張學(xué)新，劉子寧，王玉茜，楊 悅**

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271018）

靈芝 （Ganoderma lucidum），屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）傘菌綱（Agaricomycetes）多孔菌目（Polyporales）靈芝菌科 （Ganodermataceae）靈芝屬（Ganoderma）[1]，是一種珍貴的藥用真菌。中國(guó)是最早人工栽培和利用靈芝藥用價(jià)值的國(guó)家，《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有關(guān)于赤芝的記錄，其性質(zhì)溫和，可以補(bǔ)中氣，延緩衰老，對(duì)記憶力有改善效果，故又有“芝草、仙草”之稱[2]。靈芝中含有很多對(duì)人體有益的生物活性成分及營(yíng)養(yǎng)成分，如多糖[3]、三萜類化合物[4]、礦物質(zhì)[5]、蛋白質(zhì)、氨基酸[6]等，具有提高人體免疫力、抗氧化、保護(hù)修復(fù)消化系統(tǒng)、改善血液循環(huán)等作用[7]。目前很多行業(yè)已經(jīng)開(kāi)始研究和推出與靈芝有關(guān)的產(chǎn)品，如靈芝膠囊、靈芝茶和靈芝精華等。

多糖（polysaccharide）是一類由糖苷鍵連接單糖而成的天然高分子碳水化合物，在維持生物基礎(chǔ)活動(dòng)中起著重要作用，可以參與人體內(nèi)的細(xì)胞代謝及生理調(diào)節(jié)過(guò)程。多糖在自然界中廣泛存在，依據(jù)來(lái)源可分為動(dòng)物多糖、植物多糖和真菌多糖[8]。不同生長(zhǎng)區(qū)域的空氣條件、土壤條件和光線等都會(huì)影響靈芝中多糖的含量[9]。泰山靈芝多糖得率最多可達(dá)1.58%，龍泉產(chǎn)粉靈芝多糖可達(dá)2.18%，佳木斯的云頭狀靈芝多糖最多為1.58%，廣州靈芝多糖可達(dá)1.61%，韓國(guó)靈芝多糖最多可到1.91%，日本赤靈芝多糖可到1.34%[10]。多糖的生物活性主要取決于其特定的空間結(jié)構(gòu)，包括一級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)，其中高級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)多糖功能的影響較大[11]。由于特殊的β-二股繩狀螺旋型立體構(gòu)型，多裂褶多糖有抑制腫瘤的作用，然而某些特別的物質(zhì)如尿素，會(huì)改變多糖分子構(gòu)型從而導(dǎo)致該作用受損或完全喪失[12]。除葡萄糖外，從靈芝中提取的多糖還有阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖等[13]。作為靈芝中的主要生物活性成分，多糖有著抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗輻射、抗氧化等多種重要作用[14-15]。

靈芝作為一種可食用真菌，已經(jīng)進(jìn)入我國(guó)藥食同源原料目錄，其重要的生物活性已經(jīng)得到人們的關(guān)注和認(rèn)可。靈芝多糖是靈芝中的重要活性組分，為了對(duì)其最大化的開(kāi)發(fā)和利用，一些先進(jìn)的物理技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于對(duì)其結(jié)構(gòu)和生物活性功能的研究[16-18]。國(guó)內(nèi)外靈芝品種繁多，不同品種靈芝子實(shí)體的外觀形態(tài)以及多糖含量各不相同。通過(guò)測(cè)定12個(gè)不同品種靈芝多糖的含量及體外抗氧化能力，并對(duì)產(chǎn)量最高的靈芝粗多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

12個(gè)靈芝品種，均來(lái)自山東省泰安市農(nóng)科院食用菌研究所，分別為日本進(jìn)口（1號(hào)）、泰山野生型（4號(hào)）、泰山野生型（8號(hào)）、泰山野生型（64號(hào)）、泰山野生型（76號(hào)）、韓芝（14號(hào)）、鹿角靈芝（18號(hào)）、泰山1號(hào)（20號(hào)）、紫芝（31號(hào)）、紅芝（32號(hào)）、樹(shù)舌（40號(hào)）、樹(shù)舌（42號(hào)）。

無(wú)水乙醇、葡萄糖、鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉、三氯化鐵，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸（VC），天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司；1,1-2,6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT），上海源葉生物有限公司；三氯乙酸、硫酸亞鐵、正丁醇、氯仿、溴化鉀，天津市巴斯夫化工有限公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

FW-135中藥粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；DHG-9011A恒溫干燥箱，海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TCX-200S數(shù)控超聲波清洗機(jī)，濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司；UV-5500紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；TDL-5-A離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；NicoLet iS 10型紅外光譜儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.3.1 靈芝粗多糖的提取與得率測(cè)定

利用超聲波輔助水提法[19]，將靈芝子實(shí)體放于烘箱中80℃烘至恒重，用中藥粉碎機(jī)打碎，過(guò)80目篩得到靈芝粉末。稱取1.5 g靈芝粉末放入燒杯中，以粉末和液體比1∶50加水；250 W、80℃超聲波輔助提取40 min，將超聲后的液體4 000 r·min-1離心5 min；取上清液，加95%乙醇溶液至乙醇體積分?jǐn)?shù)為 75%，搖勻，4℃過(guò)夜。4 000 r·min-1離心 15 min，棄上清液，沉淀用去離子水溶解并轉(zhuǎn)移至容量瓶中加水定容至100 mL。每個(gè)樣品如此重復(fù)操作，得到不同品種的多糖樣液，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

采取苯酚-硫酸法[16]測(cè)定多糖得率，取6支試管，編號(hào) 1～6，分別加入 0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL 的 100 μg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，后補(bǔ)充去離子水至2 mL，得到濃度分別為0、10 μg·mL-1、20 μg·mL-1、30 μg·mL-1、40 μg·mL-1、50 μg·mL-1的葡萄糖待測(cè)液；再分別加入1 mL 5%苯酚溶液，充分混合，沿內(nèi)壁緩慢加入5 mL濃硫酸，快速充分搖勻，于室溫條件下靜置20 min后，測(cè)定各組溶液在490 nm處的吸光度值。根據(jù)濃度和所得數(shù)據(jù)繪制葡萄糖濃度-吸光度值標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)。

準(zhǔn)確吸取不同樣品2 mL多糖溶液于各個(gè)試管中，重復(fù)上述試驗(yàn)步驟，測(cè)定混合液在490 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，依據(jù)不同樣品溶液的吸光度值和繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算靈芝多糖得率。多糖得率（Y,%）計(jì)算公式為：

式中：C表示樣本液多糖濃度（μg·mL-1）；V0表示顯色液總體積（mL）；V1表示靈芝多糖樣液的總體積（mL）；V2表示顯色步驟中添加的多糖樣液的體積（mL）；M表示稱取的靈芝粉末的重量（1.5 g）。

1.3.2 靈芝粗多糖體外抗氧化活性的研究

取不同種類的多糖樣液各2 mL，向其中加入2 mL的0.2 mmol·L-1DPPH溶液，充分搖勻，于室溫下遮光放置15 min，4 000 r·min-1離心15 min。測(cè)定上清液在517 nm波長(zhǎng)下的吸光度值[20]。以2,6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT）和抗壞血酸（VC）為陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)，重復(fù)上述步驟，測(cè)定吸光度值。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。DPPH自由基清除率（D，%）計(jì)算公式為：

式中：A0表示2 mL DPPH溶液+2 mL 95%乙醇的吸光值；Ai表示2 mL DPPH溶液+2 mL樣品液的吸光值；Aj表示2 mL樣品液+2 mL95%乙醇的吸光值。

精確量取1 mL多糖樣液，向其中依次加入2.5 mL磷酸緩沖液和1.0 mL鐵氰化鉀溶液，充分混合后在50℃水浴鍋中加熱反應(yīng)20 min，然后加入2.5 mL三氯乙酸溶液，混勻后放入離心機(jī)，2 000 r·min-1離心10 min。取2.5 mL上清液，向其中加入0.5 mL三氯化鐵溶液和2.5 mL去離子水，充分混勻，在室溫條件下靜置10 min，測(cè)定混合液在700 nm波長(zhǎng)時(shí)的吸光度值[21]。以VC為陽(yáng)性對(duì)照，重復(fù)上述試驗(yàn)步驟并測(cè)定吸光度值。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3.3 靈芝粗多糖的分離純化與理化分析

采用sevag法[22]除蛋白，在樣液中加入約為其體積1/3的sevag試劑，震蕩20 min后靜置，4 000 r·min-1離心5 min，取上層液體并去除交界處白色的變性蛋白質(zhì)。為完全去除蛋白質(zhì)，需要多次重復(fù)操作，直到離心后溶液交界處不再有白色沉淀出現(xiàn)。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

在脫蛋白多糖溶液中加入1.5%活性炭，進(jìn)行脫色處理[23]；在水浴鍋中58℃加熱30 min，不斷攪拌，抽濾，向?yàn)V液中加入80%乙醇靜置12 h；離心，去除活性炭，將剩余沉淀用無(wú)水乙醇進(jìn)行多次洗滌，放入烘箱內(nèi)干燥即得到精制多糖。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

取1 mg精制多糖，與100 mg溴化鉀混合，在瑪瑙研缽中研磨10 min，在紅外光譜儀中進(jìn)行壓片分析。測(cè)量紅外光譜范圍為400 cm-1～4 000 cm-1。測(cè)定前先不加樣品，建立溴化鉀背景基線掃描。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同品種靈芝粗多糖得率的測(cè)定

2.1.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

試驗(yàn)所得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose standard curve

由圖1可知，線性回歸方程：y＝0.014 3x+0.008 1，R2＝0.999 4，表明在 0～50 μg·mL-1的線性范圍內(nèi)葡萄糖濃度與吸光度有良好的線性關(guān)系。

2.1.2 多糖得率

多糖在濃硫酸作用下水解生成單糖，迅速脫水生成糠醛衍生物，與苯酚縮合成棕黃色化合物[16]。多糖濃度及得率得率見(jiàn)圖2，不同品種靈芝的吸光度見(jiàn)表1。

圖2 不同靈芝品種的多糖得率Fig.2 Polysaccharide yield of different Ganoderma lucidum species

表1 不同品種靈芝的多糖吸光值Tab.1 Absorbance values of different Ganoderma lucidum species

由圖2及表1可知，不同品種的靈芝多糖得率不同且差距較大，但試驗(yàn)中所測(cè)定的12種不同品種的靈芝多糖得率均在0.6%～2.6%。得率最高的是日本進(jìn)口樣品（1號(hào)）為2.590%，鹿角靈芝樣品（18號(hào)）的多糖得率為2.090%；多糖得率最少的32號(hào)樣品為0.604%，為1號(hào)樣品多糖得率的約1/4。

2.2 不同品種靈芝粗多糖抗氧化活性

2.2.1 DPPH 自由基清除率測(cè)定

DPPH自由基的清除率可評(píng)估其抗氧化性強(qiáng)度[24]，不同品種靈芝的DPPH清除率見(jiàn)圖3。

圖3 不同品種靈芝的DPPH清除率Fig.3 DPPH radical scavenging rate of different Ganoderma lucidum species

由圖3可知，陽(yáng)性對(duì)照組VC在5 mg·mL-1時(shí)的清除率為95.3%、甲酚（BHT）在5 mg·mL-1時(shí)的清除率為95.0%。不同品種靈芝多糖的DPPH清除率也有所不同，12種靈芝多糖樣品清除率在54%～95%。其中，清除率最高的是日本進(jìn)口樣品（1號(hào)），為95.0%，鹿角靈芝樣品（18號(hào)）其次，清除率為89.4%，可推斷2種樣品有較好的抗氧化能力；紅芝樣品（32號(hào)）清除率最低，為54.9%。

2.2.2 還原能力測(cè)定

抗氧化物可以通過(guò)提供電子阻礙Fe3+和鐵氰復(fù)合物形成亞鐵離子的形式，從而實(shí)現(xiàn)還原能力[25]，通過(guò)不同多糖樣液反應(yīng)后的吸光度值表示其還原能力，即其抗氧化能力，其還原能力數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)見(jiàn)圖4。

圖4 不同品種靈芝的還原能力Fig.4 Reducing power of different Ganoderma lucidum species

由圖4可知，靈芝多糖具有一定還原能力，日本進(jìn)口樣品（1號(hào)）的還原能力最高，為0.417，其次為鹿角靈芝樣品（18號(hào)）還原能力為0.387；紅芝樣品（32號(hào)）的還原能力最低，為0.207。

2.3 結(jié)構(gòu)解析

基于以上試驗(yàn)結(jié)果，選擇多糖得率最高的1號(hào)樣品，經(jīng)分離純化后在波長(zhǎng)400 cm-1～4 000 cm-1對(duì)其進(jìn)行紅外光譜分析，其紅外光譜見(jiàn)圖5。

圖5 1號(hào)樣品靈芝多糖的紅外光譜Fig.5 IR spetra of NO.1 Ganoderma lucidum polysaccharide

由圖5可知日本進(jìn)口樣品（1號(hào)）多糖的紅外吸收光譜在 3 237.30 cm-1、2 926.14 cm-1、1 617.34 cm-1、1 420.29 cm-1、1 074 cm-1等多處有明顯的多糖特征譜帶。O-H鍵的伸縮振動(dòng)導(dǎo)致3 237.30 cm-1附近出現(xiàn)吸收峰；2 926 cm-1附近的吸收峰是由于C-H鍵的伸縮振動(dòng)；1 617.34 cm-1附近的吸收峰是由結(jié)合水引起的；C-O鍵的伸縮振動(dòng)引起1 420 cm-1附近的吸收峰，而出現(xiàn)在1 034 cm-1附近的吸收峰是吡喃環(huán)非對(duì)稱環(huán)伸縮振動(dòng)引起的，這些都是糖類的特征鍵[26]。

3 結(jié)論

通過(guò)超聲輔助水提法提取靈芝多糖并測(cè)定其得率，對(duì)其進(jìn)行體外抗氧化能力的測(cè)定，對(duì)日本進(jìn)口（1號(hào)）靈芝粗多糖進(jìn)行分離純化，對(duì)結(jié)構(gòu)表征進(jìn)行初步研究。結(jié)果顯示，所測(cè)不同品種的靈芝多糖得率不同，日本進(jìn)口樣品（1號(hào)）得率最高，為2.59%；紅芝樣品（32號(hào)）的多糖得率最低，為0.604%。不同品種靈芝多糖的抗氧化效果也不同，其中日本進(jìn)口（1號(hào)）多糖樣品的抗氧化性最強(qiáng)，DPPH自由基清除率為94%，還原力為0.417，其次為鹿角靈芝（18號(hào)）樣品，其DPPH自由基清除率為89.4%，還原力為0.387；32號(hào)多糖樣品的抗氧化性最弱，清除率為0.549%，還原力為0.207。將多糖得率最高的1號(hào)樣品的靈芝粗多糖進(jìn)行分離純化，所得的精制多糖經(jīng)紅外光譜分析，得出多糖的結(jié)構(gòu)，該多糖具有C-H鍵、C-O鍵、-OH等多種典型的多糖特征鍵。

靈芝多糖具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等藥理作用，可應(yīng)用于食品和醫(yī)療保健行業(yè)。對(duì)不同品種靈芝多糖得率的測(cè)定及其體外抗氧化活性的差異進(jìn)行研究，對(duì)于靈芝多糖的利用以及提取靈芝多糖時(shí)對(duì)不同品種靈芝的選擇提供了技術(shù)支持。未來(lái)可繼續(xù)對(duì)不同品種靈芝的組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入研究，以建立更為詳盡的評(píng)價(jià)體系，為靈芝多糖的利用提供理論依據(jù)。