段春燕，井明博，宋 曦

(1.隴東學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，甘肅 慶陽 745000；2.甘肅省高校隴東生物資源保護(hù)與利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 慶陽 745000；3.隴東學(xué)院 農(nóng)林科技學(xué)院，甘肅 慶陽 745000)

大腸桿菌是目前掌握最為成熟的基因克隆表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)常被用作蛋白質(zhì)分泌和表達(dá)的宿主菌，它遺傳背景清晰、轉(zhuǎn)化效率高、表達(dá)周期短、操作簡(jiǎn)單，因此使用范圍很廣。但是大腸桿菌也有一些不足之處：大腸桿菌表達(dá)的蛋白質(zhì)形成包涵體，給下游的純化處理帶來不便，同時(shí)有些表達(dá)蛋白無法分泌至胞外，不利于測(cè)定酶的活性和直接使用[1]?？莶菅挎邨U菌是基因工程中又一個(gè)被廣泛使用的表達(dá)系統(tǒng)，常作為表達(dá)酶和外源蛋白的宿主菌使用。對(duì)于枯草芽孢桿菌的研究可以追溯到100年前，初期側(cè)重于形態(tài)觀察等方面的研究，1958年Spizizen在實(shí)驗(yàn)中采用了化學(xué)試劑，進(jìn)而制備了枯草芽孢桿菌的感受態(tài)細(xì)胞，極大地促進(jìn)了其在基因工程研究方面的進(jìn)展[2]。1997年，枯草芽孢桿菌模式菌株168的基因組完成測(cè)序，全基因組共4.2Mb，含有4214810個(gè)堿基，200個(gè)調(diào)控蛋白參與1500個(gè)操縱子的調(diào)控，蛋白編碼序列占87%的基因組。在4106個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中，已經(jīng)可以明確或預(yù)測(cè)約58%的蛋白質(zhì)編碼基因功能[3]和約30%的產(chǎn)物功能[4]，為研究枯草芽孢桿菌蛋白質(zhì)的分泌機(jī)理提供了重要理論依據(jù)，推動(dòng)了相關(guān)研究的進(jìn)行[5]?，F(xiàn)在枯草芽孢桿菌已經(jīng)成為一種成熟的基因工程表達(dá)系統(tǒng)，飼料、食品等行業(yè)大多利用枯草芽孢桿菌高效表達(dá)系統(tǒng)來生產(chǎn)內(nèi)源生化產(chǎn)物，其應(yīng)用之廣僅次于大腸桿菌[6]。

1 枯草芽孢桿菌基因表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)

1.1 容易獲得

枯草芽孢桿菌廣泛分布在土壤、腐敗的有機(jī)物以及水環(huán)境中，容易在枯草浸汁中繁殖。

1.2 遺傳操作簡(jiǎn)單

枯草芽孢桿菌的基因組測(cè)序已于1997年完成，DNA遺傳背景清晰，便于操作[7]。質(zhì)粒載體如pUB110、pC194、HCMC和大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒如pHT43、pSP10等的研究應(yīng)用，為枯草芽孢桿菌在基因工程中的發(fā)展應(yīng)用提供了便利[8]。

1.3 蛋白分泌系統(tǒng)功能完善

枯草芽孢桿菌蛋白質(zhì)分泌能力強(qiáng)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多種蛋白質(zhì)的有效分泌，分泌的時(shí)候，并不存在包涵體的形成,可以直接透過細(xì)胞膜向培養(yǎng)基釋放，回收純化目的蛋白質(zhì)方法簡(jiǎn)單，

1.4 發(fā)酵工藝成熟

枯草芽孢桿菌嗜溫好氧，培養(yǎng)基配方簡(jiǎn)單，代謝產(chǎn)物中含有蛋白酶、淀粉酶等酶類，在工業(yè)上應(yīng)用成熟。

1.5 非致病性

生理生化背景清晰，細(xì)胞壁組成簡(jiǎn)單，只含有肽聚糖和磷壁酸，不含內(nèi)毒素，可以在動(dòng)物腸道中繁殖，為正常的腸道微生物，被美國食品藥品管理局認(rèn)為是生物安全級(jí)別的微生物，在飼用酶和益生菌的生產(chǎn)上具有極大的優(yōu)勢(shì)[9]。

2 枯草芽孢桿菌信號(hào)肽依賴分泌胞外蛋白途徑

在外源基因的克隆表達(dá)過程中，重組蛋白一般以3種形式表達(dá)，包括細(xì)胞外的分泌表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)的可溶性表達(dá)和在細(xì)胞內(nèi)形成不溶性的胞涵體?？莶菅挎邨U菌為格蘭氏陽性菌，只有一層細(xì)胞膜，蛋白可直接分泌至胞外而不形成胞涵體，其表達(dá)產(chǎn)物多數(shù)具有天然構(gòu)象和生物活性，產(chǎn)物較易純化，極大地方便了外源蛋白的下游加工和酶活測(cè)定，經(jīng)枯草芽孢桿菌分泌的很多外源蛋白質(zhì)已經(jīng)應(yīng)用于益生菌、酶制劑等工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域[10]，占有很大的市場(chǎng)份額。根據(jù)SubtiList數(shù)據(jù)庫提供的SignalP算法軟件，共294種蛋白質(zhì)被預(yù)測(cè)為分泌蛋白質(zhì)[11]。根據(jù)蛋白質(zhì)分泌是否涉及到信號(hào)肽，可以將分泌途徑分為兩種：信號(hào)肽依賴以及不依賴的分泌途徑[12]。其中枯草芽孢桿菌分泌的蛋白質(zhì)大部分是依托于信號(hào)肽依賴的分泌途徑分泌至胞外，因此這種途徑也稱為典型性途徑。

2.1 信號(hào)肽的研究進(jìn)展

20世紀(jì)70年代初，美國的細(xì)胞生物學(xué)教授Gunter Blobel提出信號(hào)肽假說。該假說理論認(rèn)為信號(hào)肽位于蛋白的N端，可以結(jié)合并引導(dǎo)核糖體附著在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的極性通道內(nèi)，肽鏈不斷延伸并穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，進(jìn)而延伸到腔內(nèi)，信號(hào)肽酶水解信號(hào)肽，正確折疊肽鏈，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)向胞外的轉(zhuǎn)運(yùn)[13]。信號(hào)肽是一段連續(xù)的氨基酸序列，用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)跨膜運(yùn)輸，它一般由10～40個(gè)左右的氨基酸殘基構(gòu)成，包括三個(gè)區(qū)域：氨基端區(qū)(N端)、疏水端區(qū)(H端)和羧基端區(qū)(C區(qū))。其中N端由賴氨酸和精氨酸等帶正電荷的氨基酸組成，氨基酸殘基與細(xì)胞膜帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)相互作用。H端的長度以及疏水性在蛋白分泌中起著重要的作用，主要由異亮氨酸等20個(gè)或超過20個(gè)的中性氨基酸構(gòu)成，疏水氨基酸殘基接觸到膜脂，形成α螺旋結(jié)構(gòu)，在蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)位起始階段發(fā)揮重要作用。C區(qū)又稱為加工區(qū)，存在絲氨酸等小分子氨基酸，在蛋白轉(zhuǎn)位中或轉(zhuǎn)位后，信號(hào)多肽在C區(qū)被信號(hào)多肽酶識(shí)別并切割，隨后信號(hào)多肽被降解，蛋白質(zhì)被釋放至胞外[14]。

細(xì)胞外分泌表達(dá)是外源基因克隆表達(dá)中最為理想的表達(dá)形式，但是大部分外源蛋白都會(huì)在細(xì)胞內(nèi)形成包涵體，只有少數(shù)外源蛋白可以在細(xì)胞外分泌表達(dá)。為了讓許多原本不能分泌至胞外的外源蛋白進(jìn)行細(xì)胞外分泌表達(dá)，目前解決方法多為直接利用表達(dá)宿主的信號(hào)肽序列或?qū)d體的啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)后插入編碼信號(hào)肽序列來引導(dǎo)外源蛋白胞外分泌[15]。有研究表明，信號(hào)肽連接后，在大腸桿菌、芽孢桿菌和乳酸桿菌等原核表達(dá)系統(tǒng)中分泌和表達(dá)了多種外源基因。同時(shí)信號(hào)肽在畢赤酵母等真核表達(dá)系統(tǒng)中也得到了廣泛的應(yīng)用。如魏薔等將信號(hào)肽插入豬瘟病毒E2蛋白基因，實(shí)現(xiàn)了該基因在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的分泌表達(dá)，其中g(shù)p67信號(hào)肽可使E2基因分泌表達(dá)量、純度、產(chǎn)率都得到較大提高[16]。祝發(fā)明等構(gòu)建了枯草芽孢桿菌Tat信號(hào)肽，實(shí)現(xiàn)了青霉素G酰化酶(PGA)在枯草芽孢桿菌中的分泌表達(dá)，其中最佳信號(hào)肽可引導(dǎo)PGA的表達(dá)酶活高達(dá)0.83U/mL[17]。但是信號(hào)肽與目的蛋白質(zhì)之間具有適配性，如Brockmeier等人以角質(zhì)酶和脂解酶為例，通過高通量篩選的方法建立了信號(hào)肽文庫，以期有效篩選枯草芽孢桿菌sec途徑中的148個(gè)信號(hào)肽。結(jié)果顯示，兩者間并不存在對(duì)應(yīng)關(guān)系，148個(gè)信號(hào)肽能引導(dǎo)角質(zhì)酶基因在枯草芽孢桿菌中表達(dá)，但最有效促進(jìn)角質(zhì)酶分泌的信號(hào)肽引導(dǎo)脂解酶分泌的水平很低，僅為最高分泌量的5%[18]，即使是同一種蛋白，用類型不同的信號(hào)肽進(jìn)行引導(dǎo)，多數(shù)均可以表達(dá)，但分泌效率顯著不同。因此選擇合適的信號(hào)肽是影響蛋白質(zhì)產(chǎn)量的重要因素。

2.2 枯草芽孢桿菌分泌胞外蛋白途徑

枯草芽孢桿菌中至少存在4種信號(hào)肽依賴分泌途徑，具體為Sec途徑、Tat途徑、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子途徑和假菌絲蛋白輸出途徑[19]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子途徑和假菌絲蛋白輸出途徑只輸出特定蛋白質(zhì)，且分子量相對(duì)較小，目前研究較為清楚的是Sec途徑和Tat途徑，其中Sec途徑廣泛應(yīng)用于枯草桿菌分泌蛋白質(zhì)，信號(hào)肽分為兩類：I型普通型信號(hào)肽、C區(qū)含有脂蛋白盒子的Ⅱ型信號(hào)肽。Tat途徑通常情況下僅對(duì)組裝成熟的蛋白質(zhì)進(jìn)行分泌，信號(hào)肽中一般包括兩個(gè)相鄰氨酸殘基[20]。

Sec(general secretory pathway)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑。Sec途徑是主要的蛋白分泌途徑，很多文獻(xiàn)中外源表達(dá)蛋白的分泌主要依托于Sec途徑來實(shí)現(xiàn)[8]，對(duì)于枯草芽孢桿菌來講，大約存在著三百種分泌蛋白[21]，很多分泌蛋白向胞外的轉(zhuǎn)移主要依托于Sec途徑來實(shí)現(xiàn)，Sec轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，發(fā)揮著重要作用的編碼蛋白為SecA、SecD、SecE、SecF、SecY、ffh、ftsY。SecA本質(zhì)上屬于一種ATP酶，依托于ATP的水解驅(qū)動(dòng)分泌蛋白前體穿膜，而SecYEG的構(gòu)成主要包括了SecE、SecY和SecG，從蛋白轉(zhuǎn)移酶的角度來說，SecD7和SecF作為其重要的輔助成分[22]。在Sec途徑中，核糖體會(huì)先合成有著信號(hào)肽的分泌蛋白前體，此時(shí)蛋白為未折疊狀態(tài)。Sec蛋白的ATP酶對(duì)ATP進(jìn)行水解，信號(hào)肽在這種情況下將會(huì)引導(dǎo)分泌蛋白前體，向細(xì)胞膜外的轉(zhuǎn)移主要依托于極性通道來實(shí)現(xiàn)，通道蛋白的構(gòu)成主要包括了一組膜蛋白，其主要的職責(zé)是對(duì)分泌蛋白的細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行定位和轉(zhuǎn)移[23]，分泌蛋白以肽鏈形式在轉(zhuǎn)移階段存在。在穿過細(xì)胞膜后，信號(hào)肽酶在C區(qū)切除信號(hào)肽，蛋白質(zhì)被正確折疊，并穿過細(xì)胞壁，最終作為成熟蛋白分泌到培養(yǎng)基中[24]，詳見圖1[25]。

圖1 枯草芽孢桿菌蛋白質(zhì)Sec途徑轉(zhuǎn)移機(jī)制

Sec途徑是枯草芽孢桿菌分泌胞外蛋白質(zhì)的主要途徑，也是酶制劑工業(yè)化生產(chǎn)的主要途徑，但經(jīng)Sec途徑可成功分泌的外源蛋白較少，而且表達(dá)量并不高[26]。主要原因如下：

(1)效率較低。Sec 轉(zhuǎn)運(yùn)途徑只能將以非折疊狀態(tài)即多肽鏈形式存在的分泌蛋白前體從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜外，但在細(xì)胞質(zhì)中已經(jīng)折疊完全的蛋白質(zhì)不能通過該途徑轉(zhuǎn)移；

(2)蛋白降解。經(jīng)sec途徑轉(zhuǎn)運(yùn)的外源蛋白在轉(zhuǎn)移到膜外后才進(jìn)行折疊，但這一過程比較慢，有時(shí)來不及折疊就會(huì)被蛋白酶降解，降低了外源蛋白的表達(dá)量。

(3)錯(cuò)誤折疊。王光強(qiáng)等嘗試用不同的Sec信號(hào)肽來引導(dǎo)分泌表達(dá)耐熱乳糖酶BgaB，均分泌失敗，利用python語言編寫的程序分析表明，細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)的N端較容易折疊成高級(jí)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致外源蛋白無法進(jìn)入分泌途徑而失敗。

(4)膜定位能力差。

Tat(twin-arginine translocation)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑。2000年Jongbloed等通過功能基因組的分析發(fā)現(xiàn)Tat轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，這也是研究較為清楚的另一種蛋白分泌途徑，與Sec轉(zhuǎn)運(yùn)途徑有很大區(qū)別的是，該途徑可以將折疊緊密的蛋白或者多亞基酶復(fù)合物直接分泌到胞外，而Sec轉(zhuǎn)運(yùn)途徑只能轉(zhuǎn)移多肽鏈型式的蛋白。除枯草芽孢桿菌外，如一些植物葉綠體和細(xì)菌如大腸桿菌等均存在該途徑[27]。

Tat途徑的典型特征為分泌蛋白信號(hào)肽中兩個(gè)精氨酸殘基相鄰，經(jīng)此途徑分沁的蛋白大多數(shù)都帶有聯(lián)精氨酸信號(hào)肽。Tat途徑由TatA(3個(gè)TatA/B/E的同源基因)和TatC(2個(gè)TatC的同源基因)組成[28]，其中3個(gè)TatA/B/E同源基因的跨膜和兩親性雙螺旋在蛋白分泌過程中起著關(guān)鍵性的作用。首先，蛋白信號(hào)肽雙精氨酸前體與TatC相連，隨后TatC和TatB再相連，在具有跨膜PH梯度下，再連入TatA，最后，TatB調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移折疊好的基質(zhì)從TatC轉(zhuǎn)移到Tat孔，具體途徑如圖2[29]。

圖2 枯草芽孢桿菌蛋白質(zhì)Tat途徑轉(zhuǎn)移機(jī)制

Tat途徑的研究多集中于大腸桿菌上，berk等發(fā)現(xiàn)大腸桿菌中Tat基質(zhì)在輔助因子作用下可以轉(zhuǎn)運(yùn)折疊蛋白，Santini和Thomas分別證明綠色熒光蛋白可以在折疊狀態(tài)下通過Tat途徑在大腸桿菌中轉(zhuǎn)移至胞外。對(duì)枯草芽孢Tat途徑的研究較少，主要集中在與大腸桿菌的Tat途徑的對(duì)比上，只有很少的蛋白質(zhì)可以通過Tat途徑分泌，目前僅磷酸二酯酶(PhoD)和未知功能蛋白質(zhì)YwbN是枯草芽孢桿菌Tat途徑分泌至胞外的蛋白質(zhì)[30]。

3 枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的研究方向

近年來，枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)不斷地發(fā)展，在外源基因克隆表達(dá)領(lǐng)域和工業(yè)生產(chǎn)上都得到了廣泛應(yīng)用，很多外源基因經(jīng)枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)得到高效表達(dá)[31]，但同時(shí)枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)仍存在以下問題，影響了其進(jìn)一步的應(yīng)用發(fā)展。

(1)分子克隆效率低?？莶菅挎邨U菌中很少有可以自發(fā)形成感受態(tài)的菌株，而且形成感受態(tài)持續(xù)的時(shí)間也很短，現(xiàn)有的質(zhì)粒載體不穩(wěn)定，經(jīng)常會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)或者分離方面的問題，使質(zhì)粒結(jié)構(gòu)改變甚至丟失。

(2)蛋白酶降解?？莶輻U菌中存在大量表達(dá)和分泌蛋白酶，比如堿性蛋白酶、中性蛋白酶、金屬蛋白酶等。這些蛋白酶沒有底物專一性，外源蛋白分泌到胞外后，會(huì)被這些蛋白酶降解，從而降低產(chǎn)率?，F(xiàn)在通過研究已經(jīng)構(gòu)建了許多蛋白酶失活的突變菌株，如WB600和WB700，可以在一定程度上解決蛋白酶降解的問題，提高產(chǎn)率。

(3)枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中有大量的信號(hào)肽(如Sec途徑有148個(gè)，Tat途徑有27個(gè))，這些信號(hào)肽對(duì)不同的蛋白有不同的引導(dǎo)分泌效率，目前研究中一般通過高通量篩選的方法來確定目的蛋白的適配信號(hào)肽，無法進(jìn)行有效預(yù)測(cè)。

(4)真核蛋白表達(dá)量低[32]。因此在今后的研究中，一方面需要優(yōu)化胞內(nèi)蛋白酶質(zhì)量控制體系，提高目的蛋白產(chǎn)率，另一方面要加強(qiáng)信號(hào)肽分泌機(jī)制研究，并構(gòu)建目的蛋白的信號(hào)肽篩選系統(tǒng)，提高表達(dá)效率。