王桂清　馬迪

摘要：為比較室內(nèi)藥效的不同測定方法，在實驗室內(nèi)活體和離體條件下，采用菌片接種法測定不同化學(xué)藥劑（500 g/L 異菌脲懸浮劑、50%福美雙可濕性粉劑、50%啶酰菌胺水分散粒劑、70%甲基硫菌靈可濕性粉劑）對黃瓜灰霉病的保護(hù)作用和治療作用，在含藥培養(yǎng)基上，采用菌絲生長速率法測定不同化學(xué)藥劑對黃瓜灰霉病菌菌絲生長的抑制作用。結(jié)果表明，化學(xué)藥劑的活體效果優(yōu)于離體效果，但離體條件下的藥效趨勢與活體條件下的藥效趨勢一致，說明可用離體試驗代替活體試驗；化學(xué)藥劑在培養(yǎng)基上的效果優(yōu)于在寄主組織上的藥效，但利用寄主組織進(jìn)行藥效試驗與田間藥效試驗更近了一步，準(zhǔn)確度更高，說服力更強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：室內(nèi)藥效；試驗方法；活體；離體；生長速率法；黃瓜灰霉病

中圖分類號： S481+.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）19-0175-04

收稿日期：2016-05-17

基金項目：山東省自然科學(xué)基金（編號：Y2008D57）；山東省自然科學(xué)基金聯(lián)合專項（編號：ZR2012CL17）。

作者簡介：王桂清（1968—），女，河北滄州人，博士，教授，主要從事植物保護(hù)的教學(xué)與科研工作。E-mail：wangguiqing@lcu.edu.cn。 農(nóng)藥的藥效指藥劑施用后對控制目標(biāo)（有害生物）的作用效果，是衡量效力大小的指標(biāo)之一。殺菌劑的藥效多用病情指數(shù)的降低及受害率降低的百分率來表示。藥效的測定，一般先經(jīng)室內(nèi)毒力試驗證明有效后，再進(jìn)行田間小區(qū)試驗。農(nóng)藥室內(nèi)毒力測定是指在室內(nèi)進(jìn)行的農(nóng)藥測定，優(yōu)點是可以通過大量培養(yǎng)與飼育獲得較為均勻一致的供試生物，便于同時進(jìn)行大量試驗，在較短時間內(nèi)可以得出結(jié)果。但由于室內(nèi)室外環(huán)境條件差異較大，因此其結(jié)果僅能為田間藥效試驗提供依據(jù)。為探討室內(nèi)藥效的測定方法，本試驗以4種化學(xué)藥劑為材料，以黃瓜灰霉病菌灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）為靶標(biāo)，采用活體植物及離體葉片接種法和生長速率法，測定不同藥劑對黃瓜灰霉病的保護(hù)作用和治療作用、對病菌菌絲生長的抑制作用，并對室內(nèi)藥效的測定方法進(jìn)行了比較。

1 材料與方法

1.1 供試病菌及培養(yǎng)

引起黃瓜灰霉病的灰葡萄孢菌，由聊城大學(xué)植物病理學(xué)研究室提供，采用PDA培養(yǎng)基，于（22±1） ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，備用。

1.2 供試藥劑及配制

500 g/L異菌脲懸浮劑（拜耳作物科學(xué)有限公司），50%福美雙可濕性粉劑（青島好利特生物農(nóng)藥有限公司），50%啶酰菌胺水分散粒劑（德國巴斯夫公司），70%甲基硫菌靈可濕性粉劑（新沂豐樂化工有限公司），配制成800 mg/L母液，備用。保護(hù)與治療作用試驗的終濃度為25、50、100、200、400 mg/L，菌絲生長速率試驗的終濃度為12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 mg/L。

1.3 保護(hù)與治療作用

1.3.1 試驗時間和地點 試驗于2015年7月至12月在聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院生態(tài)溫室和植物病理學(xué)研究室進(jìn)行。

1.3.2 黃瓜幼苗的種植與管理 供試黃瓜種子為津研4號（山東濟(jì)南大江種子有限公司）。將種子用溫水浸種24 h后，種在質(zhì)地均勻的營養(yǎng)土中，1缽1株，放于溫室中（30 ℃、40%濕度）培養(yǎng)至4張真葉期。保證黃瓜幼苗健壯，及時澆水，正常管理，病株和弱株及時清除。

1.3.3 接種與調(diào)查 接種：采用菌餅法接種，待黃瓜長至4張真葉期時進(jìn)行接種。用直徑為0.5 cm的打孔器將培養(yǎng)5 d的灰葡萄孢菌平板打制成菌餅，以備接種用。

活體防效：直接在黃瓜苗上進(jìn)行，保證葉片大小和葉位一致，1株1葉。保護(hù)作用：先向內(nèi)加少量吐溫-20藥劑均勻噴于葉片表面，1 mL/葉，待藥液陰干，8 h后接種于葉正面，1葉2點，5次重復(fù)，無菌水對照；治療作用：接種8 h后噴藥。接種后的黃瓜苗放入溫度為（22±1） ℃、濕度大于90%的恒溫培養(yǎng)箱中生長，接種后3 d內(nèi)注意保濕，以后正常管理。

離體防效：采摘大小、葉位一致的黃瓜葉片，葉柄用棉球保濕，葉正面向上放于鋪有濕濾紙的直徑為14 cm的培養(yǎng)皿中。保護(hù)作用、治療作用的接種方法和管理方法同上，5次重復(fù)，無菌水對照。

調(diào)查：活體接種5 d、離體接種3 d后調(diào)查發(fā)病情況，測量其病斑直徑（十字交叉法），計算抑制率。

病斑直徑（cm）=2次測量平均值（cm）-菌餅直徑（cm）。

抑制率=對照病斑直徑（cm）-處理病斑直徑（cm）對照病斑直徑（cm）×100%。

1.4 菌絲生長的抑制作用

以生長速率法（瓊膠平板法）[1]測定化學(xué)藥劑對黃瓜灰霉病菌菌絲生長的抑制作用，所用培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，藥劑終濃度分別為200.0、100.0、50.0、25.0、12.5 mg/L，以無菌水為對照。菌餅直徑為0.5 cm，每皿1塊，3次重復(fù)，（21±1） ℃ 光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待對照菌落直徑在3 cm以上時，用十字交叉法測量菌落直徑。根據(jù)菌落直徑求抑制生長的百分率，公式如下：

菌落直徑（cm）=2次測量平均值（cm）-菌餅直徑（cm）。

菌絲生長抑制率=對照菌落直徑（cm）-處理菌落直徑（cm）對照菌落直徑（cm）×100%。

1.5 毒力回歸曲線的建立

取不同的化學(xué)藥劑，按試驗要求配制系列濃度。試驗重復(fù)3次，建立毒力回歸方程。將抑菌的百分率轉(zhuǎn)換成概率值，濃度轉(zhuǎn)換成對數(shù)，進(jìn)行概率值分析，求出不同藥劑對病原菌的抑制中濃度（EC50）。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，經(jīng)DPSv 7.01統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析，線性回歸等由SPSS 13.0完成。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 4種藥劑對黃瓜灰霉病的活體藥效

2.1.1 4種藥劑對黃瓜灰霉病的活體保護(hù)作用 室內(nèi)利用黃瓜幼苗測定4種化學(xué)農(nóng)藥對灰葡萄孢菌引起的黃瓜灰霉病的保護(hù)作用，接種5 d后，各藥劑的抑菌率見圖1，抑菌中濃度（EC50）見表1。

由圖1、表1可以看出，在活體條件下各種藥劑對黃瓜灰霉病均表現(xiàn)出較好的保護(hù)作用，且隨著藥劑濃度的升高藥效逐漸增強(qiáng)。圖1表明，異菌脲的保護(hù)作用最強(qiáng)，供試濃度下藥效均為最好，其次為福美雙；當(dāng)藥劑濃度為200 mg/L時，僅有異菌脲的藥效超過50.00%，為53.21%；當(dāng)濃度為 400 mg/L 時，4種供試化學(xué)農(nóng)藥的藥效均超過50.00%，異菌脲的藥效已達(dá)到64.98%，福美雙的接近60.00%，為59.34%。從表1可以看出，異菌脲、福美雙、啶酰菌胺和甲基硫菌靈4種化學(xué)農(nóng)藥的EC50分別為150.74、220.20、345.05、378.39 mg/L，即4種農(nóng)藥的藥效依次降低。

2.1.2 4種藥劑對黃瓜灰霉病的活體治療作用 接種5 d后治療作用的抑菌率見圖2，EC50見表2。活體條件下各種藥劑對黃瓜灰霉病均有治療作用，且隨著藥劑濃度的增加藥效提高。圖2表明，供試濃度下4種供試藥劑異菌脲、福美雙、啶酰菌胺、甲基硫菌靈的藥效依次降低。由表2可見，異菌脲、福美雙、啶酰菌胺、甲基硫菌靈的EC50依次為144.02、26319、361.20、458.64 mg/L，說明異菌脲的治療作用最好。

2.2 4種藥劑對黃瓜灰霉病的離體藥效

2.2.1 4種藥劑對黃瓜灰霉病的離體保護(hù)作用 在實驗室內(nèi)離體條件下利用黃瓜葉片測定4種化學(xué)藥劑對黃瓜灰霉病的保護(hù)作用，接種3 d后的效果見圖3、表3。

由圖3可以看出，離體條件下不同藥劑對黃瓜灰霉病的保護(hù)效果存在差異，當(dāng)藥劑濃度為200 mg/L時，僅有異菌脲的藥效超過了50.00%，為52.18%，其余三者低于4700%；當(dāng)藥劑濃度為400 mg/L時，異菌脲和福美雙的藥效達(dá)到或超過了60.00%，分別為67.74%、60.00%， 而甲基硫菌靈和啶酰菌胺的藥效低于50.00%，分別為46.05%、49.76%。

由表3可以看出，在離體條件下供試的4種化學(xué)農(nóng)藥中，異菌脲對黃瓜灰霉病的保護(hù)效果最好，EC50最小，為 170.95 mg/L，啶酰菌胺的保護(hù)效果最差，EC50最大，為 402.49 mg/L，后者是前者的2.35倍，即啶酰菌胺的保護(hù)效果僅為異菌脲的1/3至1/2；福美雙和甲基硫菌靈的保護(hù)效果介于兩者之間，EC50分別為219.83、367.68 mg/L。 表3 不同化學(xué)藥劑對黃瓜灰霉病的離體保護(hù)作用

藥劑毒力回歸方程相關(guān)系數(shù)EC50（mg/L）95%置信區(qū)間異菌脲 y=2.408 7+1.160 5x0.998 1170.95131.22～222.71福美雙 y=2.794 1+0.941 8x0.994 0219.83152.72～316.43 甲基硫菌靈y=2.396 4+1.014 9x0.950 5367.68231.16～584.82 啶酰菌胺 y=1.564 7+1.318 8x0.997 7402.49271.18～597.38

2.2.2 4種藥劑對黃瓜灰霉病的離體治療作用 接種3 d后離體條件下的治療作用效果見表4、圖4。在離體條件下異菌脲對黃瓜灰霉病的治療效果最好，供試濃度下的抑菌率最高，當(dāng)濃度為200 mg/L時，藥效為60.97%，當(dāng)濃度為400 mg/L時，藥效達(dá)到71.69%，其抑菌的EC50最小，為106.88 mg/L；啶酰菌胺的治療效果最差，當(dāng)其濃度為400 mg/L時，藥效不足50.00%，為47.58%，其抑菌的EC50最大，為456.62 mg/L。

2.3 4種藥劑對黃瓜灰霉病菌菌絲生長的抑制作用

實驗室內(nèi)采用生長速率法測定4種化學(xué)藥劑對黃瓜灰霉病菌菌絲生長的抑制作用，抑制率見圖5，抑菌中濃度（EC50）見表5。在含藥培養(yǎng)基上，4種化學(xué)藥劑對黃瓜灰霉病菌菌絲生長的抑制效果較好，當(dāng)藥劑濃度為25.0 mg/L時，異菌脲對菌落生長的抑制率已達(dá)到59.25%；當(dāng)藥劑濃度為 50.0 mg/L 時，異菌脲和福美雙對菌落生長的抑制率已超過80.00%，甲基硫菌靈對菌落生長的抑制率也達(dá)到69.27%；當(dāng)藥劑濃度為 100.0 mg/L 時，4種化學(xué)藥劑對菌落生長的抑制率均超過75.00%，異菌脲、福美雙和甲基硫菌靈的已達(dá)95.00%；當(dāng)藥劑濃度為200.00 mg/L時，4種化學(xué)藥劑對菌落生長的抑制率均超過94.00%，異菌脲、福美雙、甲基硫菌靈的抑制率已達(dá)100.00%。比較EC50，異菌脲、福美雙、甲基硫菌靈和啶酰菌胺4種化學(xué)藥劑對菌落生長的抑制中濃度分別為2057、26.23、31.12、45.93 mg/L，異菌脲的EC50僅為啶酰菌胺的 1/2，即異菌脲對黃瓜灰霉病菌菌絲生長的抑制效果是啶酰菌胺的2倍。

比較活體保護(hù)作用和菌絲生長抑制作用，異菌脲和啶酰菌胺活體保護(hù)作用的EC50分別為150.74、345.05 mg/L，兩者對菌絲生長抑制作用的EC50分別為20.57、45.93 mg/L，保護(hù)作用EC50是菌絲生長抑制作用EC50的7.33、7.51倍，即藥劑對菌絲生長的抑制效果是活體保護(hù)效果的7.33、7.51倍。

3 結(jié)論與討論

農(nóng)藥田間藥效試驗是在田間進(jìn)行的農(nóng)藥對有害生物施藥效果的試驗，這是確定新的農(nóng)藥品種能否在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上大面積推廣應(yīng)用的重要方法。一般農(nóng)藥經(jīng)室內(nèi)試驗證明有效后，方可進(jìn)行田間藥效試驗，可見室內(nèi)藥效試驗的重要性。

本研究在實驗室內(nèi)分別在活體和離體條件下，采用菌片接種法測定不同化學(xué)藥劑對黃瓜灰霉病的保護(hù)作用和治療作用。結(jié)果表明，供試的4種化學(xué)藥劑對黃瓜灰霉病既有保護(hù)作用也有治療作用，且隨著藥劑濃度的升高藥效逐漸提高，與前人的研究結(jié)果[1-4]一致；化學(xué)藥劑的保護(hù)作用優(yōu)于治療作用，充分體現(xiàn)了“預(yù)防為主”的植保理念；化學(xué)藥劑的活體效果優(yōu)于離體效果，但離體條件下的藥效趨勢與活體條件下的藥效趨勢一致，說明可用離體試驗代替活體試驗。endprint

室內(nèi)藥效試驗最常用的測定方法是菌絲生長速率法[5-6]。本研究在含藥培養(yǎng)基上，采用菌絲生長速率法測定不同化學(xué)藥劑對黃瓜灰霉病菌菌絲生長的抑制作用，與在寄主組織上的藥效比較，化學(xué)藥劑在培養(yǎng)基上的效果優(yōu)于在寄主組織上的藥效，如50%啶酰菌胺水分散粒劑在寄主組織上的EC50約為460 mg/L（活體上在345～362 mg/L之間，離體上在402～457 mg/L之間），在培養(yǎng)基上EC50約為 46 mg/L。出現(xiàn)這種差異的原因在于菌絲生長抑制作用試驗是在實驗室內(nèi)培養(yǎng)條件恒定密閉的培養(yǎng)皿中進(jìn)行的，藥劑的活性成分無散發(fā)、培養(yǎng)基無抗性，藥劑的藥效全部發(fā)揮出來；而活體保護(hù)作用雖然也是在培養(yǎng)條件恒定的實驗室內(nèi)進(jìn)行，但利用的是寄主苗，空間開放，藥劑的活性成分有散發(fā)、寄主有抗性，藥劑的藥效不能百分百發(fā)揮出來。

唐明等通過田間藥效試驗發(fā)現(xiàn)，50%啶酰菌胺水分散粒劑對黃瓜灰霉病的防效較好，在用藥量為5.625 kg/hm2時，防效在90%以上，用藥量為3.375 kg/hm2時，防治效果在75% 以上，用藥量在4.500 kg/hm2時，防治效果大于80%[7]。據(jù)此可推算出，啶酰菌胺田間藥效的EC50約為 15 000 mg/L。這與本研究的室內(nèi)結(jié)果差異明顯，原因在于田間藥效試驗是在環(huán)境條件多變、空間完全開放的活體寄主上進(jìn)行的，藥劑的活性成分散失嚴(yán)重、寄主存在抗藥性，藥劑的藥效發(fā)揮較弱。供試藥劑在寄主組織上的藥效遠(yuǎn)不如在培養(yǎng)基上對菌絲生長的抑制效果，但利用寄主組織進(jìn)行藥效試驗與田間藥效試驗更近了一步，準(zhǔn)確度更高，說服力更強(qiáng)。

農(nóng)藥本身，包括農(nóng)藥的化學(xué)成分、理化性質(zhì)、作用機(jī)制、使用劑量以及加工性狀等；防治對象，包括生物學(xué)特性和發(fā)育階段等；環(huán)境因素，如溫度、濕度、雨水、光照、風(fēng)、土壤性質(zhì)等，直接影響著病蟲害的生理活動和農(nóng)藥性能的發(fā)揮，結(jié)果都會影響農(nóng)藥的藥效[8]。因此，在使用農(nóng)藥前，必須掌握它的性能特點、防治對象的生物學(xué)特性，在施用過程中，充分利用一切有利因素，控制不利因素，以求達(dá)到最佳防治效果[9]。

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