jié)束時，香蕉醋的總酸為3.80 g/100 mL，和其它果醋總酸含量差別不大，如桃醋[18]（總酸含量3.54 g/100 mL）、克菲爾蘋果醋[19]（總酸含量4.10 g/100 mL）。

2.2 香蕉醋發(fā)酵過程中透光率、褐變值的變化

透光率和褐變值反應(yīng)香蕉醋的發(fā)酵程度以及在發(fā)酵過程中的褐變情況，是體現(xiàn)香蕉醋色澤品質(zhì)的重要指標(biāo)。香蕉醋發(fā)酵過程中褐變值和透光率的變化見圖2。

圖2 香蕉醋發(fā)酵過程中褐變值和透光率的變化Fig.2 Changes of browning and transmittance during the fermentation of banana vinegar

由圖2 可知，0～0.5 d，發(fā)酵液的透光率迅速升高，由43.64%升至95.94%，0.5 d～1 d 透光率降低至88.26%，1 d～6 d，透光率緩慢回升并趨于穩(wěn)定狀態(tài)。在香蕉醋發(fā)酵的過程中，發(fā)酵液的褐變值呈下降趨勢，0～0.5 d，發(fā)酵液的褐變值迅速降低，下降了49.68%，隨后在0.5 d～6 d 褐變值下降了7.69%，香蕉醋發(fā)酵結(jié)束時，褐變值為0.72。透光率和褐變值在香蕉醋發(fā)酵過程中呈相反趨勢，在發(fā)酵過程中褐變值的降低使得發(fā)酵液更加澄清透亮，這一點和丁利君等[20]的研究一致。

2.3 香蕉醋發(fā)酵過程中可溶性固形物和蛋白質(zhì)的變化

可溶性固形物是指液體或流體食品中所有溶解于水的化合物總稱，包括糖、酸、維生素、礦物質(zhì)等，主要為可溶性糖類，是評價果醋品質(zhì)的重要指標(biāo)。香蕉醋發(fā)酵過程中可溶性固形物和蛋白質(zhì)的變化見圖3。

由圖3 可知，在香蕉醋發(fā)酵期間，可溶性固形物含量呈先上升后趨于穩(wěn)定的狀態(tài)，在發(fā)酵的0～0.5 d，發(fā)酵液的可溶性固形物含量上升了52.44%，0.5 d～3 d，發(fā)酵液的可溶性固形物含量波動下降，3 d～6 d，發(fā)酵液的可溶性固形物含量波動上升，當(dāng)香蕉醋發(fā)酵結(jié)束時，可溶性固形物含量為4.80%。

蛋白質(zhì)由氨基酸組成，在一定條件下，蛋白質(zhì)會水解成氨基酸。氨基酸是微生物良好的氮源，蛋白質(zhì)含量的變化可以在一定程度上反映其轉(zhuǎn)化為氨基酸的程度，進一步體現(xiàn)微生物對其的利用情況。由圖3可知，在香蕉醋發(fā)酵期間，發(fā)酵液蛋白質(zhì)含量呈下降趨勢，發(fā)酵第1 天，發(fā)酵液蛋白質(zhì)含量由7.25 mg/100 g迅速下降至3.83 mg/100 g，1 d～4 d，發(fā)酵液的蛋白質(zhì)含量有所上升，4 d～6 d，發(fā)酵液的蛋白質(zhì)含量在4.70 mg/100 g 上下波動，香蕉醋發(fā)酵結(jié)束時，發(fā)酵液蛋白質(zhì)含量為5.10 mg/100 g。孫宗保等[21]研究發(fā)現(xiàn)，醋酸發(fā)酵階段，當(dāng)發(fā)酵環(huán)境適合蛋白酶的生長時，蛋白質(zhì)在蛋白酶作用下不斷分解，氨基酸不斷增加，故發(fā)酵液的蛋白質(zhì)含量不斷降低，如圖3 所示，在醋酸發(fā)酵初期蛋白質(zhì)含量迅速下降并慢慢趨于穩(wěn)定。香蕉醋中的氨基酸分解后經(jīng)氧化或還原可以產(chǎn)生許多重要的香味物質(zhì)，如戊醛丙二醇縮醛、乙醛丙二醇縮醛、碘代苯、戊醇、乙二醇丁醚醋酸酯、β-紫羅蘭酮等[22]，這些香氣成分有助于提升果醋的風(fēng)味及品質(zhì)。

2.4 香蕉醋發(fā)酵過程中還原糖和總糖的變化

糖類是微生物重要的能源和碳源，是香蕉醋風(fēng)味物質(zhì)重要的前體，是發(fā)酵過程中重要的成分物質(zhì)。還原糖、總糖的變化可以反映醋酸菌在發(fā)酵過程中對糖的利用情況。

由圖4 可知，在香蕉醋發(fā)酵過程中，總糖呈先上升后下降的趨勢，發(fā)酵第1 天，總糖上升了31.15%，在第1～3 d，總糖含量迅速下降，由1.38 g/100 g 下降至0.77 g/100 g，在第3～6 天，總糖含量趨于穩(wěn)定，當(dāng)香蕉醋發(fā)酵結(jié)束時，總糖含量為0.74 g/100 g。還原糖的變化趨勢和總糖基本一致，先上升后下降最后趨于穩(wěn)定，相對于總糖，還原糖的變化出現(xiàn)延后情況，在第1～3 天，還原糖一直處于上升階段，上升了21.51%，在第3～6 天，還原糖迅速下降后趨于穩(wěn)定，香蕉醋發(fā)酵結(jié)束時，還原糖含量為0.09 g/100 g。

醋酸發(fā)酵前期還原糖和總糖含量略有增加，可能有兩點原因?qū)е铝似浜扛淖?，一是發(fā)酵過程中蔗糖在酸性條件下分解，二是由于醋酸發(fā)酵階段伴隨著乙醇發(fā)酵成乙酸的氧化反應(yīng)、氨基酸與糖的美拉德反應(yīng)、有機酸與醇類結(jié)合成芳香酯的酯化反應(yīng)等各類化學(xué)反應(yīng)。蘋果醋[23]在發(fā)酵過程中多糖含量也呈類似趨勢。

2.5 香蕉醋發(fā)酵過程中多酚和總黃酮的變化

多酚類化合物是指分子結(jié)構(gòu)中有若干個酚性羥基的植物成分總稱，包括單寧類、總黃酮類、酚酸類以及花色苷類等，具有一定的呈色作用[9]。香蕉醋發(fā)酵過程中多酚和總黃酮的變化見圖5。

由圖5 可知，在香蕉醋發(fā)酵過程中，發(fā)酵液多酚含量呈先下降后上升的趨勢，發(fā)酵初期，多酚含量為7.73 mg/100 mL，在第2 天下降至6.54 mg/100 mL，在2 d～6 d，多酚含量呈上升趨勢，最后發(fā)酵結(jié)束時多酚含量為9.02 mg/100 mL，比發(fā)酵前提高了14.3%。在醋酸發(fā)酵的過程中，多酚容易被多酚氧化酶氧化偶合成紅棕色或褐色的醌類產(chǎn)物，令香蕉醋色澤發(fā)生改變，也有可能是醋酸菌分解或吸附[24]，從而出現(xiàn)多酚含量波動的現(xiàn)象。龍眼醋的多酚含量在發(fā)酵過程中也出現(xiàn)類似波動[25]。

圖5 香蕉醋發(fā)酵過程中多酚和總黃酮的變化Fig.5 Changes of polyphenols and total flavonoids during the fermentation of banana vinegar

黃酮類化合物是一類以2-苯基色原酮為母核的化合物，研究發(fā)現(xiàn)，總黃酮具有降血脂、抗氧化、抑菌等功效，是評價香蕉醋保健作用的重要指標(biāo)。由圖5 可知，在香蕉醋發(fā)酵過程中，總黃酮含量整體呈下降趨勢，在發(fā)酵的0～1 d，總黃酮降低了27.6%，在1 d～3 d，發(fā)酵液總黃酮降低了6.1%，在4 d～6 d，發(fā)酵液總黃酮含量增加，發(fā)酵結(jié)束時，發(fā)酵液總黃酮為7.00 mg/100 mL。FangFang 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，果醋中的糖可能與游離態(tài)總黃酮結(jié)合形成配糖體，隨著發(fā)酵的進行發(fā)生部分水解，因此總黃酮在發(fā)酵過程中呈波動下降現(xiàn)象，柿醋[27]的總黃酮在發(fā)酵過程也呈波動下降趨勢。

在香蕉醋發(fā)酵的過程中，多酚和總黃酮的含量變化趨勢不同，總黃酮是多酚的一種，在發(fā)酵過程中，醋酸菌將乙醇氧化成醋酸，發(fā)酵液乙醇含量降低，使多酚和總黃酮的溶解度降低或被氧化[9]，從而導(dǎo)致其含量降低。

2.6 香蕉醋發(fā)酵過程中氨基酸的變化

氨基酸是蛋白質(zhì)在特定條件下的水解產(chǎn)物，氨基酸是微生物良好的氮源，使醋具有鮮美醇厚的味道，是果醋重要的呈味物質(zhì)。香蕉醋發(fā)酵過程中氨基酸種類及含量的變化見表1。

由表1 可知，在香蕉醋發(fā)酵過程中，氨基酸總量呈先上升后下降的趨勢，與圖3 對比發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵前期，蛋白質(zhì)不斷分解，蛋白質(zhì)含量下降，氨基酸總量增加。香蕉醋中含有17 種游離氨基酸，其中含量最高的是丙氨酸，其次是組氨酸、纈氨酸、亮氨酸。隨著發(fā)酵時間的增加，必需氨基酸總量與游離氨基酸總量的比值增大，必需氨基酸總量和非必需氨基酸總量的比值增大，發(fā)酵結(jié)束時，香蕉醋必需氨基酸中纈氨酸、亮氨酸、賴氨酸、異亮氨酸含量較高，均大于6 mg/100 mL，與秦紅艷等[28]研究接近，此外香蕉醋的E/T=0.41，E/N=0.70，均與世界衛(wèi)生組織與聯(lián)合國糧農(nóng)組織提出的參考蛋白模式E/T=0.4，E/N=0.6 更為接近，說明香蕉酒發(fā)酵成香蕉醋，必需氨基酸的配比趨于合理，更符合人體營養(yǎng)需求。

表1 香蕉醋發(fā)酵過程中氨基酸種類及含量的變化Table 1 Changes of amino acid content and kinds in banana vinegar during the fermentation of banana vinegar mg/100 mL

2.7 香蕉醋發(fā)酵過程中有機酸的變化

有機酸是果醋的主要呈酸物質(zhì)，有機酸的種類和含量決定了香蕉醋的主要口感。香蕉醋發(fā)酵過程中有機酸種類及含量的變化見表2。

從表2 可知，香蕉醋中有7 種有機酸，分別為醋酸、琥珀酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、草酸。其中醋酸含量最高，為17.91 g/L，乳酸、檸檬酸、琥珀酸含量較高，均大于5 g/L，這4 種是香蕉醋發(fā)酵過程中的主要有機酸。在香蕉醋發(fā)酵過程中，醋酸菌在乙醇脫氫酶的作用下不斷將酒精氧化成醋酸，醋酸含量逐漸增加，發(fā)酵結(jié)束時，醋酸含量占總有機酸的49.33%，醋酸含量較發(fā)酵初期提高了161.84%，是構(gòu)成香蕉醋的主要酸味成分。乳酸是發(fā)酵初期含量最多的有機酸，在發(fā)酵前期，乳酸含量迅速下降后趨于穩(wěn)定的狀態(tài)，可能是醋酸菌把乳酸分解導(dǎo)致其降低，乳酸占有機酸的比例由發(fā)酵初期的36.17%降低至16.36%。檸檬酸的變化趨勢與乳酸一樣，但是變化范圍比乳酸小。琥珀酸在醋酸發(fā)酵過程中緩慢上升，后期含量變化不大，琥珀酸是微生物利用糖類物質(zhì)的發(fā)酵產(chǎn)物。酒石酸和草酸在香蕉醋中含量較低，變化不大。發(fā)酵結(jié)束，香蕉醋里有機酸含量從高到低依次為醋酸、琥珀酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、草酸。

表2 香蕉醋發(fā)酵過程中有機酸種類及含量的變化Table 2 Changes of organic acid kinds and content in banana vinegar during the fermentation of banana vinegar

3 結(jié)論

以酒精度4%vol～5%vol 的澄清香蕉酒為原料，采用固定化發(fā)酵法生產(chǎn)香蕉醋，通過測定發(fā)酵期間主要成分的變化來分析不同時期的香蕉醋品質(zhì)。結(jié)果表明：香蕉醋發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時間的增加，pH 值和酒精度等指標(biāo)降低；總酸、可溶性固形物等成分含量增加；蛋白質(zhì)、氨基酸等成分含量波動變化后趨于穩(wěn)定。經(jīng)過固定化發(fā)酵得到的香蕉醋主要理化指標(biāo)為pH 3.55、總酸3.80 g/100 mL、褐變值0.72、透光率91.13%、可溶性固形物4.80%、蛋白質(zhì)5.10 mg/100 g、總糖0.74 g/100 g、還原糖0.09 g/100 g、多酚9.02 mg/100 mL、總黃酮6.99 mg/100 mL、氨基酸總量115.00 mg/100 mL、有機酸總量36.31 g/L，符合GB/T 30884—2014《蘋果醋飲料》的理化要求。以玉米芯為載體，采用固定化發(fā)酵法生產(chǎn)香蕉醋，簡化了菌種擴大培養(yǎng)，縮短發(fā)酵時間，實現(xiàn)了菌種重復(fù)利用和香蕉醋連續(xù)化生產(chǎn)，為香蕉醋的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論指導(dǎo)和技術(shù)經(jīng)驗，豐富市場果醋種類。