王 蕓，劉玉平，彭 靜，柯衛(wèi)東

（武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，湖北武漢 430070）

睡蓮科（Nymphaeaceae）蓮屬（Nelumbo Adans）植物是古老的多年生水生草本植物，也是重要的園藝類作物，多以無(wú)性繁殖為主。蓮屬植物包括2 個(gè)種，即中國(guó)蓮（Nelumbo.nucifera Gaertn.）和美洲黃蓮（Nelumbo.lutea Pers.）[1]。現(xiàn)在人們所說(shuō)的蓮（Lotus）普遍指的是中國(guó)蓮。我國(guó)是蓮的起源中心之一，蓮在我國(guó)有著悠久的栽培和馴化歷史。栽培面積廣闊，資源類型豐富，以長(zhǎng)江流域和黃河以南地區(qū)最適合蓮的生長(zhǎng)[2]。中國(guó)蓮和美洲黃蓮雖然不存在生殖隔離，但其中有些品種進(jìn)行雜交后蓮胚發(fā)生早期敗育，導(dǎo)致雜交后代不結(jié)實(shí)或者結(jié)實(shí)率低。中國(guó)蓮種內(nèi)某些蓮品種之間的雜交也存在類似現(xiàn)象。目前，蓮育種方法仍以傳統(tǒng)的雜交育種為主要方式[3]，不同品種雜交后幼胚發(fā)生敗育會(huì)大大影響蓮的育種效率與進(jìn)程。利用幼胚離體培養(yǎng)對(duì)早期雜種胚進(jìn)行胚拯救的技術(shù)已在許多植物中被成功利用，例如小麥[4]、百合[5]、草莓[6]、葡萄[7]、獼猴桃[8]、山核桃[9]等。但現(xiàn)階段在蓮離體培養(yǎng)上，仍以利用蓮莖尖為材料進(jìn)行組織快繁為主，存在易帶病、繁殖系數(shù)低等缺點(diǎn)[10-11]，對(duì)蓮胚離體培養(yǎng)的研究非常少，為此開(kāi)展了蓮幼胚在離體條件下的萌發(fā)試驗(yàn)，以期為蓮幼胚離體培養(yǎng)技術(shù)提供理論參考，也可為今后開(kāi)展蓮胚拯救技術(shù)研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于武漢市農(nóng)科院蔬菜所水生蔬菜花卉研究中心組培實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，供試材料為武漢市農(nóng)科院蔬菜所選育的子蓮品種“鄂子蓮1 號(hào)”，選其正常開(kāi)花授粉后的幼胚為外植體用于離體培養(yǎng)試驗(yàn)。試驗(yàn)所用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基均以MS 作為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基瓊脂含量為6.5g/L，pH 值5.8～6.0。

1.1 消毒和滅菌

在田間采下“鄂子蓮1 號(hào)”正常授粉的花托（尚未膨大成熟的蓮蓬）立即帶回組培室，在超凈工作臺(tái)上快速取出其內(nèi)的籽粒，經(jīng)無(wú)菌水清洗3 次，70%乙醇浸泡30s，再用無(wú)菌水清洗3 次，然后用0.1%HgCl2消毒90s，最后用無(wú)菌水清洗4 次，每次60s。消毒滅菌后，將籽粒置于無(wú)菌濾紙上吸干多余水分，用解剖刀剝?nèi)プ蚜Ｍ鈱幽鄯N皮，取其內(nèi)部的幼胚接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.2 胚齡對(duì)幼胚萌發(fā)的影響

分別選取不同胚齡“鄂子蓮1 號(hào)”的幼胚為材料，包括2d、3d、4d、5d、6d 共5 種胚齡幼胚，經(jīng)消毒滅菌后接種于含有1.0mg/L NAA、0.5mg/L ZT 和3%蔗糖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每種胚齡幼胚各接種50 個(gè)，設(shè)4 次重復(fù)，接種后于24～26℃下暗培養(yǎng)30d 后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。

1.3 蔗糖濃度對(duì)幼胚萌發(fā)的影響

以胚齡4d 幼胚為外植體，經(jīng)消毒滅菌后分別接種于含有不同蔗糖濃度的誘導(dǎo)培養(yǎng)基（包含1.0mg/L NAA 和0.5mg/L ZT）上，蔗糖濃度分別設(shè)為1%、3%、5%、7%、9%，每種培養(yǎng)基各接種50 個(gè)幼胚，設(shè)4 次重復(fù)，接種后于24～26℃下暗培養(yǎng)30d 后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。

1.4 不同激素濃度配比對(duì)幼胚萌發(fā)的影響

以胚齡4d 幼胚為外植體，MS 為基本培養(yǎng)基，加入3%蔗糖，配合不同濃度的NAA 和ZT，共設(shè)16 種濃度配比組合（表1），每種培養(yǎng)基各接種50 個(gè)幼胚，設(shè)4次重復(fù)，接種后于24～26℃進(jìn)行暗培養(yǎng)，30d 后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同胚齡對(duì)幼胚萌發(fā)的影響

選取5 種不同胚齡的蓮幼胚接種于含1.0mg/L NAA、0.5mg/L ZT、3.0%蔗糖的MS 培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)30d 后統(tǒng)計(jì)幼胚萌發(fā)率、褐化率和污染率（表1）。結(jié)果表明，3d 和4d 的幼胚萌發(fā)率明顯高于2d、5d 和6d 的幼胚，以4d 的幼胚萌發(fā)率最高（36%），稍高于3d 的幼胚（31%），說(shuō)明3～4d 的幼胚在離體條件下具有較強(qiáng)的胚性，更適合作為離體培養(yǎng)的外植體材料。

表1 不同胚齡對(duì)幼胚萌發(fā)的影響

2.2 不同蔗糖濃度對(duì)幼胚萌發(fā)的影響

將4d 胚齡幼胚分別接種于含有不同蔗糖濃度的MS 培養(yǎng)基上，配合1.0mg/L NAA 和0.5mg/L ZT 激素，蔗糖濃度分別設(shè)為1%、3%、5%、7%、9%，暗培養(yǎng)30d后統(tǒng)計(jì)幼胚萌發(fā)率、褐化率和污染率（表2）。結(jié)果顯示，培養(yǎng)基蔗糖濃度為3%和5%的幼胚萌發(fā)率高于1%、7%和9%的蔗糖濃度，萌發(fā)率分別為38%和32%。培養(yǎng)基中的蔗糖濃度過(guò)低，不能為幼胚提供足夠的碳源，導(dǎo)致萌發(fā)率較低；蔗糖濃度過(guò)高導(dǎo)致培養(yǎng)基中的滲透壓過(guò)高，因此阻礙了幼胚的正常萌發(fā)，同時(shí)過(guò)高的蔗糖濃度更易引起污染；當(dāng)蔗糖濃度適中時(shí)，既能為幼胚提供足夠的營(yíng)養(yǎng)，又能保持培養(yǎng)基內(nèi)滲透壓的穩(wěn)定，從而促進(jìn)幼胚萌發(fā)。因此，培養(yǎng)基中3%～5%的蔗糖濃度更利于離體培養(yǎng)的幼胚萌發(fā)。

表2 不同蔗糖濃度對(duì)4d 幼胚萌發(fā)的影響

2.3 不同激素濃度配比對(duì)幼胚萌發(fā)的影響

以胚齡4d 幼胚為外植體，MS 為基本培養(yǎng)基，蔗糖濃度為3%，配以不同濃度NAA 和ZT，分別設(shè)計(jì)4 種濃度的NAA 和ZT 進(jìn)行試驗(yàn)，共計(jì)16 種濃度配比組合，暗培養(yǎng)30d 后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率、褐化率和污染率（表3）。結(jié)果顯示，較高濃度NAA 和低濃度ZT 配比的MS培養(yǎng)基有利于幼胚萌發(fā)，當(dāng)NAA 濃度為3mg/L，ZT 濃度為0.5mg/L 時(shí)，4d 幼胚萌發(fā)率最高，達(dá)到71%。相同濃度NAA 條件下，培養(yǎng)基中ZT 濃度越大，萌發(fā)率越低。當(dāng)NAA 濃度為4mg/L 時(shí)，萌發(fā)率較3mg/L 時(shí)均有所降低，說(shuō)明生長(zhǎng)素濃度過(guò)高會(huì)抑制幼胚萌發(fā)。

表3 不同濃度NAA 和ZT 對(duì)4d 幼胚萌發(fā)的影響

3 討論

植物幼胚的離體培養(yǎng)是植物胚拯救的技術(shù)方法之一，其成敗由胚齡、培養(yǎng)基種類、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、滲透壓和培養(yǎng)條件等多種因素決定[12]。不同植物幼胚離體培養(yǎng)的最佳胚齡各不相同，胚齡對(duì)幼胚萌發(fā)的影響在不同果樹(shù)上均有報(bào)道[13-15]。除核果類植物外，一般植物幼胚離體培養(yǎng)多采用MS 為基本培養(yǎng)基[12]）。本研究探索了離體培養(yǎng)條件下蓮幼胚萌發(fā)的不同影響因素。研究表明，胚齡、培養(yǎng)基蔗糖濃度以及培養(yǎng)基激素濃度配比均能影響蓮幼胚的萌發(fā)生長(zhǎng)。在相同誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，2～6d 胚齡中，以4d 胚齡蓮幼胚最易萌發(fā)；以4d 胚齡幼胚為材料，培養(yǎng)基蔗糖濃度為3%時(shí)，幼胚萌發(fā)率最高，當(dāng)培養(yǎng)基蔗糖濃度達(dá)到或高于7%時(shí)，幼胚早期萌發(fā)受到明顯抑制，該結(jié)論與甜柿幼胚離體培養(yǎng)的研究結(jié)果類似[16]；以4d 胚齡幼胚為材料，在含有3.0mg/L NAA 和0.5mg/L ZT 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，幼胚萌發(fā)效果最好，萌發(fā)率最高,說(shuō)明培養(yǎng)基較高濃度的生長(zhǎng)素和低濃度的細(xì)胞分裂素配比有利于幼胚的萌發(fā)，但生長(zhǎng)素濃度過(guò)高則會(huì)抑制幼胚的生長(zhǎng)，這也與前人的研究結(jié)果相符[12,17]。

目前，蓮育種方法仍以雜交育種為主要手段，雜交后代若發(fā)生敗育則會(huì)影響育種進(jìn)程，利用胚拯救技術(shù)可以克服胚敗育給育種帶來(lái)的不良后果，但目前尚未有蓮胚拯救技術(shù)的相關(guān)研究報(bào)道。為此，開(kāi)展了此項(xiàng)研究，旨在為蓮幼胚離體培養(yǎng)提供技術(shù)支撐，為今后開(kāi)展蓮胚拯救技術(shù)研究并應(yīng)用于蓮品種選育等提供參考。