肖雪 ，楊思宇 ，翟璐 ，夏洪偉 ，高玉龍 ，吳金 ，張中洋 ，朱戰(zhàn)波 ，崔玉東

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶163319；2.和元生物工程股份有限公司）

奶牛乳房炎是目前影響奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要疾病之一，不僅引起奶牛產(chǎn)奶量和奶品質(zhì)降低，還導(dǎo)致奶牛產(chǎn)后發(fā)情周期延長(zhǎng)，甚至失去繁殖性能，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。據(jù)報(bào)道，引起奶牛乳房炎的病原微生物多達(dá)150 種[2]，但以金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌感染最為常見，這三類細(xì)菌引起的奶牛乳房炎可占90%以上[3]，而在這三類病原菌中，腸桿菌科細(xì)菌引起的奶牛乳房炎占比高達(dá)33.6%。在臨床分離的腸桿菌中，埃希氏大腸桿菌（E.coli）占76.1%，且引起的乳房炎難以治療[4]。以往奶牛乳房炎的治療以抗生素為主，且隨著抗生素的長(zhǎng)期和超量使用，臨床上出現(xiàn)大量耐藥菌株，致使抗生素治療效果不佳[5]。因此，研究使用疫苗免疫預(yù)防奶牛乳房炎受到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注[6]。目前，研究報(bào)道較多的是使用 E.coli（O111：B4）J5 株全菌苗免疫接種奶牛，該疫苗株是不完全O-側(cè)鏈多糖突變菌株，其脂多糖的核心區(qū)和脂質(zhì)A 區(qū)是暴露的，暴露區(qū)抗原刺激產(chǎn)生的抗體可以與革蘭氏陰性腸桿菌核心抗原結(jié)合而發(fā)揮抗感染作用，并且能交叉抵抗不同血清型的E.coli 感染[7-8]。但E.coli（O111：B4）J5 疫苗的使用并不能阻止乳房?jī)?nèi)感染，只能減少臨床奶牛乳房炎新病例的發(fā)生[8]。

近年來(lái)，隨著亞單位疫苗的廣泛研究和臨床應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外紛紛開展了E.coli 抗原亞單位疫苗研究。佟春玉等[9]將原核表達(dá)純化的重組OmpT 蛋白（rOmpT）免疫小鼠，結(jié)果免疫小鼠對(duì)4 個(gè)進(jìn)化種系（Phylogenetic group）不同的E.coli 攻毒的免疫保護(hù)率均為50%～60%，證明rOmpT 對(duì)各進(jìn)化種系E.coli 均具有良好的免疫預(yù)防作用。俱雄等[10]將表達(dá)純化的OmpC蛋白免疫小鼠，并用大腸桿菌進(jìn)行攻毒，免疫保護(hù)率達(dá)到63.64%。呼銳等[11]原核表達(dá)了E.coli 的OmpA，通過小鼠模型實(shí)驗(yàn)證明rOmpA 能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的IgG 抗體和淋巴細(xì)胞因子，分別用E.coli C8391 株、E.coli O157 株、E.coli J96、E.coli 2002-1 株以及福氏志賀氏菌、克雷伯氏菌對(duì)rOmpA 免疫小鼠攻毒，在對(duì)照組全部死亡時(shí)，各攻毒組免疫保護(hù)率分別為60%、60%、60%、40%、50%、30%，表明 rOmpA 不僅對(duì)E.coli 攻擊具有良好免疫保護(hù)作用，且對(duì)志賀氏菌、克雷伯氏菌攻擊也具有一定的交叉免疫保護(hù)作用。RAINARD 等[12]研究顯示，用rOmpA 免疫能誘導(dǎo)奶?？贵w滴度增加，表明rOmpA 是誘導(dǎo)奶牛產(chǎn)生抗體的良好免疫原。由以上研究結(jié)果看出，rOmpA 不僅可用于預(yù)防E.coli 感染、也可用于預(yù)防腸桿菌科其他細(xì)菌感染，是具有良好開發(fā)應(yīng)用潛力、預(yù)防腸桿菌感染的候選疫苗抗原。但誘導(dǎo)表達(dá)后的rOmpA 主要以不可溶的包涵體形式存在，且rOmpA 包涵體復(fù)性方法研究鮮有報(bào)道，為其應(yīng)用帶來(lái)一定困難。為此，實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)rOmpA 包涵體蛋白進(jìn)行了復(fù)性研究，篩選出兩種較優(yōu)復(fù)性方法，即使用β-環(huán)糊精、吐溫-20 對(duì)包涵體形式的rOmpA 進(jìn)行復(fù)性，然后純化，獲得了可溶性rOmpA。但不同方法復(fù)性后純化的rOmpA 免疫原性如何及復(fù)性后純化的rOmpA 與包涵體形式的rOmpA 在免疫原性上是否存在差異尚缺乏實(shí)驗(yàn)研究。為此，實(shí)驗(yàn)分別以β-環(huán)糊精復(fù)性rOmpA（βrOmpA）、吐溫-20 復(fù)性 rOmpA（T-rOmpA）和包涵體rOmpA（I-rOmpA）作為抗原，比較研究了它們的免疫原性和免疫保護(hù)作用，為rOmpA 的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供前期工作基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

重組菌株OmpA-pET32a/ BL21（DE3）由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存，分離于奶牛乳房炎病牛乳汁的E.coli 2002-1 菌株由實(shí)驗(yàn)室保存。

6～8 周齡 SPF 級(jí)雌性BALB/c 小鼠購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 主要試劑儀器

主要試劑：PageRulerTM Prestained Protein Ladder 購(gòu)自Thermo Scientific 公司；瓊脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物購(gòu)自O(shè)XOID 公司；弗氏佐劑、牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)自Sigma-Aldrich Inc.公司；山羊抗小鼠IgG/辣椒根酶標(biāo)記購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；Tris-HCl、Tris、NaCl、尿素、EDTA、TritonX-100 購(gòu)自納川生物技術(shù)有限公司；His-binding-resin 蛋白純化柱購(gòu)自上海點(diǎn)創(chuàng)生物科技有限公司；RPMI1640 購(gòu)自美國(guó) Hyclone 公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)CS）購(gòu)自 ExCell Bio 公司；干擾素-γ（INF-γ）、白介素-17A（IL-17A）、白介素-4（IL-4）、等細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒、紅細(xì)胞裂解液及200 目尼龍網(wǎng)購(gòu)自深圳達(dá)科為生物工程有限公司。

主要儀器：電泳儀DYY-8B 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，TECAN Infinite M200PRO 多功能酶標(biāo)儀，Gel Doc 2000 紫外凝膠成像儀系統(tǒng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 rOmpA 免疫原制備

1.3.1.1 重組菌株 OmpA-pET32a/ BL21（DE3）的誘導(dǎo)表達(dá)

將實(shí)驗(yàn)室保存的重組菌株OmpA-pET32a/BL21（DE3）劃線接種于LB-Amp+固體培養(yǎng)板中，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h 后，挑取單菌落接種3 mLLB-Amp+液體培養(yǎng)基中 37 ℃，180 rpm 培養(yǎng) 12 h，再以 1∶100 的比例轉(zhuǎn)接于LB-Amp+液體培養(yǎng)基中，以180 rpm 于37 ℃條件下培養(yǎng)至菌液OD600值達(dá)到0.6～0.8 之間時(shí)，加入終濃度為0.1 mmol·L-1的IPTG 繼續(xù)培養(yǎng)4 h，同時(shí)設(shè)置空載體菌株pET32a/BL21（DE3）作為對(duì)照。培養(yǎng)結(jié)束后，分別吸取1 mL 菌液，8 000 rpm 離心10 min，棄盡上清，加入無(wú)菌 dd 水 40 μL 重懸菌體沉淀，再加入5×上樣緩沖液（含巰基乙醇）10 μL 震蕩混勻，密封樣品于沸水中煮沸10 min，待處理樣品冷卻至室溫后取5 μL 樣品進(jìn)行12%SDS-PAGE 電泳鑒定。

1.3.1.2 表達(dá)的rOmpA 復(fù)性及純化

將活化的OmpA-pET32a/BL21（DE3）重組菌以1∶100 的比例接種于 LB-Amp+液體培養(yǎng)基中，在 37 ℃條件下以180 rpm 震蕩培養(yǎng)至菌液OD600值達(dá)到0.6～0.8 之間，加入終濃度為 0.1 mmol·L-1的 IPTG 繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，然后4 ℃ 8 000 rpm 離心10 min 收集菌體，用緩沖液（50 mmol·L-1Tris-HCl pH8.0，100 mmol·L-1NaCl）洗滌菌體兩次，然后以溶液（50 mmol·L-1Tris-HCl pH8.0，100 mmol·L-1NaCl，1%Triton X-100）重懸菌體（菌液與溶液比例約為200 mL∶20 mL），冰浴超聲破碎菌體（功率：150 W，破碎/間隔時(shí)間為：5 s/5 s）10 min 后，離心收集沉淀，分別用洗滌液Ⅰ（50 mmo·lL-1Tris-HCl pH8.0，100 mmol·L-1NaCl，0.5% Triton X-100，2 mol·L-1尿素）、洗滌液Ⅱ（100 mmol·L-1Tris-HCl pH8.0，300 mmol·L-1NaCl，3%Triton X-100）各洗滌一次，每次2～8 ℃冷藏柜搖床上振搖30 min，收集含有大量rOmpA 的離心沉淀物。以含8 mol·L-1尿素的溶液溶解包涵體蛋白，并分別用含β-環(huán)糊精和吐溫-20 復(fù)性溶液做復(fù)性處理，然后用His-bindingresin 柱純化復(fù)性蛋白，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，調(diào)節(jié)蛋白濃度至1 mg·mL-1備用。

包涵體rOmpA 純化即以含8 mol·L-1尿素的溶液溶解包涵體蛋白后，用His-binding-resin 柱純化蛋白，純化后蛋白溶液用PBS 溶液透析24 h，濃縮透析溶液，留取包涵體固體沉淀，PBS 溶液吹懸包涵體固體使其均勻分布在PBS 溶液中。分別取上述復(fù)性純化和包涵體rOmpA 懸液，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，檢測(cè)蛋白純度和確定含量。

1.3.1.3 rOmpA 蛋白亞單位疫苗的制備

分別取β-環(huán)糊精復(fù)性rOmpA、吐溫-20 復(fù)性rOmpA 和包涵體 rOmpA，用無(wú)菌 PBS 稀釋至 1 mg·mL-1，用弗氏佐劑以1∶1 比例與蛋白溶液充分混合，用齒科銀汞調(diào)和器（Amalgamator）30 s·次-1，乳化數(shù)次，直至乳化蛋白滴至水中不迅速散開為止，將乳化完蛋白吸入無(wú)菌注射器中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及免疫接種

取6～8 周齡SPF 級(jí)雌性BALB/c 小鼠隨機(jī)分成4 組，每組 20 只，分別標(biāo)記為 PBS 組、β-環(huán)糊精復(fù)性rOmpA 免疫組（β-rOmpA）、吐溫-20 復(fù)性 rOmpA 免疫組（T-rOmpA）、包涵體 rOmpA 免疫組（I-rOmpA）。飼養(yǎng)一周后，每只小鼠以50 μg 抗原劑量與等量弗氏完全佐劑乳化后于腿部肌肉免疫接種。初次免疫接種后21 d，每只小鼠以同樣抗原劑量與等量弗氏不完全佐劑乳化后進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

1.3.3 間接ELISA 測(cè)定抗體水平

在加強(qiáng)免疫接種后第14 d，每組隨機(jī)取出4 只小鼠進(jìn)行眼球采血，收集血清。E.coli 2002-1 全菌80 ℃水浴熱滅活30 min 備用，酶標(biāo)板中每孔分別包被包涵體rOmpA 純化得到的可溶性rOmpA 蛋白0.2 μg，熱滅活的 E.coli 2002-1 全菌 1×106CFU，4 ℃包被過夜，次日棄去包被液，每孔加入200 μL PBST重復(fù)洗滌3 次；然后每孔加入5%脫脂100 μL，于37 ℃孵育1 h，棄去孔內(nèi)液體，PBST 洗滌3 次后，每孔加入 1∶1 600 倍稀釋的小鼠血清 100 μL，37 ℃孵育 1 h，再 PBST 洗滌 3 次后，每孔加入 100 μL 以 1∶5 000 倍稀釋的 Goat anti-mouse HRP-IgG 二抗，37 ℃孵育1 h，PBST 洗滌 3 次后，每孔加入 100 μL TMB 顯色液，避光放置15 min 后，每孔加入50 μL 的終止液（2 mol·L-1硫酸）終止反應(yīng)，在終止反應(yīng) 10 min 內(nèi)，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm 處各孔吸光度值。

1.3.4 脾淋巴細(xì)胞分離與細(xì)胞因子檢測(cè)

在加強(qiáng)免疫接種后7 d，每組隨機(jī)取4 只小鼠，無(wú)菌取出小鼠脾臟，在含有3 mL 的RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液的35 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿上覆蓋一張200 目尼龍網(wǎng)，將脾臟放置于尼龍網(wǎng)上，使用無(wú)菌注射器的活塞輕輕碾壓小鼠脾臟使細(xì)胞穿過尼龍網(wǎng)懸于RPMI-1640 培養(yǎng)液中，制備細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中，1 000 rpm 室溫離心 5 min 后，棄去上層清液；加入1 mL 紅細(xì)胞裂解液使紅細(xì)胞裂解，37 ℃處理 2 min 后加入 9 mL 的 RPMI-1640 培養(yǎng)液終止反應(yīng)；1 000 rpm 室溫離心3 min，棄去上清；使用RPMI-1640 培養(yǎng)液清洗細(xì)胞3 次，末次清洗結(jié)束后，1 000 rpm 室溫離心3 min 后，棄去上清，加入適量完全RPMI-1640 培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，100 U青霉素·mL-1，100 U 鏈霉素·mL-1）重懸細(xì)胞，并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×106cells·mL-1，將稀釋好細(xì)胞鋪于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（1 mL·孔-1），每孔分別加入包涵體rOmpA 純化得到的可溶性rOmpA 蛋白30 μg，熱滅活的E.coli 2002-1 全菌體1×107CFU，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中（37 ℃、5% CO2）培養(yǎng) 72 h；將淋巴細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至2 mL EP 管中，2 200 rpm 離心20 min，收集上清，按照達(dá)科為產(chǎn)品Mouse IFN-γ、IL-4 和IL-17A Precoated ELISA Kit 操作方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.5 免疫接種小鼠攻毒

將菌株E.coli 2002-1 劃線接種于LB 固體培養(yǎng)板中，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h 后，挑取單菌落接種于3 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 rpm 震蕩培養(yǎng) 12 h，再以1∶100 的比例轉(zhuǎn)接于200 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 rpm 震蕩培養(yǎng) 5 h 后，8 000 rpm 離心10 min 收集菌體，以適量無(wú)菌PBS 重復(fù)洗滌菌體3 次，倍比稀釋后涂板計(jì)數(shù)；在加強(qiáng)免疫接種后14 d，每組取3 只分別以3.6×108CFU·只-1劑量進(jìn)行腹腔攻毒，攻毒后48 h 處死小鼠，分別取肝、脾、肺、腎4個(gè)器官研磨于 2 mL PBS 中，混勻后按 1∶10、1∶100 比例稀釋，將研磨器官原液及各梯度稀釋液分別取20 μL涂布于LB 固體培養(yǎng)板中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。通過平板菌落數(shù)量計(jì)算肝、脾、肺、腎細(xì)菌定植數(shù)；每組取10 只分別以5×108CFU·只-1劑量進(jìn)行腹腔攻毒，攻毒后7 d 內(nèi)，每天觀察并記錄小鼠的生存情況。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有的數(shù)據(jù)進(jìn)行生物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用SPSS 軟件進(jìn)單因素方差分析，組間差異采用t 檢驗(yàn)，其中*表示P＜0.05，** 表示 P＜0.01，***P＜0.001，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組蛋白OmpA 的表達(dá)與純化

重組菌株 OmpA-pET32a/BL21（DE3）經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)4 h 后進(jìn)行SDS-PAGE 分析。結(jié)果，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)菌在56 KD 處可見明顯條帶，其分子量大小與預(yù)期相符。經(jīng)β-環(huán)糊精復(fù)性純化蛋白、吐溫-20 復(fù)性純化蛋白和表達(dá)后直接純化的包涵體蛋白進(jìn)行SDSPAGE 分析，結(jié)果在分子量56 KD 處呈現(xiàn)單一條帶。SDS-PAGE 圖中可知，經(jīng)β-環(huán)糊精復(fù)性純化蛋白及直接純化的包涵體蛋白純度較高，SDS-PAGE 圖中無(wú)雜蛋白條帶，而經(jīng)吐溫-20 復(fù)性純化蛋白SDSPage 中可見一條清晰雜帶。純度結(jié)果詳見圖1。

圖1 SDS-PAGE 鑒定蛋白表達(dá)及純化結(jié)果Fig.1 Expression and purification of recombinant OmpA.Lane M.PageRulerTM Prestained Protein Ladder

2.2 免疫小鼠血清特異性抗體檢測(cè)結(jié)果

采用間接ELISA 方法測(cè)定各組在加強(qiáng)免疫后14 d小鼠血清中的抗體水平。結(jié)果顯示，rOmpA 和E.coli 2002-1 全菌作抗原進(jìn)行檢測(cè)，β-rOmpA、T-rOmpA 和I-rOmpA 免疫組均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，三組抗體水平極顯著高于PBS 對(duì)照組（P＜0.001），且β-rOmpA 免疫組抗體水平顯著高于T-rOmpA 免疫組（P＜0.05）、極顯著高于 I-rOmpA 免疫組（P＜0.001）。結(jié)果詳見圖 2。

圖2 免疫小鼠血清中的特異性抗體水平Fig.2 Levels of specific antibody in the immunized mice sera

2.3 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果

取各組免疫接種小鼠脾臟脾淋巴細(xì)胞，體外經(jīng)rOmpA 和E.coli 2002-1 全菌體刺激后用間接ELISA方法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞分泌的特異性細(xì)胞因子IFN-γ、IL-17A 和IL-4。結(jié)果，各抗原免疫組小鼠脾細(xì)胞均能產(chǎn)生較高水平的IFN-γ，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），但產(chǎn)生 IL-4 水平均較低；rOmpA 刺激試驗(yàn)中 β-rOmpA 免疫組產(chǎn)生 IFN-γ、IL-17A 水平顯著高于 T-rOmpA 免疫組（P＜0.05），極顯著高于 I-rOmpA免疫組（P＜0.01）。結(jié)果詳見圖 3A；E.coli 2002-1 全菌體刺激試驗(yàn)中I-rOmpA 免疫組產(chǎn)生IFN-γ 水平顯著高于 β-rOmpA 和 T-rOmpA 免疫組，β-rOmpA和T-rOmpA 免疫組產(chǎn)生IFN-γ 水平無(wú)顯著差異（P＞0.05），三組產(chǎn)生 IL-17A 水平無(wú)顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果詳見圖3B。

圖3 刺激后淋巴細(xì)胞上清中細(xì)胞因子水平Fig.3 Cytokine level in supernatant of lymphocyte culture after stimulating

2.4 免疫接種小鼠對(duì)E.coli 2002-1 菌株攻擊的免疫保護(hù)作用

為比較各種抗原免疫接種后誘導(dǎo)的免疫保護(hù)作用，用E.coli 2002-1 菌株分別以3.6×108CFU·只-1和5.0 ×108CFU·只-1劑量對(duì)各組小鼠進(jìn)行腹腔攻毒，然后測(cè)定小鼠肝、脾、肺、腎細(xì)菌定植數(shù)和小鼠免疫保護(hù)率。結(jié)果顯示，以3.6 ×108CFU·只-1劑量攻毒后，小鼠肝、脾、肺和腎均有細(xì)菌定植，各抗原免疫組器官細(xì)菌定植數(shù)目均低于PBS 對(duì)照組，其中β-rOmpA免疫組肝、脾、肺、腎細(xì)菌定植量極顯著低于T-rOmpA 免疫組和 I-rOmpA 免疫組（P＜0.001），結(jié)果詳見圖4A。

對(duì)各免疫組小鼠以5.0 ×108CFU·只-1劑量攻毒后，觀察記錄小鼠死亡情況。結(jié)果，在攻毒后2 d，PBS對(duì)照組小鼠全部死亡，而此時(shí)β-rOmpA 免疫組小鼠存活率為60%，T-rOmpA 免疫組小鼠存活率為40%，I-rOmpA 免疫組小鼠存活率率為30%；而攻毒后3 d至 7 d，β-rOmpA 免疫組小鼠存活率為 40%，T-rOmpA 免疫組小鼠存活率為0，而I-rOmpA 免疫組小鼠存活率仍為30%。免疫保護(hù)作用結(jié)果表明，β-環(huán)糊精復(fù)性純化的蛋白免疫原性優(yōu)于吐溫-20 復(fù)性純化的蛋白和直接純化的包涵體蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)作用最強(qiáng)。結(jié)果詳見圖4B。

圖4 免疫小鼠對(duì)E.coli 2002-1 菌株攻擊的免疫保護(hù)作用結(jié)果Fig.4 Immunoprotection of the immunized-mice against challenge with E.coli 2002-1 strain.

3 討論

基因重組蛋白特別是重組膜蛋白在原核細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)，往往形成高密度、無(wú)活性、不可溶的包涵體形式蛋白。這種表達(dá)方式的優(yōu)點(diǎn)[13]是表達(dá)量高，方便后續(xù)對(duì)其進(jìn)行分離純化；缺點(diǎn)是包涵體形式蛋白必須先變性再?gòu)?fù)性，才能恢復(fù)其生物活性。1961 年，Anfinsen[14]發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)含有其折疊成熟所需的全部信息，無(wú)活性的包涵體形式蛋白質(zhì)在一定的條件下可以完全自發(fā)地恢復(fù)活性。后來(lái)實(shí)驗(yàn)研究表明[15-16]，伸展的肽鏈折疊成活性蛋白質(zhì)并不是一步完成的，它先經(jīng)過折疊進(jìn)入中間態(tài)，然后由中間態(tài)過渡到最終具有特定三維結(jié)構(gòu)和生物活性的自然狀態(tài)。從中間態(tài)到天然構(gòu)象折疊是復(fù)性的限速步驟。由于蛋白在折疊過程中會(huì)產(chǎn)生一些錯(cuò)誤折疊的中間體，而且缺乏協(xié)助折疊的輔助蛋白，同時(shí)受到聚集反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)，體外折疊形成蛋白質(zhì)天然構(gòu)象所需時(shí)間很長(zhǎng)，從十幾小時(shí)到幾十小時(shí)不等。并非所有蛋白質(zhì)在一定的條件下均可自發(fā)恢復(fù)具有完全活性的天然構(gòu)象，包涵體復(fù)性成有活性的蛋白的過程非常復(fù)雜，且不同蛋白需要不同的復(fù)性方法。田亮等[17]研究牦牛源多殺性巴氏桿菌重組外膜蛋白H（rOmpH）亞單位疫苗對(duì)免疫接種小鼠誘導(dǎo)的免疫保護(hù)效果，結(jié)果rOmpH 包涵體蛋白經(jīng)體外變性、復(fù)性及純化后，不能產(chǎn)生良好的免疫原性?？梢?，即便是包涵體形式重組蛋白得到了復(fù)性，其免疫原性也受到了很大的影響，對(duì)復(fù)性的抗原蛋白的免疫原性仍需要實(shí)驗(yàn)證明。因此，實(shí)驗(yàn)前期對(duì)表達(dá)的主要以包涵體形式存在的rOmpA 以不同方法復(fù)性純化后，進(jìn)一步研究了它們的免疫原性，為后續(xù)將rOmpA 作為免疫原開發(fā)應(yīng)用做前期準(zhǔn)備。

研究分別將β-環(huán)糊精和吐溫-20 復(fù)性純化后的rOmpA 和包涵體形式的rOmpA 制備免疫原后免疫接種小鼠，然后檢測(cè)和比較各組的血清抗體水平、脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子水平以及細(xì)菌攻擊后的肝、脾、肺、腎細(xì)菌定殖量、免疫小鼠存活數(shù)。結(jié)果顯示，β-rOmpA 誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)作用明顯好于T-rOmpA 和 I-rOmpA，且 β-rOmpA 免疫組小鼠所獲得免疫保護(hù)率也最好，與乎銳等[11]研究的可溶性rOmpA 的免疫保護(hù)率結(jié)果一致。表明，利用β-環(huán)糊精復(fù)性后純化的rOmpA 具有良好的免疫原性，可用于后續(xù)疫苗開發(fā)。

在檢測(cè)血清抗體水平時(shí)，考慮到臨床上E.coli 感染的實(shí)際情況，我們嘗試了用滅活的E.coli 全菌體作為抗原對(duì)小鼠血清中抗體進(jìn)行檢測(cè)，所檢測(cè)的血清抗體水平雖然明顯低于rOmpA 作抗原的檢測(cè)水平，但兩種抗原各組之間抗體水平的變化趨勢(shì)一致，說(shuō)明rOmpA 和E.coli 全菌體均可作為抗原對(duì)免疫小鼠血清抗體進(jìn)行檢測(cè)。在體外脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子檢測(cè)時(shí)，我們也嘗試了用滅活的E.coli 全菌體作抗原進(jìn)行刺激，各組均產(chǎn)生了比較高水平的IFN-γ 和一定水平的IL-17A，而IL-4 水平非常低。但與rOmpA 作為抗原相比，各組之間IFN-γ 的水平差異比較大，且不具有其他結(jié)果那樣規(guī)律性?？赡苁怯捎谌w抗原成分復(fù)雜，包括各種菌體表面蛋白、LPS、莢膜等成分，而且實(shí)驗(yàn)使用的是脾細(xì)胞，而非單一的淋巴細(xì)胞成分，這些因素可能都會(huì)影響到細(xì)胞因子表達(dá)譜及表達(dá)水平，致使這一結(jié)果不具有特異性[18-20]。各組產(chǎn)生IL-17A、IL-4 水平較低，說(shuō)明在抗感染過程中，發(fā)揮較大作用的是Th1 細(xì)胞，而Th17 細(xì)胞和Th2 細(xì)胞發(fā)揮抗感染作用較弱。對(duì)免疫小鼠以E.coli 2002-1 菌株腹腔攻毒后，測(cè)定小鼠肝、脾、肺、腎細(xì)菌定植數(shù)和小鼠的存活率，β-rOmpA 免疫組小鼠肝、脾、肺、腎細(xì)菌定植量極顯著低于T-rOmpA 和I-rOmpA 免疫組，而小鼠存活率也是β-rOmpA 免疫組最高，說(shuō)明用β-環(huán)糊精方法復(fù)性純化的rOmpA 誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的抗E.coli 感染免疫保護(hù)作用最好。但實(shí)驗(yàn)是以小鼠作為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ烷_展的研究，可能與奶牛體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一定完全一致，特別是對(duì)E.coli 和其它腸桿菌奶牛乳腺感染的免疫預(yù)防作用尚需進(jìn)一步研究。