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        赤脛散指紋圖譜的建立及其3種化學(xué)成分含量的測定*

        2021-03-13 05:28:52王彬宇黃家宇杜秋瑩陳思憶魯婷婷李莉

        王彬宇, 黃家宇, 杜秋瑩, 陳思憶, 魯婷婷, 李莉*

        (貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院, 貴州 貴陽 550025)

        赤脛散又名花蝴蝶、散血草,為蓼科蓼屬植物赤脛散(PolygonumruncinatumBuch.-Ham.var.sinenseHemsl.)的干燥根莖,是西南少數(shù)民族地區(qū)民間常用藥[1-2],其性寒,味苦、澀,用于治療跌撲損傷、癰癤腫毒及風(fēng)濕痹痛等,具有清熱解毒、活血舒筋等功效[3-5]。赤脛散現(xiàn)收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2003年版中,其鑒別方法為與對照藥材薄層色譜法(thin layer chromatography ,TLC)定性鑒別,無含量測定項(xiàng)[6]。目前,國內(nèi)外對赤脛散的質(zhì)量研究較少,難以全面評價藥材質(zhì)量[7-9]。赤脛散主要含有酚酸、揮發(fā)油類成分[10-14],其中沒食子酸具有抗炎抗氧化的藥理作用[15];鞣花酸和3,3′-二甲基鞣花酸具有抗菌抗病毒活性[16-18],毒副作用小,與赤脛散功能主治一致。基于此,本實(shí)驗(yàn)通過建立赤脛散高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)指紋圖譜,并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)手段[19-26]進(jìn)行聚類分析、主成分分析及正交偏最小二乘判別分析,同時對沒食子酸、鞣花酸及3,3′-二甲基鞣花酸的含量進(jìn)行測定,為其質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1藥材來源 赤脛散藥材17批均為本省野生(表1),經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室龍慶德副教授鑒定為蓼科蓼屬植物赤脛散的干燥根莖。

        表1 17批赤脛散樣品來源信息Tab.1 Source information of 17 batches of P. runcinatum

        1.1.2主要試劑與儀器 沒食子酸對照品(批號110831-201204,中國食品藥品檢定研究院),鞣花酸對照品(批號GZDD-0272,純度≥98%,貴州迪大科技有限責(zé)任公司),3,3′-二甲基鞣花酸(批號160810,北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院),水為純凈水,磷酸為分析純,乙腈為色譜純,其余試劑均為分析純;ULtiMate 3000 型高效液相色譜儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司],MS105DU型電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司),KQ3200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

        1.2 方法

        1.2.1色譜條件 色譜柱為ACE C18-AR(250 mm×4.6 mm,5 μm),檢測波長為254 nm,流速為1 mL/min,柱溫為30 ℃,進(jìn)樣量為10 μL;流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B);梯度洗脫為0~6 min、5%~15%A,6~20 min、15%~17%A,20~45 min、17%~30%A,45~60 min、30%~70%A。

        1.2.2對照品溶液的制備 分別取沒食子酸、鞣花酸及3,3′-二甲基鞣花酸對照品適量,精密稱定,加甲醇制成濃度為1.12、1.11及0.96 g/L的單一對照品儲備液;分別精密量取上述對照品儲備液適量,加甲醇稀釋制成混合對照品溶液(每升含沒食子酸39.20 mg、鞣花酸255.30 mg及3,3′-二甲基鞣花酸28.80 mg)。

        1.2.3供試品溶液的制備 取赤脛散藥材粗粉(過60目篩)約0.3 g,精密稱定,置100 mL具塞錐形瓶中,精密加70%甲醇25 mL,密塞,稱定質(zhì)量,37 ℃超聲(功率150 W,頻率40 kHz)處理45 min,放冷,70%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量,經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得供試品溶液。

        1.2.4指紋圖譜的建立 (1)精密度試驗(yàn):取赤脛散藥材粉末(編號S9),按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次,以鞣花酸的保留時間和峰面積為參考,計(jì)算各共有峰相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(rlative sandard deviation ,RSD)值。(2)重復(fù)性試驗(yàn):取赤脛散藥材粉末(編號S9),按“1.2.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份,按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測定,以鞣花酸的保留時間和峰面積為參考,計(jì)算各共有峰RSD值。(3)穩(wěn)定性試驗(yàn):取赤脛散藥材粉末(編號S9),按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,室溫下放置,于0、2、4、8、12及24 h時按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測定,以鞣花酸的保留時間和峰面積為參考,計(jì)算各共有峰RSD值。(4)赤脛散指紋圖譜的建立:分別取17批赤脛散藥材粉末,按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測定,采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012年版)軟件,將S1樣品色譜圖設(shè)為參照圖譜,中位數(shù)法,時間窗寬度0.2 min,生成對照圖譜,進(jìn)行指紋圖譜的建立、共有峰的指認(rèn)與相似度分析。

        1.2.5含量測定 (1)線性關(guān)系考察:取“1.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液適量,加甲醇逐級稀釋,制成系列濃度混合對照品溶液,按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,以各成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制線性標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到3種成分各自線性范圍及相關(guān)系數(shù)(r)。(2)精密度試驗(yàn):取赤脛散藥材粉末(編號S9),按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,以“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定6次,記錄峰面積,計(jì)算3種成分RSD值。(3)重復(fù)性試驗(yàn):取赤脛散藥材粉末(編號S9),按“1.2.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份,以“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄峰面積,計(jì)算3種成分RSD值。(4)穩(wěn)定性試驗(yàn):取赤脛散藥材粉末(編號S9),按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,室溫下放置,于0、2、4、8、12、24 h時以“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測定,記錄峰面積,計(jì)算3種成分RSD值。(5)加樣回收率試驗(yàn):精密稱取已知含量的同一批赤脛散藥材粉末(編號S9)0.15 g,共6份,分別置于100 mL具塞錐形瓶瓶中,加入各單一對照儲備液適量,按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測定,記錄峰面積,并計(jì)算3種成分的加樣回收率及其RSD值。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        應(yīng)用SPSS 23.0軟件,采用組間聯(lián)接法、選擇歐式平方距離為度量,對17批赤脛散共有峰峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析;應(yīng)用SIMCA 14.1軟件對17批赤脛散樣品共有峰峰面積進(jìn)行主成分分析,繪制主成分分析得分圖(以特征值>1作為標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算其累積方差貢獻(xiàn)率與特征值),同時進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析,得到得分圖[以變量重要性投影值(very important person,VIP)值>1作為標(biāo)準(zhǔn),得到可能引起赤脛散樣品間質(zhì)量差異的主要標(biāo)志性成分]。

        2 結(jié)果

        2.1 赤脛散藥材指紋圖譜的建立和方法學(xué)考察

        2.1.1指紋圖譜方法學(xué) 精密度試驗(yàn)中,測得各共有峰的相對保留時間RSD<0.09%,相對峰面積RSD<2.58%,說明儀器精密度良好。重復(fù)性試驗(yàn)中,測得各共有峰的相對保留時間RSD<0.18%,相對峰面積RSD<2.97%,說明方法重復(fù)性良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)中,測得各共有峰的相對保留時間RSD<0.23%,相對峰面積RSD<2.92%,表明樣品在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        2.1.2赤脛散藥材指紋圖譜的建立和共有峰的指認(rèn) 經(jīng)多點(diǎn)校正后進(jìn)行色譜峰重疊匹配,標(biāo)定了19個共有峰(圖1)。將樣品對照指紋圖譜與對照品的保留時間和紫外吸收光譜比對,指認(rèn)了3種成分,分別為2號峰(沒食子酸)、11號峰(鞣花酸)、19號峰(3,3′-二甲基鞣花酸),其中11號峰(鞣花酸)為所有樣品中均含有,分離度較好,保留時間適中且峰面積最大,因此選其作為參照峰(S,圖2)。對17批赤脛散樣品進(jìn)行相似度計(jì)算,結(jié)果17批樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度為0.768~0.997(表2),表明各產(chǎn)地樣品間整體質(zhì)量存在一定的差異。

        注:1~19為共有峰編號。圖1 赤脛散樣品(17批)HPLC指紋圖譜疊加圖(S1~S17)及對照圖譜(R)Fig.1 HPLC fingerprints(S1~S17)and control fingerprint(R)of 17 batches of P. runcinatum

        注:1~19為共有峰編號。圖2 對照品和對照指紋圖譜色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of substance control and control fingerprint

        表2 赤脛散樣品(17批)相似度評價結(jié)果Tab.2 Results of similarity evaluation of 17 batches of P. runcinatum

        2.2 化學(xué)模式識別分析

        2.2.1聚類分析 當(dāng)距離為15時,可將17批樣品聚為2類,其中Ⅰ類包括S1~S6、S8、S9、S15及S17,Ⅱ類包括S7、S10~S14及S16。見圖3。

        圖3 赤脛散樣品(17批)聚類分析圖Fig.3 Hierarchical cluster analysis for 17 batches of P. runcinatum

        2.2.2主成分分析 主成分分析結(jié)果顯示,以特征值>1作為標(biāo)準(zhǔn)時,得到5個主成分,其累積方差貢獻(xiàn)率為89.427%;可將17批赤脛散樣品分為2類,其結(jié)果與聚類分析一致,S1~S6、S8、S9、S15及S17大多集中于一、四象限,S7、S10~S14及S16集中于二、三象限。見表3和圖4。

        表3 主成分分析方差貢獻(xiàn)率與特征值Tab.3 Variance contribution rate and eigenvalue and of principal component analysis

        注:t[1]為主成分1,t[2]為主成分2。圖4 赤脛散樣品(17批)主成分分析Fig.4 Score scatter plot of principal component analysis of 17 batches of P. runcinatum

        2.2.3正交偏最小二乘判別分析 正交偏最小二乘判別分析結(jié)果表明,17批樣品可分為2類,結(jié)果與聚類分析、主成分分析一致;模型參數(shù)R2X(cum)=0.832,R2Y(cum)=0.980,均>0.5,說明模型穩(wěn)定且預(yù)測性好;繪制VIP圖,以VIP>1作為標(biāo)準(zhǔn),色譜峰9、8、14、4、5、11、7、13、12及10為引起赤脛散樣品間質(zhì)量差異的主要標(biāo)志性成分。見圖5和圖6。

        注:t[1]為主成分1,t[2]為主成分2。圖5 赤脛散樣品(17批)正交偏最小二乘判別分析Fig.5 Score scatter plots of orthogonal partial least square-discriminant analysis of 17 batches of P. runcinatum

        圖6 赤脛散樣品(17批)正交偏最小二乘判別分析VIP值Fig.6 VIP values of common peaks in Orthogonal partial least square-discriminant analysis model of 17 batches of P. runcinatum

        2.3 3種成分含量測定與方法學(xué)考察

        2.3.1含量測定方法學(xué)考察結(jié)果 線性關(guān)系考察中,沒食子酸、鞣花酸及3,3′-二甲基鞣花酸在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(表4);精密度試驗(yàn)中,測得沒食子酸、鞣花酸及3,3′-二甲基鞣花酸峰面積的RSD分別為0.38%、0.05%及2.01%,說明儀器精密度良好;重復(fù)性試驗(yàn)中,測得沒食子酸、鞣花酸及3,3′-二甲基鞣花酸峰面積的RSD分別為1.06%、0.18%及0.32%,說明方法重復(fù)性良好;穩(wěn)定性試驗(yàn)中,測得沒食子酸、鞣花酸及3,3′-二甲基鞣花酸峰面積的RSD分別為1.80%、0.56%及0.17%,表明樣品在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好;加樣回收率試驗(yàn)中,平均回收率分別為103.48%、96.90%及98.61%,RSD值均<2.21%,說明加樣回收率良好(表5)。

        表4 各成分線性范圍與回歸方程Tab.4 Regression equation and linear range of 3 components

        表5 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of recovery test of 3 components

        2.3.23種成分含量測定結(jié)果 含量測定結(jié)果表明,不同產(chǎn)地赤脛散中3種成分含量差異較大,見表6。

        表6 赤脛散樣品(17批)3種成分含量測定結(jié)果Tab.6 Results of content determination of 3 components of 17 batches of samples

        3 討論

        本實(shí)驗(yàn)前期分別考察了8種提取溶劑(30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇及100%甲醇),其中70%甲醇提取的樣品色譜峰豐富,峰型較好,能更全面地反映藥材信息;考察了不同樣品提取方式(超聲、回流)和提取時間(30、45、60及90 min),結(jié)果表明超聲與回流各成分含有量無明顯差異,提取45 min后樣品有效成分含量較為接近,出于操作簡便及提取效率的考慮,最終選定超聲提取45 min;考察多種流動相體系梯度洗脫結(jié)果(乙腈-0.1%冰醋酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-水、甲醇-0.1%冰醋酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液及甲醇-水),結(jié)果表明乙腈-0.1%磷酸溶液分離度較好、出峰快、色譜峰較多;考察了不同柱溫(25、30、35及40 ℃),30 ℃時出峰時間合適,峰型良好;采用DAD檢測器收集200~400 nm全波長掃描下的紫外吸收圖譜,觀察3D圖譜發(fā)現(xiàn)254 nm下各測定成分色譜峰的響應(yīng)均較高,分離效果良好,基線穩(wěn)定。因此,最終實(shí)驗(yàn)條件定為采用70%甲醇為提取溶劑,超聲提取45 min,采用乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相、檢測柱溫為30 ℃,檢測波長為254 nm。

        中藥材化學(xué)成分復(fù)雜,本實(shí)驗(yàn)前期采用超高效液相色譜—離子阱飛行時間高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀,得到赤脛散藥材中化合物分子量信息,將碎片離子信息與現(xiàn)有文獻(xiàn)比對[27-29],經(jīng)初步鑒定后與對照品紫外吸收光譜比對,進(jìn)行化學(xué)成分的確定。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法建立了赤脛散的指紋圖譜,標(biāo)定了19個共有峰,指認(rèn)出3種有效成分并進(jìn)行含量測定。17批赤脛散樣品與對照圖譜相似度為0.768~0.997,各化學(xué)成分相對保留時間較為均一,但相對峰面積RSD值較大,不同批次間的同一成分含量也有所不同,說明樣品間化學(xué)成分相似,但含量差異較大。通過聚類分析、主成分分析及正交偏最小二乘判別分析等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法[23-26]對17批赤脛散指紋圖譜進(jìn)行綜合分析,建立樣品分類模型,發(fā)現(xiàn)了明顯聚類趨勢,將17批樣品聚為2類,如鞣花酸含量為1.180 4~15.212 8mg/g,Ⅰ類樣品鞣花酸含量在5.655 5mg/g以上且均高于Ⅱ類;以VIP值>1作為標(biāo)準(zhǔn),篩選出10種引起赤脛散質(zhì)量差異的主要標(biāo)志成分,Ⅰ類樣品該10種成分峰面積大多高于Ⅱ類;從藥材粉末外觀上看,Ⅰ類樣品為棕黃色,Ⅱ類樣品為棕紅色,與聚類分析結(jié)果一致。由于其均為野生,藥材產(chǎn)地、生長環(huán)境、海拔高度、儲藏條件及時間等多種因素均可能導(dǎo)致藥材化學(xué)成分降解或轉(zhuǎn)化,為保證赤脛散質(zhì)量,用藥過程中應(yīng)規(guī)范藥材來源、采收時間、儲藏條件并關(guān)注該10種成分的質(zhì)量變化,可將其作為藥材質(zhì)量評價指標(biāo)。

        綜上所述,本研究建立了赤脛散HPLC指紋圖譜并同時測定3種有效成分含量,方法快速、操作簡便、分離度好、化學(xué)成分信息豐富,指紋圖譜定性結(jié)合有效成分定量,可彌補(bǔ)現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)與含量測定方法的不足,對赤脛散藥材進(jìn)行整體性評價并反映其內(nèi)在質(zhì)量,為進(jìn)一步質(zhì)量控制及藥材開發(fā)提供參考。

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