伍 燕，杜俊希，張 娟，申利群

(1.興義民族師范學(xué)院，貴州 興義 562400；2.廣西民族大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧550006；3.廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實驗室，廣西 南寧550006）

華麗牛肝菌（Boletus magnificus W.F.Chiu）屬牛肝菌科（Boletaceae）牛肝菌屬（Boletus），又名紅見手青、紅蔥牛肝菌，是一種味道鮮美、經(jīng)濟(jì)價值較高的中小型牛肝菌[1]。在自然界，幾乎所有的牛肝菌都屬于外生菌根菌[2-4]，菌根與特定植物根系形成營養(yǎng)方式密切的共生體，牛肝菌大多以這種方式在生境中生存。目前，已實現(xiàn)人工栽培的牛肝菌是營養(yǎng)方式兼具腐生型的暗褐網(wǎng)柄牛肝菌（Phlebopus portentosus）[5-6]；而美味牛肝菌 （Boletus edulis）、遠(yuǎn)東疣柄牛肝菌（Leccinum extremiorientale）和褐環(huán)乳牛肝菌（Suillus rubinellus）[7-10]均不能在人工培養(yǎng)條件下形成子實體。一方面是對牛肝菌與其宿主植物之間的關(guān)系和作用機(jī)制了解較少；另一方面是未充分了解牛肝菌生活環(huán)境的微生物群落豐富度和多樣性結(jié)構(gòu)。

菌塘（shiro）是由牛肝菌的地下菌絲、宿主根系及周圍的腐質(zhì)土壤結(jié)合形成的團(tuán)狀結(jié)構(gòu)，是牛肝菌菌絲體萌發(fā)和形成子實體的重要條件，對于牛肝菌這種經(jīng)濟(jì)價值高且不能人工栽培的山珍，菌塘的生物學(xué)特性吸引了大量研究者進(jìn)行相關(guān)研究。秦余等[11]運(yùn)用新一代高通量測序技術(shù)對遠(yuǎn)東疣柄牛肝菌（Leccinum extremiorientale）、美味牛肝菌 （Boletus edulis）和小孢粉孢牛肝菌（Tylopilus microsporus）菌塘進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)這3種菌塘中的細(xì)菌以酸酐菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門為主；張舉龍等[12]采用變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)對點(diǎn)柄乳牛肝菌（Suillus granulatus）菌塘研究發(fā)現(xiàn)，菌塘中變形菌門和酸桿菌門菌群的相對豐度較高，是其中的優(yōu)勢菌群；郭霞等[13]研究還發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）對美味牛肝菌（Boletus edulis）菌根生長有促進(jìn)作用。據(jù)《真菌詞典》記載，牛肝菌科是一大類，有35屬、26亞屬超過787種[14]，可食用牛肝菌約200種，由于對牛肝菌環(huán)境微生物組成和結(jié)構(gòu)研究不多，目前對其菌塘生境也缺乏規(guī)律性認(rèn)識。基于此，以華麗牛肝菌菌塘土壤為研究對象，采用高通量測序技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)研究方法，對4個不同地區(qū)盛產(chǎn)牛肝菌采集點(diǎn)的土壤微生物群落特征進(jìn)行研究，找出優(yōu)勢菌群、分析共性，為下一步為華麗牛肝菌的人工栽培研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

2019年8月分別在4個出產(chǎn)華麗牛肝菌的地點(diǎn)采集。興義倉更鎮(zhèn)（平均海拔1 013 m），板栗（Castanea mollissima Blum）樹下，記為XC；興義市烏沙鎮(zhèn)（平均海拔1 300 m），青岡林（Cyclobalanopsis glauca）下，記為XW；安龍縣海子鎮(zhèn)（平均海拔1 500 m），松木林（Pinus yunnanensis Franch.）下，記為XH；安龍縣新橋鎮(zhèn)（平均海拔1 200 m），青岡林下，記為XQ。每個地點(diǎn)選取3處華麗牛肝菌生長旺盛的菌塘，在距菌根2 cm半徑周圍處取土樣，土樣混合后放入4℃冰箱保存[15]。

1.1.2 藥品及試劑

E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit試劑盒，美國OMEGA公司；Qubit3.0 DNA檢測試劑盒，美國Life公司；2×Taq Master Mix，南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司；MagicPure Size Selection DNA Beads，北京全式金生物技術(shù)有限公司；無水乙醇等試劑均為AR級，國藥試劑集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備

Pico-21臺式離心機(jī)，美國賽默飛公司；Bio-Rad PCR擴(kuò)增儀、凝膠成像儀，美國伯樂公司；Q32866 Qubit?3.0熒光計，美國英杰生物技術(shù)有限公司；DYCZ-21電泳槽、DYY-6C型電泳儀電源，北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

稱取200 mg土樣，放入滅菌的2 mL離心管中，加入1 mL 70%乙醇混勻，10 000 r·min-1室溫離心3 min，棄上清。加入1×磷酸鹽緩沖液（PBS）混勻，10 000 r·min-1室溫離心3 min，棄上清，樣品干燥待用。

1.3.2 總DNA 提取和檢測

按照試劑盒 E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit使用說明操作提取總DNA，1%瓊脂糖凝膠檢測DNA完整性。

1.3.3 PCR 擴(kuò)增

1）擴(kuò)增及純化

用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA準(zhǔn)確定量，第一輪PCR以16S rRNA基因V3-V4通用引物進(jìn)行擴(kuò)增（341F:5′-CCCTACACGACGCTTTCC－GATCTG （barcode）CCTACGGGNGGCWGCAG-3′;805R:5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC-3′），擴(kuò)增結(jié)束后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測和純化[16]；第二輪PCR加入Illumina橋式PCR兼容引物擴(kuò)增，對于細(xì)菌擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物和正常擴(kuò)增片段在400 bp以上的PCR產(chǎn)物，選用0.6倍磁珠吸附（Agencourt AMPure XP）。

2）擴(kuò)增條件

PCR擴(kuò)增為30 μL體系：2×Taq masterMix 15 μL，341primerF 1 μL，805primerR 1 μL，基因組DNA 1 μL，用 ddH2O 補(bǔ)足至 30 μL。PCR 擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性5 min；95℃反應(yīng)30 s，45℃反應(yīng)20 s，65℃反應(yīng)30 s，5個循環(huán)；95℃反應(yīng)20 s，55℃反應(yīng)20 s，72℃反應(yīng)30 s，20個循環(huán)；72℃延伸 5 min，轉(zhuǎn)為4℃保存[17]。

1.3.4 測序

PCR產(chǎn)物純化后，采用Illumina MiSeq第二代高通量測序平臺測定16S高變區(qū)域的序列，測序片段為雙向2×300 bp，委托上海生工完成測序。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

高通量測序序列（reads）通過拼接、過濾、去除嵌合體及非特異性擴(kuò)增序列，使用QIIME軟件，繪制操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），依據(jù)OTU數(shù)目變化與聚類相似值之間的關(guān)系圖，從中選擇最佳的相似度值 （similarity）（＞0.97）進(jìn)行OTU分析和分類學(xué)鑒定。每個OTU不少于120個有效堿基，每條OTU對應(yīng)一種代表序列，基于16S RNA基因數(shù)據(jù)庫（RDP數(shù)據(jù)庫、Silva數(shù)據(jù)庫、NCBI 16S數(shù)據(jù)庫）對每一條OTU進(jìn)行16S rRNA基因序列注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌塘多樣性指數(shù)（Alpha）分析

野生華麗牛肝菌生境見圖1。

圖1 野生華麗牛肝菌生境Fig.1 A wild fruiting body from Boletus magnificus

圖1為野生華麗牛肝菌生境，地點(diǎn)為興義倉更鎮(zhèn)，板栗樹下，此處平均海拔1 013 m，年平均氣溫16℃，氣候溫潤多雨。

Alpha多樣性指數(shù)分析可以反映微生物群落的豐度和多樣性，其中表明群落分布豐度（community richness）的指數(shù)有Chao1和ACE，數(shù)值越大說明群落分布豐度好；Shannon和Simpson指數(shù)表明群落分布多樣性（community diversity），Shannon值越大或Simpson值越小，說明群落多樣性越高。各采集點(diǎn)菌塘土壤高通量測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析結(jié)果見表1。

表1 菌塘土壤中細(xì)菌Alpha多樣性分析結(jié)果Tab.1 Analysis and results of bacteria Alpha diversity in shiroes soil

由表1可知，4個采集點(diǎn)的樣品通過高通量測序，共得到384 472條有效序列，樣本聚類得到31 502條有效OTU，樣品的覆蓋指數(shù)（coverage）＞0.94以上，覆蓋率高，能真實反映樣品的測序情況。XQ和XW的Chao1指數(shù)最高，說明樣本的菌群豐度最高；XC和XW的Shannon指數(shù)較高、Simpson指數(shù)較低，說明2個地點(diǎn)的菌群多樣性較豐富。不同土壤樣品中細(xì)菌的稀釋曲線見圖2。

圖2 不同土壤樣品中細(xì)菌的稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curves of bacterias in different soil samples

由圖2可知，4個樣品的稀釋曲線（rarefaction），shannon indexs指數(shù)呈直線上升，后趨向平穩(wěn)，表明測序數(shù)據(jù)能覆蓋菌塘中絕大多數(shù)細(xì)菌信息，曲線在平滑穩(wěn)定后產(chǎn)出的OTU數(shù)趨于穩(wěn)定，其中樣品XH的Shannon指數(shù)稍低，說明該采集地的細(xì)菌多樣性較其他3個菌塘有一定差距。

2.2 各樣品中細(xì)菌類群的相關(guān)性分析

不同菌塘細(xì)菌基于OTU序列的聚類樹見圖3。

圖3 基于OUT序列的樣本聚類樹Fig.3 Clustering tree diagram based on OUT sequence

由圖3可知，XW和XQ聚成一類，并和XC在同一個簇上，XH位于較遠(yuǎn)分支，直觀反映了不同土樣菌群的相似性和差異關(guān)系。不同土壤樣本主成分分析（principal components analysis，PCA）見圖4。

圖4 不同土壤樣本的PCA分析Fig.4 PCA analysis of different soil samples

由圖4可知，XW、XQ和XC散布在相鄰區(qū)域，XH在較遠(yuǎn)的區(qū)域，反映了取樣生境不同，微生物菌群的差異性導(dǎo)致的差異。各樣品間OTU相關(guān)性韋恩圖見圖5。

圖5 不同樣品中細(xì)菌多樣性的相關(guān)性分析Fig.5 The similarity analysis of bacteria diversity in different soil samples

由圖5可知，XQ樣品中的細(xì)菌種類是8 882個、XW樣品中的細(xì)菌種類是8 580個、XH樣品中的細(xì)菌種類是6 481個、XC樣品中的細(xì)菌種類是7 559個；聚類關(guān)系比較近的XQ和XW共有的OTU數(shù)是2 080個，XQ、XW和XC三者共有的OTU數(shù)是1 151個，而4個樣品都共有的OTU數(shù)是818個，占OUT總數(shù)的7.05%；XQ、XW、XH和XC樣品分別與其他樣品發(fā)生重疊的數(shù)是3 350、2 897、2 544和 2 806個，分別占各自總數(shù)的 37.72%、33.76%、39.25%和 37.12%，反映了各自生境中土壤菌群的復(fù)雜性和共性。

2.3 菌塘中細(xì)菌組成分析

屬級水平上不同土壤樣品屬水平分類豐度統(tǒng)計見圖6。

圖6 不同土壤樣品屬水平分類豐度統(tǒng)計Fig.6 Relative abundance statistical figure of genus classification in different soil sample

由圖6可知，4個菌塘可鑒定細(xì)菌分屬于30個門78個屬，主要有變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、厚壁菌門 （Firmicutes）、擬桿菌門 （Bacteroidetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和放線菌門（Actinobacteria）等。

2.3.1 XQ 菌塘細(xì)菌分類

變形菌門占69.06%，下屬主要有伯克氏菌屬（Burkholderia，46.92%）、哈夫尼菌屬 （Hafnia，12.19%）、緩生根瘤菌屬 （Bradyrhizobium，5.32%）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas，2.63%）；酸酐菌門占 15.81%，下屬主要有 Gp1（8.89%）、Gp2（4.95%）和 Gp3 （1.97%）；芽單胞菌門主要是芽單胞菌屬 （Gemmatimonadetes，2.22%）；此外還有WPS-1 genera incertae sedis（1.07%）和 WPS-2 genera incertae sedis（1.36%）。

2.3.2 XW 菌塘細(xì)菌分類

變形菌門占58.34%，下屬主要有伯克氏菌屬（Burkholderia，41.51%）、鞘氨醇單胞菌屬 （Sphingomonas，11.08%）和緩生根瘤菌屬 （Bradyrhizobium，2.75%）；酸酐菌門占24.04%，主要的屬有Gp1（15.39%）、Gp2（4.26%）和 Gp3（4.39%）；芽單胞菌門主要是芽單胞菌屬（Gemmatimonadetes，5.69%）；此外有 WPS-1 genera incertae sedis（2.32%）和WPS-2 genera incertae sedis（3.21%）。

2.3.3 XC 菌塘細(xì)菌分類

酸酐菌門占 62.39%，下屬主要有 Gp1（49.09%）、Gp2 （5.09%）和 Gp3 （8.21%）；變形菌門占 14.70%，主要的屬有鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas，11.64%）、緩生根瘤菌屬 （Bradyrhizobium，2.17%）和伯克氏菌屬（Burkholderia，0.89%）；芽單胞菌門主要是芽單胞菌屬 （Gemmatimonadetes，5.07%）；此外有 WPS-1 genera incertae sedis（7.51%）和WPS-2 genera incertae sedis（7.42%）。

2.3.4 XH 菌塘細(xì)菌分類

變形菌門占72.13%，主要的屬有沙雷氏菌屬（Serratia，65.23%）；酸酐菌門占 2.97%，主要有Gp1（1.31%）和 Gp6（0.92%）；此外還有 WPS-1 genera incertae sedis（9.07%）。

2.4 基于屬水平的優(yōu)勢細(xì)菌分析

在屬水平上，把4個菌塘中相對豐度在5%以上的細(xì)菌列為優(yōu)勢菌，統(tǒng)計結(jié)果見表2。

表2 4個樣品中優(yōu)勢細(xì)菌及相對豐度Tab.2 Dominant bacteria and relative abundance of 4 samples

由表2可知，4個菌塘中的優(yōu)勢菌各有特點(diǎn)，XQ和XW菌塘含有大量伯克氏菌屬（46.92%～41.51%，Burkholderia），這2個菌塘位于青岡林下屬于原生態(tài)環(huán)境，人類活動較少，生境大致相同，優(yōu)勢菌群均是以固氮菌和解鉀為主的伯克氏菌屬；XC取樣于板栗林下，人工打藥、施肥活動頻繁，Gp1含量較高（49.09%），據(jù)王繼玥等[18]對Pb污染后的三葉草土壤細(xì)菌多樣性變化分析認(rèn)為，Pb污染會導(dǎo)致土壤環(huán)境中酸酐菌門的Gp1含量增高，菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，推測是人類活動使得倉更當(dāng)?shù)赝寥乐亟饘?、農(nóng)藥有殘留，導(dǎo)致Gp1含量升高；在XH菌塘中沙雷氏菌屬（Serratia，65.23%）占比較高，可能因松林樹種單一，土壤微生物多樣性呈下降趨勢，加之人為干擾等原因使得該松林中磷肥含量偏多，與解磷作用相關(guān)的沙雷氏菌屬含量比較高[19]。此外，哈夫尼菌屬（Hafnia）、Gp2、緩生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、芽單胞菌屬（Gemmatimonadetes）、WPS-1 genera incertae sedis和WPS-2 genera incertae sedis在相應(yīng)菌塘中豐度也較高。對4個菌塘中相對豐度前48個屬的細(xì)菌進(jìn)行熱圖-聚類分析，不同顏色代表豐度的高低，越紅說明豐度越高，分析結(jié)果見圖7。

圖7 不同土壤樣本屬分類豐度熱圖Fig.7 Relative abundance heatmap of genus classification in different soil sample

由圖7可知，從橫向看，4個菌塘中豐度較高的是變形菌門和酸酐菌門，優(yōu)勢菌排前三的是伯克氏菌屬、Gp1和沙雷氏菌屬。從縱向看，XW菌塘細(xì)菌多樣性較好，紅色和淺紅色貫穿在48個屬中，其次是菌塘XQ和XC，XH菌塘因沙雷氏菌屬的比例高導(dǎo)致菌群結(jié)構(gòu)多樣性簡單。

3 結(jié)論

采用高通量測序技術(shù)對華麗牛肝菌4個菌塘細(xì)菌分析認(rèn)為，4個菌塘中變形菌門、酸桿菌門是主要的細(xì)菌類群，在XW（烏沙）和XQ（新橋）菌群中，變形菌門的伯克氏菌屬是優(yōu)勢菌；XC（倉更）菌群中，酸桿菌門的Gp1是優(yōu)勢菌；XH（海子）菌群中，變形菌門的沙雷氏菌屬是優(yōu)勢菌。可見，各菌塘優(yōu)勢菌主要集中在固氮力較強(qiáng)和分解有機(jī)磷、鉀的菌，且優(yōu)勢菌屬集中在變形菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門和硬壁菌門，同時WPS-1 genera incertae sedis和WPS-2 genera incertae sedis在菌塘中也占一定比值，表明牛肝菌生長的土壤環(huán)境主要由這些菌群組成，研究結(jié)果為華麗牛肝菌的人工馴化栽培提供了參考。

4個菌塘細(xì)菌豐度的差異與取樣的環(huán)境、樹種、土壤的特質(zhì)和人類活動有關(guān)[20]。通過對華麗牛肝菌菌塘細(xì)菌類型的研究，發(fā)現(xiàn)人類活動多，例如施肥、打藥的地方和人類活動少的地方相比，菌塘的菌群種類在多樣性結(jié)構(gòu)方面有較大差異。如XW和XQ菌塘都采自青岡林，人類活動干擾少，二者細(xì)菌組成和多樣性相差不大；XC和XH菌塘分別采自板栗林和松林，二者的細(xì)菌組成和多樣性都有差異，雖然這種微生物層面的變化對當(dāng)?shù)匾吧秤镁漠a(chǎn)量和交易量影響較小，但對野生食用菌的品質(zhì)如農(nóng)藥殘留、重金屬超標(biāo)有一定影響[21]，因此，注意保護(hù)當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境，保護(hù)野生牛肝菌的種類和產(chǎn)量在未來是重要的任務(wù)。