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        豬肺炎支原體脂蛋白LppT的多克隆抗體制備及鑒定

        2017-11-22 23:29:14劉威袁芳艷周丹娜劉澤文楊克禮段正贏郭銳蔡行肖少波田永祥
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年19期

        劉威+袁芳艷+周丹娜+劉澤文+楊克禮+段正贏+郭銳+蔡行+肖少波+田永祥

        摘要:試驗(yàn)構(gòu)建豬肺炎支原體重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-LppT,通過快速定點(diǎn)突變試劑盒將LppT基因中513、945、1 860、2 547 bp處的A突變?yōu)镚,使改造后的LppT基因能在大腸桿菌系統(tǒng)中正確表達(dá),IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)并進(jìn)行了蛋白純化,純化的目的蛋白與佐劑混合、乳化制備免疫原,免疫新西蘭大白兔制備LppT蛋白多克隆抗體。SDS-PAGE 分析結(jié)果顯示,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后獲得1條特異性蛋白條帶,分子質(zhì)量約為110 ku,與預(yù)期蛋白大小一致??扇苄苑治鼋Y(jié)果表明目的蛋白以可溶形式表達(dá)于上清中,純化的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后,用制備的LppT多克隆抗體進(jìn)行Western Blot檢測,結(jié)果表明制備的LppT多克隆抗體具有較強(qiáng)的特異性。

        關(guān)鍵詞:豬肺炎支原體;脂蛋白;LppT;多克隆抗體

        中圖分類號: S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號:1002-1302(2017)19-0220-04

        收稿日期:2016-05-27

        基金項(xiàng)目:國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(編號:2016YFD0500906);國家自然科學(xué)基金(編號:31502069、31170160);湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科學(xué)基金(編號:2015NKYJJ14);湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院競爭性計(jì)劃項(xiàng)目(編號:2016jzxjh030);湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心資助項(xiàng)目(編號:2015-620-004-001)。

        作者簡介:劉 威(1985—),男,湖北武漢人,博士,助理研究員,主要從事動(dòng)物傳染病研究工作。E-mail:liuwei85@126.com。

        通信作者:田永祥,研究員,主要從事家畜主要疫病生物制劑的研制及綜合防控技術(shù)研究。E-mail:tyxanbit@163.com。 豬支原體肺炎(mycoplasmal pneumonia of swine,MPS)是由豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)引起的,以豬咳嗽和氣喘為主要癥狀的慢性呼吸道傳染病[1],具有慢性、接觸性、高傳染性、高發(fā)病率和低死亡率的特征。該病廣泛分布于世界各地,國外常被稱為豬地方流行性肺炎,而在我國常被稱為豬氣喘病(又稱喘氣?。2]。

        豬肺炎支原體感染導(dǎo)致豬的生長率下降12%~16%,飼料轉(zhuǎn)化率降低13%~22%,體質(zhì)量相對減少10~25 kg,商品豬的出欄時(shí)間延遲10~30 d[3];同時(shí)還破壞豬的支氣管和細(xì)支氣管纖毛,進(jìn)而損傷阻擋病原微生物入侵的物理屏障,破壞豬的巨噬細(xì)胞,降低機(jī)體的免疫清除能力,導(dǎo)致免疫抑制[4]。因此,在臨床上豬肺炎支原體常常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬Ⅱ型圓環(huán)病毒、豬流感病毒、胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌等病原混合感染,增加了當(dāng)前豬病診斷和預(yù)防控制的難度[5-6]。此外,由于豬肺炎支原體是缺少細(xì)胞壁的原核微生物,對常作用于細(xì)胞壁的抗生素(如β-內(nèi)酰胺酶類抗生素等)不敏感,豬群一旦被豬肺炎支原體感染,控制和凈化將十分困難[7]。據(jù)初步統(tǒng)計(jì),全球每年因豬肺炎支原體感染造成的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)2億美元??梢哉f,豬肺炎支原體已成為當(dāng)前嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的重大疫病,被喻為影響?zhàn)B豬業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的“隱性殺手”。

        在以前的研究中,筆者完成了Mhp168株以及體外傳代致弱株Mhp168-L的全基因組序列的測定[8]。通過Mhp強(qiáng)弱毒力菌株的比較基因組學(xué)分析,篩選出了330個(gè)遺傳變異位點(diǎn),分布于123個(gè)基因中,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)當(dāng)前國際上報(bào)道的Mhp毒力基因(如:P97、P102、P146、P159、P216等)幾乎全包括在這123個(gè)基因中,其他基因多數(shù)功能未知,極可能還存在潛在的未知毒力基因[9]。其中MHP168_424編碼的氨基酸序列與M. conjunctivae的膜脂蛋白LppT相似度較高,且均含有1處典型的細(xì)菌脂蛋白信號肽區(qū)域。M. conjunctivae的LppT蛋白具有體外黏附羔羊關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的能力,且抗LppT的抗體能有效阻斷M. conjunctivae與羔羊關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的黏附[10]。因此,推測脂蛋白LppT很可能是豬肺炎支原體的一個(gè)毒力相關(guān)因子。為了進(jìn)一步研究脂蛋白LppT的功能,本試驗(yàn)擬獲得LppT的體外表達(dá)產(chǎn)物并制備抗LppT的多克隆抗體,為深入研究LppT的功能奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 菌株、載體及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 MHP168菌株,由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所提供,筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)、大腸桿菌DH5α和BL21(DE3),由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)室保存。新西蘭大白兔,購自湖北省疫病預(yù)防控制中心。

        1.1.2 主要試劑 質(zhì)粒小量提取試劑盒購自TIANGEN公司;瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒購自O(shè)mega公司。DNA聚合酶、核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ、T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司。六聯(lián)組氨酸純化鎳柱、山羊抗兔IgG、HRP-DAB底物顯色試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

        1.2 方法

        1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 分別通過SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測LppT基因的信號肽序列和跨膜區(qū),結(jié)果顯示LppT不含有信號肽序列,但是存在1處跨膜區(qū)域,跨膜區(qū)域位于9~31位氨基酸??缒^(qū)的存在可能導(dǎo)致蛋白的不表達(dá)和少量表達(dá),因此在設(shè)計(jì)引物時(shí)去掉了前31個(gè)氨基酸的跨膜區(qū)域。引物根據(jù)Mhp168株LppT基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)(基因登錄號:ADQ90626.1):上游引物L(fēng)ppT-F:5′-TTTGGATCCATGTCCCAAGCCGAAAAAT-3′,下游引物L(fēng)ppT-R:5′-TTTCTCGAGTTATTCCATATATTC GCT-3′。在上、下游引物中分別引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。endprint

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