吳坤， 張迎春， 鄧思波， 黃敏慧， 吳建偉， 陳崢宏**， 王濤**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省普通高等學(xué)校病原生物學(xué)特色重點實驗室， 貴州 貴陽 550025)

原發(fā)性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)是常見的惡性腫瘤之一，全世界PHC死亡病例占所有惡性腫瘤死亡病例的8.2%，其死亡率在惡性腫瘤中排第4位[1]；其中來源于肝細(xì)胞的肝細(xì)胞癌最為常見，占85%～90%[2]。目前，PHC常用的臨床治療方法主要有外科手術(shù)、放療及化療等，但手術(shù)切除后存在PHC復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率高，放療、化療又存在特異性及敏感性較差的問題[3-5]。因此，尋找安全有效的抗腫瘤治療技術(shù)和藥物已成為亟需解決的問題?？咕?antimicrobial peptides，AMPs)是生物體應(yīng)對外界病原體而產(chǎn)生的一種小分子陽離子活性肽，在先天性免疫中發(fā)揮著重要作用[6-7]。目前研究發(fā)現(xiàn)，AMPs不僅對細(xì)菌、真菌、寄生蟲及病毒等病原生物具有很強(qiáng)的抑殺活性，還對腫瘤細(xì)胞有著選擇性殺傷作用，因此受到國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注[8-10]。家蠅抗真菌肽-1A(Muscadomesticaantifungal peptide-1A，MAF-1A)是來源于家蠅幼蟲的新型AMPs，由26個氨基酸殘基組成的α螺旋線性多肽[11-13]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，MAF-1A 不僅能抑殺白念珠菌、甲型流感病毒等多種病原微生物，且對人肝癌細(xì)胞HepG2等腫瘤細(xì)胞的體外增殖也具抑制活性[12,14]。本研究在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討MAF-1A對人肝癌細(xì)胞HepG2的抑制作用，現(xiàn)將結(jié)果匯報如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 肝癌細(xì)胞HepG2由貴州醫(yī)科大學(xué)生物工程實驗室惠贈，人正常肝細(xì)胞LO2由貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室惠贈。

1.1.2主要試劑和儀器 杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium, DMEM)及磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS；美國GIBCO)，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)試劑(北京索萊寶)，胎牛血清(杭州四季青)，噻唑藍(lán)(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)試劑(北京索萊寶)及乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測試劑盒(南京建成)；XDS-1B倒置顯微鏡(重慶光學(xué))，EPOCH2酶標(biāo)儀(美國Biotek)，MCO-5M CO2培養(yǎng)箱(日本三洋)，KL05R低速冷凍離心機(jī)(湖南凱達(dá))及L500臺式低速離心機(jī)(湖南湘儀)。

1.2 方法

1.2.1MAF-1A儲備液的制備 按文獻(xiàn)[11]方法采用原核載體串聯(lián)表達(dá)，鎳柱親和層析純化、脫鹽濃縮，MAF-1A儲備液濃度為5 000 mg/L，分裝后置于-80℃冰箱冷藏備用。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) HepG2、LO2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)基添加終濃度100 000 U/L青霉素和0.1 g/L的鏈霉素，將細(xì)胞置于含有5%CO2的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；細(xì)胞貼壁生長近80%后，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌后加入適量的胰酶消化，加含有胎牛血清培養(yǎng)液中止消化，1 000 r/min離心3 min，取適量比例的懸浮細(xì)胞傳代培養(yǎng)。

1.2.3倒置顯微鏡觀察HepG2細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征 取HepG2細(xì)胞按1×105個/孔接種于6孔板，總體積為2 mL/孔，置37 ℃的5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，加MAF-1A使其終濃度為0、100及200 mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，同時設(shè)置正常生長對照。

1.2.4MTT法檢測HepG2、LO2細(xì)胞的生存率 取對數(shù)生長期的HepG2、LO2細(xì)胞分別按5×103個/孔接種于96孔培養(yǎng)板，100 μL/孔，置37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，加MAF-1A使其終濃度為0、25、50、100 、200、400及800 mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；MTT加入培養(yǎng)物作用4 h，加DMSO 150 μL，置搖床20 min；酶標(biāo)儀設(shè)定波長為490 nm，記錄各組細(xì)胞相應(yīng)吸光度(optical density,OD)值，并通過公式計算細(xì)胞生存率[細(xì)胞生存率(%)=(OD實驗組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)×100%]，同時實驗設(shè)正常肝細(xì)胞LO2組及生長對照組，每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.2.5LDH釋放試驗檢測HepG2細(xì)胞的破壞性 取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞按5×103個/孔接種于96孔微孔板中，100 μL/孔，置于含5%CO2的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，MAF-1A加入微孔板使其終濃度為0、25、50、100 、200及400 mg/L，培養(yǎng)24 h；同時設(shè)立空白對照組(不含細(xì)胞上清液)、陽性對照組(添加1%TritonX-100)，每組設(shè)置3個復(fù)孔；按試劑盒使用說明添加試劑后，使用酶標(biāo)儀檢測吸光值并計算LDH釋放率[LDH釋放率=(測定OD值-空白對照OD值)/(陽性對照OD值-空白對照OD值)×100%]。

1.2.6劃痕愈合試驗檢測HepG2細(xì)胞的遷移能力 取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞按1×105個/孔接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁長滿時，用20 μL移液槍頭尖端刮擦；PBS液洗滌細(xì)胞3次，每孔加入10 mmol/L羥基脲，將細(xì)胞置于終濃度為0、100及200 mg/L的MAF-1A新鮮培養(yǎng)基中孵育，分別在刮擦細(xì)胞0、12及24 h時于倒置顯微鏡下觀察劃痕距離，隨機(jī)選取3個視野拍照，使用Image J軟件分析劃痕面積，計算遷移率[遷移率(%)=(0 h劃痕面積-12或24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%]；設(shè)置未經(jīng)MAF-1A處理的HepG2細(xì)胞為對照組。

1.2.7紅細(xì)胞體外溶解試驗檢測MAF-1A的溶血活性 將新鮮抽取的人肘正中靜脈血注入含有抗凝劑(阿氏液)的離心管中，經(jīng)3 500 r/min離心5 min，棄上清液，PBS洗滌3次，PBS調(diào)整紅細(xì)胞濃度為1%的體積分?jǐn)?shù)；用PBS把MAF-1A配置目標(biāo)濃度為100、200、400、800、1 200 、1 800及2 400 mg/L，取50 μL，再加等體積的紅細(xì)胞懸液，以1%Triton X-100為陽性對照，PBS設(shè)為陰性對照，37 ℃暗室孵育1 h，以3 500 r/min離心5 min；將上清液依次加入新的96孔板，波長562 nm測定OD值，并計算溶血率[溶血率(%)=(檢測孔OD值-陰性孔OD值)/(陽性孔OD值-陰性孔OD值)×100%]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

0 mg/L MAF-1A組 100 mg/L MAF-1A組 200 mg/L MAF-1A組圖1 各組HepG2細(xì)胞的鏡下形態(tài)學(xué)(100×)Fig.1 Morphological changes of MAF-1A in different concentrations on HepG2 cells(100×)

2 結(jié)果

2.1 顯微鏡下HepG2的形態(tài)

MAF-1A作用HepG2細(xì)胞24 h后，鏡下可見HepG2細(xì)胞出現(xiàn)表面皺褶，形狀變?yōu)楸馄?，?xì)胞膜不完整、細(xì)胞破裂，細(xì)胞死亡脫落等明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)；MAF-1A濃度越高，CPE越顯著。見圖1。

2.2 MAF-1A對HepG2、LO2細(xì)胞的抑制作用

結(jié)果顯示，各濃度組MAF-1A均對HepG2細(xì)胞有抑制作用，隨著濃度增高，抑制作用增強(qiáng)，MAF-1A實驗組與正常HepG2細(xì)胞0 mg/L MAF-1A組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；人正常肝細(xì)胞LO2的存活率明顯高于HepG2細(xì)胞，當(dāng)MAF-1A濃度達(dá)800 mg/L 時，生存率為(84.67±2.51)%。見圖2。

注：與0 mg/L MAF-1A組比較，(1)P<0.05，(2) P <0.01。圖2 不用濃度MAF-1A對LO2和HepG2細(xì)胞生存率的影響Fig.2 Effect of MAF-1A in different concentrations on the survival rate of LO2 cells and HepG2 cells

2.3 MAF-1A對HepG2細(xì)胞LDH釋放率的檢測

結(jié)果顯示，MAF-1A作用HepG2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞釋放LDH的量增多，且LDH的釋放率隨著MAF-1A濃度的升高而增大(P<0.01)。見圖3。

注：(1)與0 mg/L MAF-1A組比較，P<0.01。圖3 不同濃度MAF-1A對HepG2細(xì)胞LDH釋放的影響Fig.3 Effect of MAF-1A in different concentrations on LDH release from HepG2 cells

2.4 MAF-1A對HepG2細(xì)胞遷移能力的影響

細(xì)胞劃痕愈合實驗結(jié)果顯示，100和200 mg/L MAF-1A均能抑制HepG2細(xì)胞的遷移運(yùn)動，高濃度MAF-1A的抑制作用更為明顯(P<0.05)。見圖4和表1。

表1 不同濃度MAF-1A對HepG2細(xì)胞遷移運(yùn)動的抑制率Tab.1 Inhibition rate of MAF-1A in different concentrations on HepG2 cell migration

注：A、D及H為0 mg/L MAF-1A組，B、E及I為100 mg/L MAF-1A組，C、F及J為200 mg/L MAF-1A組。圖4 不同濃度MAF-1A對HepG2細(xì)胞遷移運(yùn)動的影響(100×)Fig.4 Effect of MAF-1A in different concentrations on HepG2 cell migration(100×)

2.5 MAF-1A體外溶血活性

體外溶血實驗結(jié)果顯示，MAF-1A濃度低于1 200 mg/L時，溶血率均為0%；MAF-1A濃度為1 800 mg/L時，溶血率為0.21%；MAF-1A濃度達(dá)2 400 mg/L時，溶血率<1%。

3 討論

肝癌是一種死亡率極高的惡性腫瘤，我國近年來肝癌新發(fā)病例達(dá)36.5萬例，致死率在惡性腫瘤中排第2位[15]。目前，藥物化療是肝癌治療中的重要組成部分，但臨床常用的抗腫瘤藥物治療效果不理想，不良反應(yīng)和副作用較明顯，且腫瘤細(xì)胞對部分藥物已出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象[16-18]。近期研究發(fā)現(xiàn)，AMPs對腫瘤細(xì)胞有殺傷作用，且有毒副作用較弱、不易引起腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥等特點，具有成為新型抗腫瘤藥物的潛力，目前已成為國內(nèi)外抗腫瘤治療研究的熱點[19-21]。

文獻(xiàn)報道，抗菌肽TT-1在體內(nèi)外對甲狀腺癌細(xì)胞具有顯著的殺傷作用[22]；多肽9R-P201可抑制人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖和遷移[23]；β-防御素能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，其抑制程度與作用濃度成正相關(guān)[24]；來源于家蠅胚胎細(xì)胞的AMPs能有效殺傷人髓樣白血病細(xì)胞K562細(xì)胞，且對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞無明顯毒性作用[25]。本研究形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，MAF-1A作用于HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)改變、死亡脫落等明顯的細(xì)胞病變現(xiàn)象；MTT法檢測發(fā)現(xiàn)，MAF-1A可抑制人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞的增殖(P<0.05或P<0.01)，而且抑制作用呈劑量依賴性，且MAF-1A對正常肝細(xì)胞LO2的生存率無明顯影響；LDH從細(xì)胞中的釋放被視為細(xì)胞死亡的指標(biāo)之一[26]，通過細(xì)胞LDH釋放檢測發(fā)現(xiàn)，MAF-1A作用HepG2細(xì)胞后，能夠促進(jìn)LDH釋放到細(xì)胞外，且呈濃度依賴性(P<0.01)，提示 MAF-1A可導(dǎo)致HepG2細(xì)胞的死亡。體外溶血實驗結(jié)果顯示，MAF-1A的濃度達(dá)2 400 mg/L時，僅表現(xiàn)出微弱的溶血性。以上研究結(jié)果表明，MAF-1A對HepG2細(xì)胞具有抑制和殺傷作用，對人正常LO2細(xì)胞及紅細(xì)胞的毒性作用較小，提示 MAF-1A 對腫瘤細(xì)胞的作用有一定的選擇性。

遷移和侵襲是惡性腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵，也是臨床治療的難題，一旦腫瘤發(fā)生了轉(zhuǎn)移，其治療更加困難，所以控制腫瘤的遷移和侵襲是抗腫瘤藥物研究的一個重要方向[27]。研究報道，家蠅幼蟲抗菌肽粗提取物能抑制HepG2的增殖，且以濃度依賴方式抑制HepG2細(xì)胞的遷移從而發(fā)揮抗腫瘤活性[28]。本研究中細(xì)胞劃痕愈合實驗結(jié)果顯示，MAF-1A能夠抑制HepG2細(xì)胞的遷移運(yùn)動，并且隨著MAF-1A濃度的增加，HepG2細(xì)胞的愈合面積降低(P<0.05)，表明MAF-1A能夠劑量依賴地抑制HepG2細(xì)胞的遷移。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MAF-1A不但可以抑制HepG2細(xì)胞的增殖，還可抑制HepG2細(xì)胞的遷移運(yùn)動，但對人體正常肝細(xì)胞和紅細(xì)胞的毒性作用不明顯，具有一定的開發(fā)利用價值。然而MAF-1A抗HepG2細(xì)胞作用機(jī)制尚不清楚，有待于進(jìn)一步研究。