景亞玲， 劉曉芳,2， 陳儉輝， 趙連芳**， 趙詠梅

(1.遂寧市中心醫(yī)院 產(chǎn)前診斷中心實(shí)驗(yàn)室， 四川 遂寧 629000； 2.遂寧市中心醫(yī)院 產(chǎn)科， 四川 遂寧 629000)

有研究報(bào)道，胎兒染色體異常占出生缺陷遺傳學(xué)病因的80%以上，常見類型有21-三體(唐氏綜合征)、18-三體(愛德華綜合征)及性染色體異常等，此類患兒大都伴有輕中度、甚至嚴(yán)重的智力障礙或結(jié)構(gòu)畸形[1-2]，目前尚無有效的方法治療該病，只能通過產(chǎn)前檢查盡早發(fā)現(xiàn)并及時(shí)終止妊娠來避免胎兒的出生。血清學(xué)篩查可以從一般孕婦人群中篩查出胎兒罹患18-三體或21-三體風(fēng)險(xiǎn)較高的孕婦[3]，而高齡孕婦由于其卵細(xì)胞質(zhì)量下降、生殖功能減退、生殖細(xì)胞或受精卵易發(fā)生染色體畸變或不分離等，導(dǎo)致胎兒染色體異常發(fā)生率較高，此類孕婦大多行羊水穿刺分析胎兒染色體核型，但羊水穿刺屬于有創(chuàng)檢測(cè)技術(shù)，存在誤傷胎兒、致畸、流產(chǎn)、宮內(nèi)感染等風(fēng)險(xiǎn)[4]。無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)(non-invasive prenatal testing，NIPT)由于簡(jiǎn)便、無創(chuàng)，并且對(duì)21、18、13號(hào)等染色體非整倍體異常的篩查具有較高的靈敏度、特異性及陽性預(yù)測(cè)值，越來越多的孕婦選擇先行NIPT檢測(cè)，如果NIPT陽性者再行介入性產(chǎn)前診斷[5]。本文旨在通過比較孕婦先行NIPT檢測(cè)(陽性者再行羊水穿刺)與直接行羊水穿刺間的胎兒染色體異常檢出情況，探討NIPT檢測(cè)在血清學(xué)篩查風(fēng)險(xiǎn)值異常孕婦及高齡孕婦中的臨床應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

統(tǒng)計(jì)2018年1月—2019年12月接受遺傳咨詢的血清學(xué)篩查風(fēng)險(xiǎn)值異常及高齡的單胎孕婦檢查的情況，以自愿選擇先行NIPT檢測(cè)、結(jié)果異常者再行羊水穿刺進(jìn)行胎兒染色體核型分析的孕婦作為NIPT組，以直接選擇羊水穿刺進(jìn)行胎兒核型分析的血清學(xué)篩查風(fēng)險(xiǎn)值異常孕婦及高齡孕婦作為羊水穿刺組。血清學(xué)篩查風(fēng)險(xiǎn)值異常包括：血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)、21-三體(T21)高風(fēng)險(xiǎn)及18-三體(T18)高風(fēng)險(xiǎn)，設(shè)定T21和T18高風(fēng)險(xiǎn)切割值(Cut Off)分別為1 ∶270和1 ∶350，大于Cut off值為高風(fēng)險(xiǎn)，風(fēng)險(xiǎn)值在Cut off 值到1 ∶1 000 的孕婦為臨界風(fēng)險(xiǎn)。孕婦預(yù)產(chǎn)期年齡≥35歲的歸為高齡孕婦。所有檢查者均嚴(yán)格簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)方法及診斷標(biāo)準(zhǔn) 采集孕婦靜脈血10 mL，離心分離血漿、提取血漿游離DNA、構(gòu)建文庫、文庫定量、BerryGenomics/Illumina NextSeq CN 500高通量測(cè)序機(jī)測(cè)序及數(shù)據(jù)分析，計(jì)算出13、18、21三條染色體和其它染色體Z值[6-7]。利用Z值評(píng)估樣本的風(fēng)險(xiǎn)值，Z為-3<～<3判定為非整倍體低風(fēng)險(xiǎn)， ≥3判定為非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)；NIPT結(jié)果提示異常者行羊水穿刺及胎兒核型分析，對(duì)NIPT低風(fēng)險(xiǎn)孕婦詳細(xì)解釋檢測(cè)結(jié)果及意義。

1.2.2羊水穿刺及核型分析 在無菌條件下，超聲引導(dǎo)定位抽取羊水20 mL，均分為2管，1 800 r/min 離心12 min，留取細(xì)胞懸液1.5 mL，采用平行法雙線，分別接種于加有GBICO培養(yǎng)基3 mL的2個(gè)培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d、換液、轉(zhuǎn)種，10 d左右根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況收取細(xì)胞。經(jīng)秋水仙堿終止羊水細(xì)胞生長(zhǎng)、物理法刮取羊水細(xì)胞、低滲、預(yù)固定、固定、再固定、滴片、烤片、胰酶消化及 Giemsa 染色制備羊水染色體片，經(jīng)蔡司 Axio Imager Z2 全自動(dòng)染色體掃描分析儀掃片，每個(gè)標(biāo)本至少分析8個(gè)核型，計(jì)數(shù)30個(gè)分裂相，有異常核型需增加分析和計(jì)數(shù)的個(gè)數(shù)。根據(jù)《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制(ISCN2016)》對(duì)所檢染色體進(jìn)行命名，本研究未統(tǒng)計(jì)染色體正常變異的核型結(jié)果。

1.2.3對(duì)妊娠或新生兒結(jié)局進(jìn)行隨訪 采用多種方式對(duì)所有研究對(duì)象妊娠或新生兒結(jié)局進(jìn)行隨訪。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 染色體異常檢出情況

結(jié)果顯示，NIPT組共納入1 198例，包括血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)546例、21-三體高風(fēng)險(xiǎn)160例、18-三體高風(fēng)險(xiǎn)5例及高齡孕婦487例；其中17例NIPT提示異常，經(jīng)羊水穿刺后確診胎兒染色體核型(表1)；羊水穿刺組共納入1 253例，包括血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)105例、21-三體高風(fēng)險(xiǎn)515例、18-三體高風(fēng)險(xiǎn)65例及高齡孕婦568例，其中33例核型異常(表2)。

表1 NIPT組17例NIPT異常的胎兒染色體核型及妊娠結(jié)局Tab.1 The karyotype and pregnancy outcome of 17 fetuses with abnormal NIPT in NIPT group

表2 羊水穿刺組33例核型異常胎兒的穿刺孕周、檢查指征及染色體核型Tab.2 Gestational age at puncture, examination correction, and chromosome karyotypes of 33 cases of fetus with abnormal karyotype in amniocentesis group

2.2 隨訪及染色體異常檢出率

結(jié)果顯示，NIPT 低風(fēng)險(xiǎn)的孕婦，其胎兒出生3個(gè)月后的隨訪暫未發(fā)現(xiàn)異常病例；在血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)、21-三體高風(fēng)險(xiǎn)、18-三體高風(fēng)及高齡指征2組孕婦的染色體異常檢出率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。見表3。

表3 NIPT組與羊水穿刺組的染色體異常檢出率Tab.3 Comparison of the detection rates between NIPT and amniocentesis groups

3 討論

血清學(xué)篩查風(fēng)險(xiǎn)值異常不僅可以提示懷有18-三體或21-三體胎兒的風(fēng)險(xiǎn)增高，還可以提示開放性神經(jīng)缺陷、宮內(nèi)發(fā)育遲緩和流產(chǎn)等的風(fēng)險(xiǎn)增加[8-9]；由于婚育觀念的改變和計(jì)劃生育政策的變化，我國(guó)高齡孕婦明顯增多[10]，而高齡會(huì)導(dǎo)致胎兒染色體異常發(fā)生率增高[11]，所以臨床工作中要注意這兩大類群體的進(jìn)一步產(chǎn)前檢查。當(dāng)臨床醫(yī)生建議臨界風(fēng)險(xiǎn)孕婦先行 NIPT 檢測(cè)異常者再行羊水穿刺，血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)孕婦及高齡孕婦直接行羊水穿刺術(shù)，孕婦出于緊張、焦慮和恐懼等自身原因，會(huì)出現(xiàn)臨界風(fēng)險(xiǎn)孕婦愿意直接做羊水穿刺確診胎兒染色體，但也有血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)孕婦和高齡孕婦不愿或有介入性產(chǎn)前診斷禁忌癥而不適行羊水穿刺術(shù)的情況。

血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)孕婦為 NIPT 的適用人群[12]。在充分知情同意情況下，本研究的651名臨界風(fēng)險(xiǎn)孕婦中，567名孕婦選擇先行 NIPT，只有7名孕婦NIPT提示異常(1.23%)需要接受侵入性產(chǎn)前診斷。由于孕周不適宜再等待、想要準(zhǔn)確率更高的檢測(cè)、追求“一步到位”等多種原因，另外的105名(16.13%)臨界風(fēng)險(xiǎn)孕婦選擇直接行羊水穿刺確診胎兒染色體核型，最終檢出21-三體2例(1.90%)，在臨界風(fēng)險(xiǎn)孕婦的 NIPT 組與羊水穿刺組的檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明對(duì)于臨界風(fēng)險(xiǎn)孕婦先行 NIPT 檢查可以顯著減少孕婦接受有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的例數(shù)。

研究表明血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)可以提示21三體和18-三體以外的其他多種染色體異常，如環(huán)狀染色體、易位染色體等[13-15]，所以血清學(xué)篩查高危孕婦如果僅行 NIPT 檢測(cè)而不行羊水穿刺，可能會(huì)存在漏診除染色體數(shù)目異常外的其它染色體異常類型的風(fēng)險(xiǎn)[12]。本研究有160名21-三體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦及5名18-三體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦選擇先行 NIPT，只有1例提示性染色體異常，后經(jīng)羊水穿刺診斷為45,X；其余515名21-三體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦和65名18-三體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦孕婦選擇直接羊水穿刺，檢出19例孕婦胎兒染色體有異常。且在2種高風(fēng)險(xiǎn)孕婦的 NIPT 組與羊水穿刺組的檢出率間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)，表明 NIPT 在血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)人群已具有十分良好的表現(xiàn)，NIPT 可以降低由于篩查高風(fēng)險(xiǎn)而接受介入性產(chǎn)前診斷病例數(shù)量、減輕產(chǎn)前診斷的工作量等[16-17]。

高齡孕婦胎兒多較為珍貴，由于介入性產(chǎn)前診斷存在重新穿刺、宮內(nèi)感染和流產(chǎn)等風(fēng)險(xiǎn)，所以高齡孕婦對(duì)介入性產(chǎn)前診斷的依從性并不高。本研究中有487名(46.16%)高齡孕婦共選擇先行 NIPT，9例NIPT提示異常，經(jīng)穿刺后檢出6例胎兒染色體有異常，其中1例核型分析結(jié)果為47,XXY 的高齡孕婦由于懷孕困難，選擇繼續(xù)妊娠，新生兒生殖器異常。其余568名(53.84%)高齡孕婦選擇直接行羊水穿刺，檢出12例胎兒染色體有異常。在高齡指征中NIPT 組與羊水穿刺組的檢出率間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明 NIPT 在高齡孕婦中也具有十分良好的表現(xiàn)。

在1 198例的NIPT組中，共有17例 NIPT 提示異常。其中1例提示17號(hào)染色體增加高風(fēng)險(xiǎn)，經(jīng)羊水穿刺確診為17號(hào)染色體三體嵌合體，該孕婦拒絕進(jìn)一步檢查，孕期超聲監(jiān)測(cè)未發(fā)現(xiàn)異常，后足月分娩，外周血核型正常、未見嵌合體，隨訪時(shí)孩子已經(jīng)7個(gè)月，生長(zhǎng)發(fā)育未見異常，主要考慮胎盤嵌合體、母體細(xì)胞污染、羊水培養(yǎng)細(xì)胞分化出畸形克隆和實(shí)驗(yàn)誤差等原因?qū)е碌募傩郧逗希援?dāng)產(chǎn)前診斷檢測(cè)出嵌合體時(shí)，應(yīng)采用染色體微陣列技術(shù)(chromosomal microarray analysis，CMA)、熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)和胎兒臍帶血核型等方法驗(yàn)證，并結(jié)合 B 超等結(jié)果，提供科學(xué)準(zhǔn)確的信息，減少正常胎兒的丟失[18]。本研究發(fā)現(xiàn)7例 NIPT 假陽性，NIPT 假陽性的可能原因是胎兒/胎盤嵌合體、雙胎之一胎死宮內(nèi)、母體嵌合體、母源性拷貝數(shù)變異、母源性惡性腫瘤，而性染色體由于 X 染色體含有較多的 GC 堿基和失活現(xiàn)象以及與 Y 染色體標(biāo)記序列的相似性等原因?qū)е聶z測(cè)準(zhǔn)確率較低[12,14,16,19]。NIPT 檢測(cè)也會(huì)出現(xiàn)假陰性的現(xiàn)象[16,20]。因此，要科學(xué)對(duì)待和處理 NIPT 結(jié)果，當(dāng)NIPT提示異常時(shí)應(yīng)當(dāng)進(jìn)行產(chǎn)前診斷以避免由于假陽性引起正常胎兒被引產(chǎn)，當(dāng) NIPT 陰性時(shí)應(yīng)加強(qiáng)后期B超等監(jiān)測(cè)，避免由于假陰性導(dǎo)致嚴(yán)重的染色體病患兒的出生，從而最大程度地達(dá)到優(yōu)生的目的[21]。

在1 253例的羊穿組中，發(fā)現(xiàn)33例染色體異常，其中有9例胎兒染色體異常結(jié)果若孕婦選擇先行 NIPT 檢查可能無法檢出，包括1例12-三體嵌合體、1例重復(fù)、4例平衡易位、2例羅伯遜易位和1例倒位，因此，臨床醫(yī)生有義務(wù)告知孕婦 NIPT 的局限性。遺傳咨詢后建議12號(hào)染色體三體嵌合體的孕婦進(jìn)一步檢查驗(yàn)證是否為假性嵌合體的干擾，但該孕婦拒絕進(jìn)一步檢查，選擇終止妊娠。9q21 區(qū)段重復(fù)的胎兒核型，經(jīng)追溯與其母親核型一致，孕期超聲監(jiān)測(cè)未發(fā)現(xiàn)異常，在充分告知胎兒可能會(huì)出現(xiàn)的情況后，該孕婦選擇繼續(xù)妊娠，隨訪至孩子1歲，生長(zhǎng)發(fā)育未見異常。染色體異常攜帶者在減數(shù)分裂過程中會(huì)產(chǎn)生不平衡配子，可能會(huì)有不孕不育、自然流產(chǎn)和染色體異?；純旱某錾蕊L(fēng)險(xiǎn)[22-23]。在充分告知胎兒可能會(huì)出現(xiàn)的異常情況后，本研究中的7例染色體異常攜帶者的孕婦均選擇繼續(xù)妊娠，且新生兒未見異常。

綜上所述，血清學(xué)篩查風(fēng)險(xiǎn)值異常可以提示除18-三體和21-三體以外的其他染色體異常，而高齡孕婦的年齡越大，胎兒染色體異常發(fā)生率越高。本研究表明 NIPT 檢測(cè)可作為產(chǎn)前診斷技術(shù)有效的輔助篩查方法，對(duì)于不愿或無法接受產(chǎn)前診斷的血清學(xué)篩查風(fēng)險(xiǎn)值異常孕婦和高齡孕婦能夠最大限度的降低不行產(chǎn)前診斷的風(fēng)險(xiǎn)。