王彬宇， 黃家宇， 杜秋瑩， 陳思憶， 魯婷婷， 李莉*

(貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 貴州 貴陽 550025)

赤脛散又名花蝴蝶、散血草，為蓼科蓼屬植物赤脛散(PolygonumruncinatumBuch.-Ham.var.sinenseHemsl.)的干燥根莖，是西南少數(shù)民族地區(qū)民間常用藥[1-2]，其性寒，味苦、澀，用于治療跌撲損傷、癰癤腫毒及風(fēng)濕痹痛等，具有清熱解毒、活血舒筋等功效[3-5]。赤脛散現(xiàn)收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2003年版中，其鑒別方法為與對照藥材薄層色譜法(thin layer chromatography ，TLC)定性鑒別，無含量測定項(xiàng)[6]。目前，國內(nèi)外對赤脛散的質(zhì)量研究較少，難以全面評價藥材質(zhì)量[7-9]。赤脛散主要含有酚酸、揮發(fā)油類成分[10-14]，其中沒食子酸具有抗炎抗氧化的藥理作用[15]；鞣花酸和3,3′-二甲基鞣花酸具有抗菌抗病毒活性[16-18]，毒副作用小，與赤脛散功能主治一致。基于此，本實(shí)驗(yàn)通過建立赤脛散高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)指紋圖譜，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)手段[19-26]進(jìn)行聚類分析、主成分分析及正交偏最小二乘判別分析，同時對沒食子酸、鞣花酸及3,3′-二甲基鞣花酸的含量進(jìn)行測定，為其質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥材來源 赤脛散藥材17批均為本省野生(表1)，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室龍慶德副教授鑒定為蓼科蓼屬植物赤脛散的干燥根莖。

表1 17批赤脛散樣品來源信息Tab.1 Source information of 17 batches of P. runcinatum

1.1.2主要試劑與儀器 沒食子酸對照品(批號110831-201204，中國食品藥品檢定研究院)，鞣花酸對照品(批號GZDD-0272，純度≥98%，貴州迪大科技有限責(zé)任公司)，3,3′-二甲基鞣花酸(批號160810，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)，水為純凈水，磷酸為分析純，乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純；ULtiMate 3000 型高效液相色譜儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]，MS105DU型電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)，KQ3200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1色譜條件 色譜柱為ACE C18-AR(250 mm×4.6 mm，5 μm)，檢測波長為254 nm，流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL；流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)；梯度洗脫為0～6 min、5%～15%A，6～20 min、15%～17%A，20～45 min、17%～30%A，45～60 min、30%～70%A。

1.2.2對照品溶液的制備 分別取沒食子酸、鞣花酸及3,3′-二甲基鞣花酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為1.12、1.11及0.96 g/L的單一對照品儲備液；分別精密量取上述對照品儲備液適量，加甲醇稀釋制成混合對照品溶液(每升含沒食子酸39.20 mg、鞣花酸255.30 mg及3,3′-二甲基鞣花酸28.80 mg)。

1.2.3供試品溶液的制備 取赤脛散藥材粗粉(過60目篩)約0.3 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加70%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，37 ℃超聲(功率150 W，頻率40 kHz)處理45 min，放冷，70%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1.2.4指紋圖譜的建立 (1)精密度試驗(yàn)：取赤脛散藥材粉末(編號S9)，按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，以鞣花酸的保留時間和峰面積為參考，計(jì)算各共有峰相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(rlative sandard deviation ，RSD)值。(2)重復(fù)性試驗(yàn)：取赤脛散藥材粉末(編號S9)，按“1.2.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測定，以鞣花酸的保留時間和峰面積為參考，計(jì)算各共有峰RSD值。(3)穩(wěn)定性試驗(yàn)：取赤脛散藥材粉末(編號S9)，按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下放置，于0、2、4、8、12及24 h時按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測定，以鞣花酸的保留時間和峰面積為參考，計(jì)算各共有峰RSD值。(4)赤脛散指紋圖譜的建立：分別取17批赤脛散藥材粉末，按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測定，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012年版)軟件，將S1樣品色譜圖設(shè)為參照圖譜，中位數(shù)法，時間窗寬度0.2 min，生成對照圖譜，進(jìn)行指紋圖譜的建立、共有峰的指認(rèn)與相似度分析。

1.2.5含量測定 (1)線性關(guān)系考察：取“1.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，加甲醇逐級稀釋，制成系列濃度混合對照品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以各成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到3種成分各自線性范圍及相關(guān)系數(shù)(r)。(2)精密度試驗(yàn)：取赤脛散藥材粉末(編號S9)，按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積，計(jì)算3種成分RSD值。(3)重復(fù)性試驗(yàn)：取赤脛散藥材粉末(編號S9)，按“1.2.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，以“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算3種成分RSD值。(4)穩(wěn)定性試驗(yàn)：取赤脛散藥材粉末(編號S9)，按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下放置，于0、2、4、8、12、24 h時以“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算3種成分RSD值。(5)加樣回收率試驗(yàn)：精密稱取已知含量的同一批赤脛散藥材粉末(編號S9)0.15 g，共6份，分別置于100 mL具塞錐形瓶瓶中，加入各單一對照儲備液適量，按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算3種成分的加樣回收率及其RSD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 23.0軟件，采用組間聯(lián)接法、選擇歐式平方距離為度量，對17批赤脛散共有峰峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析；應(yīng)用SIMCA 14.1軟件對17批赤脛散樣品共有峰峰面積進(jìn)行主成分分析，繪制主成分分析得分圖(以特征值>1作為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算其累積方差貢獻(xiàn)率與特征值)，同時進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析，得到得分圖[以變量重要性投影值(very important person，VIP)值>1作為標(biāo)準(zhǔn)，得到可能引起赤脛散樣品間質(zhì)量差異的主要標(biāo)志性成分]。

2 結(jié)果

2.1 赤脛散藥材指紋圖譜的建立和方法學(xué)考察

2.1.1指紋圖譜方法學(xué) 精密度試驗(yàn)中，測得各共有峰的相對保留時間RSD<0.09%，相對峰面積RSD<2.58%，說明儀器精密度良好。重復(fù)性試驗(yàn)中，測得各共有峰的相對保留時間RSD<0.18%，相對峰面積RSD<2.97%，說明方法重復(fù)性良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)中，測得各共有峰的相對保留時間RSD<0.23%，相對峰面積RSD<2.92%，表明樣品在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.2赤脛散藥材指紋圖譜的建立和共有峰的指認(rèn) 經(jīng)多點(diǎn)校正后進(jìn)行色譜峰重疊匹配，標(biāo)定了19個共有峰(圖1)。將樣品對照指紋圖譜與對照品的保留時間和紫外吸收光譜比對，指認(rèn)了3種成分，分別為2號峰(沒食子酸)、11號峰(鞣花酸)、19號峰(3,3′-二甲基鞣花酸)，其中11號峰(鞣花酸)為所有樣品中均含有，分離度較好，保留時間適中且峰面積最大，因此選其作為參照峰(S，圖2)。對17批赤脛散樣品進(jìn)行相似度計(jì)算，結(jié)果17批樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度為0.768～0.997(表2)，表明各產(chǎn)地樣品間整體質(zhì)量存在一定的差異。

注：1～19為共有峰編號。圖1 赤脛散樣品(17批)HPLC指紋圖譜疊加圖(S1～S17)及對照圖譜(R)Fig.1 HPLC fingerprints(S1～S17)and control fingerprint(R)of 17 batches of P. runcinatum

注：1～19為共有峰編號。圖2 對照品和對照指紋圖譜色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of substance control and control fingerprint

表2 赤脛散樣品(17批)相似度評價結(jié)果Tab.2 Results of similarity evaluation of 17 batches of P. runcinatum

2.2 化學(xué)模式識別分析

2.2.1聚類分析 當(dāng)距離為15時，可將17批樣品聚為2類，其中Ⅰ類包括S1～S6、S8、S9、S15及S17，Ⅱ類包括S7、S10～S14及S16。見圖3。

圖3 赤脛散樣品(17批)聚類分析圖Fig.3 Hierarchical cluster analysis for 17 batches of P. runcinatum

2.2.2主成分分析 主成分分析結(jié)果顯示，以特征值>1作為標(biāo)準(zhǔn)時，得到5個主成分，其累積方差貢獻(xiàn)率為89.427%；可將17批赤脛散樣品分為2類，其結(jié)果與聚類分析一致，S1～S6、S8、S9、S15及S17大多集中于一、四象限，S7、S10～S14及S16集中于二、三象限。見表3和圖4。

表3 主成分分析方差貢獻(xiàn)率與特征值Tab.3 Variance contribution rate and eigenvalue and of principal component analysis

注：t[1]為主成分1，t[2]為主成分2。圖4 赤脛散樣品(17批)主成分分析Fig.4 Score scatter plot of principal component analysis of 17 batches of P. runcinatum

2.2.3正交偏最小二乘判別分析 正交偏最小二乘判別分析結(jié)果表明，17批樣品可分為2類，結(jié)果與聚類分析、主成分分析一致；模型參數(shù)R2X(cum)=0.832，R2Y(cum)=0.980，均>0.5，說明模型穩(wěn)定且預(yù)測性好；繪制VIP圖，以VIP>1作為標(biāo)準(zhǔn)，色譜峰9、8、14、4、5、11、7、13、12及10為引起赤脛散樣品間質(zhì)量差異的主要標(biāo)志性成分。見圖5和圖6。

注：t[1]為主成分1，t[2]為主成分2。圖5 赤脛散樣品(17批)正交偏最小二乘判別分析Fig.5 Score scatter plots of orthogonal partial least square-discriminant analysis of 17 batches of P. runcinatum

圖6 赤脛散樣品(17批)正交偏最小二乘判別分析VIP值Fig.6 VIP values of common peaks in Orthogonal partial least square-discriminant analysis model of 17 batches of P. runcinatum

2.3 3種成分含量測定與方法學(xué)考察

2.3.1含量測定方法學(xué)考察結(jié)果 線性關(guān)系考察中，沒食子酸、鞣花酸及3,3′-二甲基鞣花酸在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(表4)；精密度試驗(yàn)中，測得沒食子酸、鞣花酸及3,3′-二甲基鞣花酸峰面積的RSD分別為0.38%、0.05%及2.01%，說明儀器精密度良好；重復(fù)性試驗(yàn)中，測得沒食子酸、鞣花酸及3,3′-二甲基鞣花酸峰面積的RSD分別為1.06%、0.18%及0.32%，說明方法重復(fù)性良好；穩(wěn)定性試驗(yàn)中，測得沒食子酸、鞣花酸及3,3′-二甲基鞣花酸峰面積的RSD分別為1.80%、0.56%及0.17%，表明樣品在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；加樣回收率試驗(yàn)中，平均回收率分別為103.48%、96.90%及98.61%，RSD值均<2.21%，說明加樣回收率良好(表5)。

表4 各成分線性范圍與回歸方程Tab.4 Regression equation and linear range of 3 components

表5 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of recovery test of 3 components

2.3.23種成分含量測定結(jié)果 含量測定結(jié)果表明，不同產(chǎn)地赤脛散中3種成分含量差異較大，見表6。

表6 赤脛散樣品(17批)3種成分含量測定結(jié)果Tab.6 Results of content determination of 3 components of 17 batches of samples

3 討論

本實(shí)驗(yàn)前期分別考察了8種提取溶劑(30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇及100%甲醇)，其中70%甲醇提取的樣品色譜峰豐富，峰型較好，能更全面地反映藥材信息；考察了不同樣品提取方式(超聲、回流)和提取時間(30、45、60及90 min)，結(jié)果表明超聲與回流各成分含有量無明顯差異，提取45 min后樣品有效成分含量較為接近，出于操作簡便及提取效率的考慮，最終選定超聲提取45 min；考察多種流動相體系梯度洗脫結(jié)果(乙腈-0.1%冰醋酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-水、甲醇-0.1%冰醋酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液及甲醇-水)，結(jié)果表明乙腈-0.1%磷酸溶液分離度較好、出峰快、色譜峰較多；考察了不同柱溫(25、30、35及40 ℃)，30 ℃時出峰時間合適，峰型良好；采用DAD檢測器收集200～400 nm全波長掃描下的紫外吸收圖譜，觀察3D圖譜發(fā)現(xiàn)254 nm下各測定成分色譜峰的響應(yīng)均較高，分離效果良好，基線穩(wěn)定。因此，最終實(shí)驗(yàn)條件定為采用70%甲醇為提取溶劑，超聲提取45 min，采用乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相、檢測柱溫為30 ℃，檢測波長為254 nm。

中藥材化學(xué)成分復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)前期采用超高效液相色譜—離子阱飛行時間高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀，得到赤脛散藥材中化合物分子量信息，將碎片離子信息與現(xiàn)有文獻(xiàn)比對[27-29]，經(jīng)初步鑒定后與對照品紫外吸收光譜比對，進(jìn)行化學(xué)成分的確定。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法建立了赤脛散的指紋圖譜，標(biāo)定了19個共有峰，指認(rèn)出3種有效成分并進(jìn)行含量測定。17批赤脛散樣品與對照圖譜相似度為0.768～0.997，各化學(xué)成分相對保留時間較為均一，但相對峰面積RSD值較大，不同批次間的同一成分含量也有所不同，說明樣品間化學(xué)成分相似，但含量差異較大。通過聚類分析、主成分分析及正交偏最小二乘判別分析等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法[23-26]對17批赤脛散指紋圖譜進(jìn)行綜合分析，建立樣品分類模型，發(fā)現(xiàn)了明顯聚類趨勢，將17批樣品聚為2類，如鞣花酸含量為1.180 4～15.212 8mg/g，Ⅰ類樣品鞣花酸含量在5.655 5mg/g以上且均高于Ⅱ類；以VIP值>1作為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出10種引起赤脛散質(zhì)量差異的主要標(biāo)志成分，Ⅰ類樣品該10種成分峰面積大多高于Ⅱ類；從藥材粉末外觀上看，Ⅰ類樣品為棕黃色，Ⅱ類樣品為棕紅色，與聚類分析結(jié)果一致。由于其均為野生，藥材產(chǎn)地、生長環(huán)境、海拔高度、儲藏條件及時間等多種因素均可能導(dǎo)致藥材化學(xué)成分降解或轉(zhuǎn)化，為保證赤脛散質(zhì)量，用藥過程中應(yīng)規(guī)范藥材來源、采收時間、儲藏條件并關(guān)注該10種成分的質(zhì)量變化，可將其作為藥材質(zhì)量評價指標(biāo)。

綜上所述，本研究建立了赤脛散HPLC指紋圖譜并同時測定3種有效成分含量，方法快速、操作簡便、分離度好、化學(xué)成分信息豐富，指紋圖譜定性結(jié)合有效成分定量，可彌補(bǔ)現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)與含量測定方法的不足，對赤脛散藥材進(jìn)行整體性評價并反映其內(nèi)在質(zhì)量，為進(jìn)一步質(zhì)量控制及藥材開發(fā)提供參考。