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        無前導(dǎo)肽細菌素的研究進展及在食品保藏中的應(yīng)用

        2021-03-15 01:56:24張曉峰王丹戶萌菲孫西玉潘春梅
        食品研究與開發(fā) 2021年5期
        關(guān)鍵詞:肽鏈前導(dǎo)殘基

        張曉峰,王丹,戶萌菲,孫西玉,潘春梅

        (河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院食品與生物工程學(xué)院,河南鄭州450046)

        細菌素是細菌在代謝過程中由核糖體合成的、對產(chǎn)生菌具有自身免疫性的一類具有抗菌活性的多肽類物質(zhì)[1]。細菌素在生物合成、作用模式、抗性機制及抗菌活性方面與抗生素存在明顯不同,被認為是抗生素的最佳替代品之一[2]。據(jù)統(tǒng)計,一半以上的細菌可產(chǎn)生不同種類的細菌素[3]。隨著大量微生物基因組的公布和細菌素在線比對工具的應(yīng)用,越來越多的細菌素被發(fā)現(xiàn)和鑒定。Xin B Y 等通過在線比對工具BAGEL3對GenBank 中的223 株蘇云金芽胞桿菌基因組的細菌素基因簇進行預(yù)測,從77 個菌株的基因組中預(yù)測到了101 個羊毛硫細菌素的基因簇,通過對部分預(yù)測結(jié)果進行驗證,最后獲得了含有4 條肽鏈的新型羊毛硫細菌素thuricin4A[4]。目前研究的最多、最深入的是來源于乳酸菌的羊毛硫細菌素[5]。雖然1951 年就提出細菌素可作為防腐劑在食品中使用,然而,迄今為止僅有廣譜活性細菌素nisin 和pediocinPA-1 被授權(quán)做為食品保藏劑使用[6]。所以,開發(fā)新型的、具有廣譜活性的細菌素具有廣泛的應(yīng)用前景[7]。不同于大多數(shù)細菌素,無前導(dǎo)肽細菌素是細菌素家族中一類由核糖體合成的、不進行任何翻譯后修飾的、N 端沒有前導(dǎo)肽序列的細菌素[8]。該類細菌素遺傳結(jié)構(gòu)簡單,抗菌機制獨特,產(chǎn)生菌多來源于食品且易于在其它微生物中表達,適合通過生物工程進行規(guī)?;a(chǎn),具有巨大的商業(yè)應(yīng)用潛能。目前已有近20 種無前導(dǎo)肽細菌素被鑒定和報道,本文對該類細菌素的類型、理化特性、生物合成、作用機制及在食品保藏中的應(yīng)用進行了綜述,使人們深入理解無前導(dǎo)肽細菌素的特性和優(yōu)勢,為其進一步應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

        1 無前導(dǎo)肽細菌素的類型

        細菌素的分類有不同的方法,目前廣泛接受的是由Cotter 等在2013 年修訂后的分類方案,按照該分類方案,細菌素主要分為I 類細菌素(也稱為翻譯后可修飾細菌素)和II 類細菌素(也稱為翻譯后非修飾細菌素)兩類。其中I 類細菌素主要包含羊毛硫細菌素等可修飾細菌素。II 類細菌素又分為5 小類,IIa 類為pediocinPA-1 類細菌素,如pediocinPA-1;IIb 類為由兩條肽鏈組成的具有協(xié)同作用的二肽細菌素,如lactacinF;IIc 類為環(huán)肽類細菌素,如enterocinAS-48;IId 類為非修飾的、線狀的、不屬于pediocinPA-1 的細菌素,如microcinS、無前導(dǎo)肽細菌素等;IIe 類為具有鐵載體修飾的羧基末端富含絲氨酸的細菌素,如microcin E492。另外,2016 年,Alvarez 等[9]在前人基礎(chǔ)上對來源于乳酸菌的細菌素進行了分類,該分類方案同樣將細菌素主要分為修飾細菌素和非修飾細菌素兩大類(I類和II 類),其中環(huán)肽類細菌素被作為I 類細菌素,無前導(dǎo)肽細菌素被作為II 類細菌素中的一小類。無論哪種分類方案,無前導(dǎo)肽細菌素都屬于比較特殊的一類。

        首次報道的無前導(dǎo)肽細菌素是1998 年由菌株E.faecium L50 產(chǎn)生的細菌素enterocinL50 (entL50),該細菌素含有兩條肽鏈,分別為enterocinL50-A(entL50-A)、enterocinL50-B(entL50-B)[10]。除此之外,到目前為止已經(jīng)對來自不同種屬細菌的多個無前導(dǎo)肽細菌素進行了報道,分別有來自屎腸球菌的enterocinQ(entQ)、enterocinK1(entK1);來自糞腸球菌的enterocinEJ97(entEJ97)、enterocin7(ent7,與報道的enterocinMR10相同),ent7 含有兩條肽鏈,分別為enterocin7-A(ent7-A)、enterocin7-B(ent7-B);來自金黃色葡萄球菌的aureocinA53(aurA53)、aureocinA70(aurA70),aurA70 含有4 條肽鏈,分別為aureocinA70-A(aurA70-A)、aureocinA70-B(aurA70-B)、aureocinA70-C(aurA70-C)、aureocinA70-D(aurA70-D);來自表皮葡萄球菌的epidermicinNI01(epiNI01);來自乳酸乳球菌的lacticinQ (lnqQ)、lacticinZ(lnqZ)、lsbB、lactolisterinBU(LliBU);來自鼠鏈球菌的BHT-B,來自希臘魏氏桿菌的weisselicinY(welY)、weisselicinM(welM);來自格氏乳球菌的garvicinKS(garKS),garKS 含有3 條肽鏈,分別為garvicinKS-A(garKS-A)、garvicinKS-B(garKSB)、garvicinKS-C(garKS-C);來自蠟樣芽胞桿菌的cereucinX(cerX)、cereucinH(cerH)、cereucinV(cerV),它們是經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測后化學(xué)合成的無前導(dǎo)肽細菌素,其中cerX 含有3 條肽鏈,分別為cereucinX-A(cerX-A)、cereucinX-B(cerX-B)、cereucinX-C(cerXC),cerH 含有4 條肽鏈,分別為cereucinH-A(cerHA)、cereucinH-B(cerH-B)、cereucinH-C(cerH-C)、cereucinH-D(cerH-D),cerV 含有3 條肽鏈,分別為cereucinV-A (cerV-A)、cereucinV-B (cerV-B)、cereucinV-C(cerV-C)[11-12]。根據(jù)組成無前導(dǎo)肽細菌素的氨基酸序列,采用在線軟件clustal omega 對其氨基酸序列一致性進行比對,結(jié)果如圖1 所示。

        由圖1 可見,根據(jù)組成細菌素的氨基酸序列一致性,無前導(dǎo)肽細菌素可以明顯分為a、b、c、d 4 類,其中a 類無前導(dǎo)肽細菌素肽鏈的N 端和C 端氨基酸序列都較保守,N 端保守序列為MXXXAKXXXK(X 為任意氨基 酸),C 端 保 守 序 列 為GWXXXKKXYXXXMQ-FIGXGW,包括welY、ent7 和entL50;b 類富含甘氨酸和丙氨酸,包括aur70、garKS、cerX、cerH、cerV;c 類N端較保守而C 端相對不保守,其中N 端保守序列為AXXGXKXV,包括lliBU、BHT-B、aur53、epiNI01、lnqQ及l(fā)nqZ;d 類C 端較保守而N 端相對不保守,其中C端保守序列為KXXXGXXPWE,包括entQ、lsbB、entEJ97 和entK1。

        圖1 無前導(dǎo)肽細菌素氨基酸序列比對結(jié)果Fig.1 Amino acid sequence alignment results of leaderless bacteriocins

        2 無前導(dǎo)肽細菌素的生物合成

        通常,細菌素的合成分為3 個過程,首先合成無活性的、N 端含有前導(dǎo)肽序列的前體肽,前體肽在修飾酶的作用下進行翻譯后修飾,最后除去前體肽中的前導(dǎo)肽序列從而變?yōu)橛谢钚缘某墒祀腫13]。前導(dǎo)肽是細菌素生物合成酶的識別位點,是酶-底物相互作用所必需的,并對細菌素產(chǎn)生菌有保護作用[14]。大部分細菌素前導(dǎo)肽的切割和分泌需要其專門的前導(dǎo)肽序列,前導(dǎo)肽在細菌素的生物合成中起重要作用[15]。長期以來人們認為前導(dǎo)肽是細菌素生物合成所必需的,然而,無前導(dǎo)肽細菌素的生物合成過程卻不形成前導(dǎo)肽序列,在翻譯后不經(jīng)任何修飾即轉(zhuǎn)變有活性的成熟肽。如aurA53 的生物合成除結(jié)構(gòu)基因外幾乎不需要其它遺傳信息,類似簡單的遺傳組織在entL50 中也有發(fā)現(xiàn)[16]。另外,除welM、welY 的結(jié)構(gòu)基因位于不同操縱子外,其余由同一菌株所產(chǎn)細菌素的各條肽鏈結(jié)構(gòu)基因均存在于同一操縱子內(nèi),并且肽鏈之間存在協(xié)同效應(yīng),包括ent7、entL50、aurA70、garKS、cerX、cerH、cerV。無前導(dǎo)肽細菌素這種簡單的遺傳組織使其很容易與其它微生物蛋白的N 端擴展融合,因此也更容易被其它細菌、真菌或真核細胞表達。如來源于乳酸乳球菌的lnqQ 和來源于金黃色葡萄球菌的aurA53 能夠在大腸桿菌E.coli BL21 中大量表達,另外lnqQ 也已在枯草芽胞桿菌中成功表達[17]。來源于E.faecium L50 的細菌素entL50-A 和entL50-B 也已經(jīng)在釀酒酵母和畢赤酵母中成功表達[18-19]。

        3 無前導(dǎo)肽細菌素的理化特征

        無前導(dǎo)肽細菌素因其肽鏈N 端不含前導(dǎo)肽序列而得名,無前導(dǎo)肽細菌素通常含27 個~53 個氨基酸,肽鏈相對較短,相對分子質(zhì)量在2.7 kDa~6.1 kDa 之間,富含賴氨酸殘基而缺少半胱氨酸殘基。研究顯示,大多數(shù)無前導(dǎo)肽細菌素N 端的甲硫氨酸殘基進行了甲酰化,形成了N-甲酰甲硫氨酸,如aurA53、lnqQ、lsbB、garKS、aurA70、ent7、welY、welM 等,但其功能一直未知。在大腸桿菌菌株E.coli BL21 中異源表達的lnqQ、aurA53 都不含甲酰甲硫氨酸殘基,但其保持有完整的生物活性。lnqZ、lnqQ 中甲酰甲硫氨酸殘基的去除也不影響其抗菌活性??梢姡琋 端的甲酰甲硫氨酸殘基并不影響無前導(dǎo)肽細菌素的抗菌活性。另外,所有無前導(dǎo)肽細菌素都帶2 個~8 個不等的正電荷,有較高的等電點,通常大于9,由于其氨基酸序列的差異,細菌素的親水疏水作用各不相同。例如,ent7-A 和ent7-B 分別含有44、43 個氨基酸殘基,7 個正電荷,等電點分別為10.68、10.95,水溶液中具有高度的結(jié)構(gòu)性。lnqQ 含有53 個氨基酸殘基,其中有8 個賴氨酸和4個色氨酸殘基,帶有8 個正電荷,等電點為10.7。aurA53 含有51 個氨基酸殘基,其中10 個賴氨酸和5 個色氨酸殘基,帶有8 個正電荷,等電點為10.8,對蛋白酶不敏感,在水溶液中呈剛性結(jié)構(gòu)[20]。lsbB 含30 個氨基酸殘基,帶有6 個正電荷,等電點為10.75[21]。

        另外,除lsbB 僅對乳酸乳球菌有活性外,多數(shù)無前導(dǎo)肽細菌素有廣譜抑菌活性,特別是對食品腐敗菌李斯特菌屬的微生物。值得注意的是garKS 對革蘭氏陰性菌Acinetobacter baumannii B1162 等有抑菌活性,而ent7-A、ent7-B 對革蘭氏陰性菌Brevundimonas diminuta 有抑菌活性。部分無前導(dǎo)肽細菌素抑菌譜見表1。

        表1 部分無前導(dǎo)肽細菌素的抑菌譜Table 1 Antibacterial spectrum of part leaderless bacteriocins

        4 無前導(dǎo)肽細菌素的抗菌機制

        理解細菌素抗菌機制是其能夠進行廣泛應(yīng)用的基礎(chǔ)和關(guān)鍵,而三維結(jié)構(gòu)的解析對理解細菌素的抗菌機制有重要作用。第一個三維結(jié)構(gòu)被解析的無前導(dǎo)肽細菌素是ent7-A、ent7-B,除此之外,到目前為止,aurA53、lnqQ、lsbB 的三維結(jié)構(gòu)也已獲得解析,因此,它們的抑菌機制可認為是無前導(dǎo)肽細菌素抗菌機制的代表。

        核磁共振的結(jié)構(gòu)解析顯示,ent7-A、ent7-B、aurA53 及l(fā)nqQ 具有相似的三維結(jié)構(gòu),它們的N 末端和C 末端均由兩親性的α-螺旋構(gòu)成,其三維結(jié)構(gòu)高度折疊,表面含有較高的陽離子,疏水殘基位于核心而親水殘基暴露于溶劑,形成親水的表面區(qū)域,但也有某些疏水氨基酸暴露溶劑使其表面形成一定的疏水區(qū)域。如aurA53 中所有的賴氨酸殘基位于表面,5 個色氨酸中有4 個暴露于表面,形成一定的疏水區(qū)域。但lsbB 的三維結(jié)構(gòu)顯示其N 末端為α-螺旋,C 末端無結(jié)構(gòu),在水溶液中呈非結(jié)構(gòu)狀態(tài)[22]。

        通常細菌素通過與靶標細胞膜上的特定受體結(jié)合形成“孔道”結(jié)構(gòu)破壞細胞膜或抑制細胞壁的形成,發(fā)揮抑菌作用,如羊毛硫細菌素nisin 是通過與靶標細胞膜上的細胞壁合成前體脂質(zhì)II 綁定形成“孔道”并抑制細胞壁的合成從而抑制細菌生長[23]。細菌素pediocinPA-1 通過與靶標細胞膜上的甘露糖磷酸轉(zhuǎn)移酶綁定形成“孔道”而獲得抗菌活性[24]。與大多數(shù)細菌素的作用機制不同,無前導(dǎo)肽細菌素ent7-A、ent7-B、aurA53 及l(fā)nqQ 發(fā)揮抑菌作用卻不需要任何受體參與。lnqQ 首先通過靜電吸引與帶負電的靶標細胞膜結(jié)合,然后通過滲透在靶標細胞膜上形成“環(huán)形孔”使細胞內(nèi)容物泄露而殺死細菌[25],也有報道稱細菌素lnqQ并不形成“環(huán)形孔”,而是通過羥自由基的積累來殺死靶標細菌的[26]。aurA53 既不需要任何特殊受體,也不形成“孔道”結(jié)構(gòu),而是滲透到靶標細胞膜后使重要分子泄露、膜電位消失、大分子合成終止而發(fā)揮抗菌作用。有研究顯示,aurA53 與中性細胞膜的相互作用強于陰性細胞膜,推測其疏水作用在與靶標細胞膜的相互作用過程中發(fā)揮重要作用。同樣,ent7-A、ent7-B 也是通過靜電吸引和疏水作用與靶標細胞膜結(jié)合,隨后α-螺旋解旋,疏水核暴露并插入膜靶標細胞膜中[27]。然而,研究顯示,lsbB 卻需要受體介導(dǎo)來發(fā)揮抑菌作用,其C末端最外的8 個氨基酸序列為受體結(jié)合部分,lsbB 需要與靶標細胞膜上的受體鋅依賴的金屬肽酶結(jié)合,從而導(dǎo)致靶標細胞膜破壞而發(fā)揮抗菌作用,但帶正電荷的lsbB 與帶負電荷的靶標細胞膜之間的靜電作用對其與受體的結(jié)合有重要影響。由此可見,靜電吸引在無前導(dǎo)肽細菌素的抗菌機制中發(fā)揮重要作用,所有無前導(dǎo)肽細菌素均帶有正電荷,這使其更易與帶負電荷的靶標細胞相互作用而減少對特定受體的依賴,可能也是其擁有廣譜抗菌活性的原因之一,這種機制與多細胞生物的小陽離子抗菌肽(20 個~40 個殘基)的膜滲透作用類似[28]。另外,疏水作用在無前導(dǎo)肽細菌素的抗菌機制中也發(fā)揮重要作用,如ent7-A、ent7-B、aurA53 及l(fā)nqQ 雖然具有極其相似的三維結(jié)構(gòu),但由于氨基酸序列的差異仍使其具有不同的抗菌活性,這可能與其不同的疏水作用相關(guān)。

        5 無前導(dǎo)肽細菌素在食品中的應(yīng)用

        單核細胞增生性李斯特菌(單增李斯特菌)、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、芽胞桿菌等都是導(dǎo)致食品污染或腐敗的常見微生物。如單增李斯特菌是一種食源性病原菌,其廣泛存在于水、土壤、植物中。該菌可污染牛奶、肉制品、蔬菜等食品,在加工運輸和冷藏條件下均可生長。單增李斯特菌是人畜共患菌,可引起人和動物腦膜炎、敗血癥、胃腸炎等疾病,威脅人類生命與健康[29-31]。許多無前導(dǎo)肽細菌素是由食品中分離的微生物產(chǎn)生的,如細菌素aurA53、aurA70、garKS、lsbB是由分離自商品牛奶或奶酪中的微生物產(chǎn)生的,ent7是從碎牛肉中分離到的微生物產(chǎn)生的,welY、welM 是由分離自日本泡菜桶中的微生物產(chǎn)生的,它們很多是食品級乳酸菌產(chǎn)生的,如garKS、lsbB、ent7、welY、welM等,這種特性使其在食品中的應(yīng)用具有先天的安全性。多數(shù)無前導(dǎo)肽細菌素對革蘭氏陽性細菌有廣泛的抑菌活性,尤其是單增李斯特菌。雖然多數(shù)無前導(dǎo)肽細菌素對革蘭氏陰性細菌無活性,但與其它抑菌物質(zhì)的聯(lián)合使用對很多食源性病原菌有協(xié)同抑菌作用。如garK 是由分離自原料牛乳中的乳酸菌Lc. garvieae KS1546 產(chǎn)生的含有3 條肽鏈的無前導(dǎo)肽細菌素,其與polymyxinB 聯(lián)合使用對不動桿菌和大腸桿菌有協(xié)同抑菌活性,與polymyxinB、nisin 聯(lián)合使用能夠快速殺滅并完全根除不動桿菌和大腸桿菌,與nisin 聯(lián)合使用對金黃色葡萄球菌有協(xié)同作用,與nisin、金合歡醇聯(lián)合使用在低濃度下能快速根除金黃色葡萄球菌[32]。

        另外,無前導(dǎo)肽細菌素沒有毒性,易降解而不易殘留,耐熱、耐酸堿,對某些抗生素抗性菌株有活性。如aurA53 對真核細胞無毒,沒有溶血活性,在4 ℃可至少存放48 周,在-20 ℃可保持72 周活性不變,對模擬胃液和膽鹽敏感,在模擬胃液3 h 活性喪失87.5%,對膽鹽90 min 喪失68.5%。aurA53 對接種單增李斯特菌的脫脂牛奶抑菌試驗表明,4 ℃條件下存放7 d 后,與對照相比,aurA53 可使牛奶中的活菌總數(shù)減少107.7 CFU/mL,aurA53 可作為保鮮劑應(yīng)用于牛乳產(chǎn)品[33-34]。ent7 除對單增李斯特菌、梭菌屬的細菌有活性外,還對耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌及耐萬古霉素的腸球菌有活性[35]。除此之外,無前導(dǎo)肽細菌素由于其簡單的遺傳組織使其更易于在其它微生物細胞中表達、更易于通過生物工程手段進行規(guī)?;a(chǎn)、更易于進行分子改造而生產(chǎn)出新型的、更具優(yōu)勢功能的細菌素。如通過在原生產(chǎn)菌株中增加garKS 基因簇的拷貝數(shù),優(yōu)化培養(yǎng)基成分,優(yōu)化培養(yǎng)條件使其表達量增加2 000 倍[36]。

        6 結(jié)論

        無前導(dǎo)肽細菌素是由核糖體合成的、N 端不含前導(dǎo)肽序列的一種細菌素,該類細菌素通常含27 個~53 個氨基酸,富含賴氨酸殘基而缺少半胱氨酸殘基,均帶有正電荷,有較高的等電點。根據(jù)氨基酸序列的一致性,該類細菌素可分為4 類。無前導(dǎo)肽細菌素具有相似的三維結(jié)構(gòu),作用于靶標細胞時受特定受體依賴較小,靜電作用和疏水作用在抑菌機制中發(fā)揮重要作用,多數(shù)具有廣譜抑菌活性,特別是對食品腐敗菌李斯特菌屬的微生物。無前導(dǎo)肽細菌素不需要前導(dǎo)肽序列就能生物合成,翻譯后不經(jīng)任何修飾或簡單的甲基化即可成為有活性的成熟肽,這種簡單的遺傳結(jié)構(gòu)更易被其它細菌、真菌或真核細胞表達,有利于通過生物工程進行大規(guī)模生產(chǎn),具有巨大的商業(yè)應(yīng)用潛能,無前導(dǎo)肽細菌素未來會在食品工業(yè)及其它領(lǐng)域有更廣泛的應(yīng)用。

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