付健，王玉鳳，張翼飛，楊麗娟，楊克軍

（黑龍江八一農墾大學農學院/黑龍江省教育廳寒地作物種質改良與栽培重點實驗室，大慶 163319）

玉米是我國重要的糧食作物之一，約占我國糧食總產量的40%，在保障國家糧食安全戰(zhàn)略中具有重要地位，且玉米在我國未來糧食增產進程中將占主導地位。黑龍江春玉米區(qū)是我國玉米的主要產區(qū)，也是我國重要的商品糧基地，因此保障黑龍江地區(qū)春玉米產量的穩(wěn)定對國家農業(yè)經濟發(fā)展至關重要，同時黑龍江也是蘇打鹽堿地集中分布區(qū)之一，鹽堿地面積2.882×106hm2，嚴重制約該地區(qū)糧食產量。

作物的光合作用在生長發(fā)育過程中具有非常重要的作用，作物通過光合作用可以產生大量的有機物，其中大約90%的有機物最終轉化為作物籽粒產量。已有相關研究表明，作物的光合作用對鹽堿脅迫的響應非常敏感，鹽堿脅迫下，作物的光合速率顯著下降，對作物產生明顯的光合抑制作用，最終會導致作物產量嚴重降低，甚至導致作物死亡[1]。其中鹽堿脅迫下，作物光合作用中光系統(tǒng)II（PSII）對脅迫表現(xiàn)最為敏感，主要由于鹽堿脅迫導致水勢下降從而引起滲透脅迫，最終導致光合電子傳遞鏈中過度還原，進而產生光氧化損傷[2]。在遭遇鹽堿脅迫時，作物體內會受到非常大的影響，導致體內聚集大量的活性氧（ROS），而大量的活性氧聚集會引起作物體內細胞膜質過氧化，同時引發(fā)作物體內抗氧化酶發(fā)生改變來應對ROS 損傷[3]，隨著鹽堿脅迫導致的過氧化反應逐漸增強，作物體內的抗氧化酶和非酶防御系統(tǒng)會產生明顯的響應機制，從而促使作物能夠有效的抵御鹽堿脅迫導致的氧化損傷[4-6]。鹽堿脅迫下，玉米植株會產生過量的ROS，從而改變了玉米植物體內活性氧自由基清除酶活性，導致細胞膜質過氧化，最終導致植株體內丙二醛（MDA）含量大量積累[7]。作物在生長過程中會受到很多環(huán)境脅迫的損害，因此，在長期應對由于環(huán)境脅迫導致的ROS 積累造成的損傷時，作物體內形成了比較完整的應對脅迫損害的防御機制，這套防御機制主要起到協(xié)調作物體內過量ROS 的清除作用，它對維持作物體內的氧化還原平衡具有非常重要的作用，而作物在利用防御機制低于損傷的同時，作物體內自身也會產生一定量的滲透調節(jié)物質，使作物體內細胞的滲透壓維持正常水平，使細胞能夠正常進行吸水生長，從而保證作物在環(huán)境脅迫下能夠健康生長[8]。

木霉菌（Trichoderma）是一類重要的生防因子和促進植物生長菌。目前，木霉菌在全世界農業(yè)生產中被廣泛的應用，且表現(xiàn)出良好的抗逆和促進生長的效果。相關研究結果發(fā)現(xiàn)，木霉菌能夠有效的在植物根部進行定殖生長，并通過自身的生防機制對植物進行生長調節(jié)，從而提高植物應對非生物脅迫時的耐受能力，木霉菌對緩解植物應對鹽堿、干旱等環(huán)境脅迫方面發(fā)揮了重要作用[9-10]。木霉菌對植物的促生長作用包括提高種子萌發(fā)、提高葉片和根系生物量、增強對養(yǎng)分吸收等[11-13]。前人在棉花上施用木霉菌后發(fā)現(xiàn)，木霉菌對棉花葉片的葉綠素含量具有非常明顯的促進作用，從而促進了棉花葉片的光合作用[14]，同時使植物的干物質積累顯著提高[15-16]，這說明光合作用對植物的物質積累和生長發(fā)育具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌處理下，植株體內的抗氧化防御系統(tǒng)相關參數均在木霉菌促進下顯著提高，緩解了ROS 損傷，使MDA 積累量顯著減少，使植株應對環(huán)境脅迫的能力顯著提高[17]。有研究也表明，植物在施用木霉菌后，其體內的鈣、鉀等離子濃度顯著增加，而鈉離子濃度則顯著減少，從而提高了植物應對鹽堿脅迫的抗逆性[18]。木霉菌還通過參與一些光合作用相關的基因表達，來提高植株應對環(huán)境脅迫的能力，從而使植株光合能力增強[19]。目前，關于木霉菌與植物抗鹽堿性的研究多數針對于蔬菜及林木類，在糧食作物上應用較少，且都是人工模擬的鹽堿環(huán)境，但是寒地天然鹽堿土的情況比較復雜，人工無法模擬，因此有關寒地天然鹽堿土脅迫條件下，不同種屬木霉菌對不同基因型玉米幼苗光合作用特性及活性氧代謝的影響尚未見報道。

研究分析鹽堿土壤脅迫下，施用哈茨木霉（Trichoderma harzianum）和長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）對提高玉米耐鹽堿性的作用效果，主要通過研究鹽堿土壤脅迫下施用不同木霉菌對玉米幼苗的光合熒光特性、光合色素及活性氧代謝的影響，以闡明在逆境脅迫下不同種屬木霉菌增強玉米光合作用的機理和調節(jié)植物鹽堿應激反應有關的滲透壓保護機制、ROS 的清除的改善，為木霉菌在黑龍江寒地鹽堿土壤中的應用和推廣提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

試驗于黑龍江八一農墾大學農學院省級重點實驗室進行。供試品種為試驗篩選的玉米雜交種：鹽堿敏感型品種真金8 號（ZJ8）和耐鹽堿品種江育417（JY417），人工進行種子一致性挑選，然后對挑選好的種子進行消毒處理，并放置于恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃黑暗催芽，在催芽結束后，選取長勢一致的種子種植于寬和高分別為15 cm 和10 cm 的盆中，盆栽所用鹽堿土取自黑龍江省大慶市，鹽堿土壤pH 為9.30，盆栽土壤在室內陰涼干燥通風處自然陰干，過2 mm篩網，每盆放土700 g。供試木霉菌分別為哈茨木霉（Trichoderma harzianum） 和長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum），以分別施用濃度為 1×109spores·L-1哈茨木霉（TH）、長枝木霉（TL）為試驗處理，以不施用木霉菌為對照處理（Con），完全隨機設計，5 次重復。其中不同木霉菌液處理按照每升土施用200 mL 木霉菌孢子懸浮液在栽苗后立即澆入，對照處理澆入等量無菌液水，玉米在植物生長室內生長到三葉一心時期進行樣品采集。植物生長室培養(yǎng)條件為：晝夜溫度為（25±2）℃（/20±2）℃，每天光照12 h，光強為1 000 μmol·m-·2s-1，濕度為 60%～80%[20]。盆栽土壤基礎理化性質見表1。

表1 盆栽土壤理化性質Table 1 Physicochemical properties of the experimental soil

1.2 玉米幼苗樣品采集及預處理

施用木霉菌后27 d，在不同處理下選取3 株玉米幼苗葉片進行光合作用參數和葉綠素熒光參數的測定，測定完成后將各處理的3 株玉米幼苗第二片展開葉進行采集用于測定葉片葉綠素含量，最后采集用于測定酶活性指標的葉片，用錫紙包好之后迅速放入液氮中冷凍，并保存于-80 ℃冰箱中。

1.3 指標測定

1.3.1 光合特性測定

采用 Li-6400 光合儀（Li-COR Inc，USA）對玉米幼苗的第二片展開葉進行光合作用參數測定，測定時間為每天9:00～11:00 am 進行測量，光合測量的葉室條件設置為1 000 mmol·m-2·s-1光強，380±10 μmol·mol-1，溫度為25±2 ℃，70%相對濕度。光合速率photosynthetic rate（Pn）、氣孔導度 Stomatal conductance（Cond）、胞間 CO2濃度 Intercelular CO2concentration（Ci）、蒸騰速率 Transpiration rate（Tr）由光合儀直接導出，每個處理玉米幼苗葉片測量3 次[20]。

1.3.2 葉綠素及葉綠素熒光測定

采用OS-30p 葉綠素脈沖制熒光分析儀（美國Opti-Sciences 公司）對玉米幼苗的第二片展開葉進行葉綠素熒光特性測定。暗適應30 min 后讀取初始熒光Fo，待Fo穩(wěn)定后再照射飽和脈沖光，可得最大熒光Fm，光系統(tǒng)II（PSII）最大光化學量子效率［（Fv/Fm）=（Fm-Fo）］[20]。

采用丙酮浸提比色法對玉米幼苗第二片展開葉進行測定，首先，稱取新鮮葉片0.1 g，加入50 mL 提取液（80%丙酮和無水乙醇等體積混合），將提取液放置于避光處靜止，待葉片完全褪色后，對提取液進行測定，測定其在470、646 nm 和 663 nm 下的OD值，并根據相關公式對玉米幼苗葉片的葉綠素含量進行計算[21]。

1.3.3 抗氧化酶活性測定

玉米葉片 MDA 含量，O2-產生速率，H2O2含量，可溶性蛋白含量，SOD、APX、GPX、GR、POD、CAT 活性測定參照文獻［22］，以上指標均測定同一處理下3株玉米植株葉片，即每個處理測定3 次重復，其中抗氧化酶活性以每毫克蛋白質所具有的酶活力單位數表示U·mg-1，測定時間為施用木霉菌后27 d。

1.4 數據分析

所有試驗數據均采用SPSS 21.0 進行統(tǒng)計分析，Duncan 多重比較分析不同處理的影響差異，利用Microsoft Excel 2003 繪制表格。

2 結果與分析

2.1 鹽堿脅迫下哈茨木霉和長枝木霉對玉米幼苗葉片光合作用參數的影響

鹽堿脅迫（Con）顯著降低了ZJ8 和JY417 兩種玉米幼苗的光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、氣孔導度（Cond），同時使兩品種玉米幼苗葉片胞間CO2濃度（Ci）顯著升高，表明鹽堿脅迫對ZJ8 和JY417 葉片的光合作用的限制效應可能以非氣孔因素為主（表2）。施用不同木霉菌處理后，顯著提高了ZJ8 和JY417的光合特性，其中，與鹽堿脅迫（Con）處理相比，長枝木霉處理（TL）下ZJ8 和JY417 玉米幼苗葉片光合速率、蒸騰速率、氣孔導度分別提高了74.11%、34.04%、42.70%和 53.47%、30.26%、30.35%，胞間 CO2濃度下降了43.69%和59.51%；哈茨木霉處理（TH）下分別提高了70.35%、30.54%、34.60%和47.86%、27.64%、24.34%，胞間CO2濃度下降了41.15%和56.91%。結果表明，不同木霉菌處理下，顯著緩解了寒地鹽堿土壤對玉米幼苗的脅迫效應，長枝木霉菌處理效果較好，且對‘ZJ8’緩解作用大于‘JY417’。

2.2 鹽堿脅迫下哈茨木霉和長枝木霉對玉米幼苗葉片光合色素含量及葉綠素熒光參數的影響

光合色素含量高低對作物光合作用能力強弱具有非常大的影響。由表3（a and b）可知，鹽堿脅迫（Con）顯著降低 ZJ8 和 JY417 葉片 Chl a、Chl b、Chl a+b 和Car 含量。而施用不同木霉菌后，顯著緩解了鹽堿脅迫對 ZJ8 和 JY417 光合色素含量的影響（P＜0.05），長枝木霉其中處理（TL）下ZJ8 和JY417 玉米幼苗葉片Chl a、Chlb、Chl a+b 和 Car 分別提高了 44.92%、82.26%、49.25%、41.84%和30.66%、73.32%、35.78%、39.45%；哈茨木霉處理（TH）下分別提高了38.30%、70.40%、42.02%、33.75%和23.67%、63.96%、29.50%、32.26%。

鹽堿脅迫顯著影響了ZJ8 和JY417 葉片葉綠素熒光參數（表3b），這表明，鹽堿脅迫下對ZJ8 和JY417 葉片光合作用PSⅡ系統(tǒng)產生顯著影響。施用哈茨木霉和長枝木霉后，ZJ8 和 JY417 葉片 Fv/F0、Fv/Fm均顯著提高（P＜0.05），長枝木霉處理（TL）下 ZJ8和 JY417 玉米幼苗葉片 Fv/F0、Fv/Fm分別提高了77.88%、14.68%和58.83%、12.41%；哈茨木霉處理（TH）下分別提高了72.56%、11.55%和54.11%、9.97%，以上結果說明鹽堿脅迫下，不同木霉菌對玉米幼苗葉片光合作用PSII 反應中心的光化學活性具有顯著緩解效果，從而促進玉米葉片的光合作用效率，長枝木霉處理效果較好，且對ZJ8 的效應更為顯著。

表2 不同木霉菌對鹽堿土玉米幼苗葉片光合特性的影響Table 2 Influence of different Trichoderma on the photosynthetic parameters in the leaves of maize seedlings grown on saline-alkaline soil

表3a 不同木霉菌對鹽堿土玉米幼苗葉片光合色素含量及葉綠素熒光參數的影響Table 3a Effect of different Trichoderma on photosynthetic pigments content and chlorophyll fluorescence parameter in maize seedlings leaves on saline-alkaline soil

表3b 不同木霉菌對鹽堿土玉米幼苗葉片光合色素含量及葉綠素熒光參數的影響Table 3b Effect of different Trichoderma on photosynthetic pigments content and chlorophyll fluorescence parameter in maize seedlings leaves on saline-alkaline soil

2.3 鹽堿脅迫下哈茨木霉和長枝木霉對玉米幼苗葉片ROS 積累及膜脂過氧化的影響

鹽堿脅迫（Con）下，ZJ8 和 JY417 葉片的 MDA 和H2O2含量及O2-產生速率均顯著增加（P＜0.05）。施用不同木霉菌后降低了各處理葉片中H2O2和O2-的積累（表4），緩解了鹽堿脅迫誘導的膜質過氧化，從而使MDA 的積累量顯著降低。與鹽堿脅迫處理相比，長枝木霉（TL）處理下ZJ8 和JY417 玉米幼苗葉片H2O2、O2-、MDA 含量降低了 51.85%、46.87%、63.64%和49.29%、43.64%、57.98%；哈茨木霉（TH）處理下降低了 46.52%、39.24%、60.19%和 44.21%、34.80%、53.92%。研究表明土壤中施用不同木霉菌后能提高不同玉米對鹽堿脅迫的抗性，長枝木霉處理效果較好，對ZJ8 緩解較為明顯。

表4 不同木霉菌對鹽堿土玉米幼苗葉片ROS 的積累及脂質過氧化的影響Table 4 Influence of different Trichoderma on the accumulation of ROS and on the oxidation parameters in the leaves of maize seedlings in saline-alkaline soil

2.4 鹽堿脅迫下哈茨木霉和長枝木霉對玉米幼苗葉片滲透調節(jié)物質的影響

滲透調節(jié)物質有助于調節(jié)逆境條件下植株滲透壓，防止細胞脫水。鹽堿脅迫（Con）處理下，ZJ8 和JY417 兩種玉米幼苗葉片中的脯氨酸和可溶性糖含量顯著低于木霉菌處理（P＜0.05）（表5）。施用不同木霉菌后ZJ8 和JY417 兩種玉米幼苗葉片的滲透調節(jié)物質顯著提高，與對照（Con）相比，長枝木霉（TL）處理下ZJ8 和JY417 玉米幼苗葉片脯氨酸和可溶性糖含量提高了17.50%、15.55%和40.10%、35.28%；哈茨木霉（TH） 處理下含量提高了14.75%、12.09%和37.86%、31.79%，且可溶性糖含量對緩解鹽堿脅迫效果好于脯氨酸。

表5 不同木霉菌對鹽堿土玉米幼苗葉片可溶性滲透調節(jié)物的影響Table 5 Influence of different Trichoderma on the content of osmolytes in the leaves of maize seedlings in saline-alkaline soil

2.5 鹽堿脅迫下哈茨木霉和長枝木霉對玉米幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

與木霉菌處理相比，鹽堿脅迫（Con）顯著降低了ZJ8 和 JY417 兩種玉米幼苗葉片的 SOD、APX、GPX、GR 和 POD 活性（P＜0.05），但 CAT 活性變化規(guī)律與其他抗氧化酶活性有所不同，鹽堿脅迫（Con）下，ZJ8和JY417 兩種玉米葉片CAT 酶活性較木霉菌處理顯著提高。不同品種間酶活性的含量也表現(xiàn)出不同差異，JY417 酶活性均高于ZJ8。施用不同木霉菌后，ZJ8和 JY417 玉米葉片的 SOD、POD、APX、GPX、GR 的活性均高于鹽堿脅迫處理，而CAT 活性則相反，長枝木霉（TL）處理下ZJ8 和JY417 玉米幼苗葉片SOD、POD、APX、GPX、GR 酶活性提高了 26.52%、23.49%、79.37%、65.01%、67.89%和24.58%、21.50%、73.73%、52.72%、55.71%，CAT 活性降低了11.46%和10.60%；哈茨木霉（TH） 處理下酶活性提高了 24.51%、21.29%、73.51%、58.89%、59.63%和22.72%、19.77%、70.71%、50.89%、51.43%，CAT 活性降低了 10.21%和8.15%，長枝木霉處理效果較好，且對ZJ8 緩解明顯。

表6a 不同木霉菌對鹽堿土玉米幼苗葉片抗氧化酶活性的影響Table 6a Influence of different Trichoderma on the antioxidant enzyme activities in the leaves of maize seedlings in saline-alkaline soil

表6b 不同木霉菌對鹽堿土玉米葉片抗氧化酶活性的影響Table 6b Influence of different Trichoderma on the antioxidant enzyme activities in the leaves of maize seedlings in saline-alkaline soil

3 討論

作物的光合作用對作物產量具有非常重要的作用，而鹽堿土壤脅迫對作物的光合作用具有非常顯著的抑制作用，從而影響作物的正常生長發(fā)育[23]。研究發(fā)現(xiàn)，ZJ8 和JY417 兩種玉米幼苗葉片的光合速率、氣孔導度和蒸騰速率在鹽堿脅迫均顯著降低，而葉片胞間CO2則顯著升高（表2）；而哈茨木霉和長枝木霉處理下，ZJ8 和JY417 兩種玉米幼苗葉片的光合速率、氣孔導度和蒸騰速顯著升高，而葉片胞間CO2則顯著降低。這說明，兩種不同木霉菌對鹽堿脅迫下ZJ8 和JY417 兩種玉米幼苗葉片光合作用的提高主要通過緩解葉片非氣孔限制因素來實現(xiàn)。

作物葉片的細胞膜透性對鹽堿脅迫非常敏感，從而導致膜透性升高，抑制作物葉片的葉綠素合成，同時使葉片葉綠素降解速度加快，最終使作物的光合作用受到顯著抑制[24]。研究中發(fā)現(xiàn)，ZJ8 和JY417兩種玉米幼苗葉片的光合色素含量在鹽堿脅迫下均顯著下降（表3a and b），這表明鹽堿脅迫下，葉片Chl 的降解加快，而葉綠素合成受到明顯抑制，導致作物葉片葉綠體的光合作用降低；鹽堿脅迫同時ZJ8和JY417 兩種玉米幼苗葉片的細胞膜透性顯著增加，導致細胞膜脂過氧化，是玉米發(fā)生葉片發(fā)黃枯萎的狀態(tài)。而施用哈茨木霉和長枝木霉后，ZJ8和JY417兩種玉米幼苗葉片的光合色素含量顯著提高，同時緩解了鹽堿脅迫導致的葉片細胞膜透性增加，降低了葉片膜脂過氧化，基于此，木霉菌通過緩解不同品種玉米葉片的膜脂過氧化程度，提高葉片光合色素含量，這與前人研究結果相似[25]，研究結果同時發(fā)現(xiàn)木霉菌處理對ZJ8 的緩解作用較明顯。

研究作物葉片熒光參數在環(huán)境脅迫下的變化規(guī)律可以有效的探析逆境脅迫對作物光合作用結構損害程度，同時可以幫助研究人員掌握作物對光能的利用效率[26]。研究結果表明，ZJ8 和JY417 兩品種玉米幼苗葉片的Fv/F0、Fv/Fm在鹽堿脅迫下顯著下降（表3b），表明不同品種玉米幼苗光能利用率在鹽堿脅迫下均被顯著降低，最終使玉米的生長發(fā)育受到抑制。鹽堿脅迫下，施用哈茨木霉和長枝木霉能夠有效提高ZJ8 和JY417 兩品種玉米幼苗葉片的Fv/F0、Fv/Fm，從而有效緩解鹽堿脅迫對不同玉米葉片光合作用PSII 反應中心活性、光能利用效率產生的損傷，進而提高不同玉米品種的光合能力，對ZJ8 緩解作用更好，這一結果與研究中ZJ8 和JY417 兩品種玉米幼苗葉片的光合參數的測定結果相吻合。

在鹽堿脅迫下，通過不同木霉菌處理后，增強了玉米葉片的光合特性和光合色素含量，并誘導滲透調節(jié)物質可溶性糖，脯氨酸含量的變化?？扇苄蕴?、脯氨酸可以有效促進滲透調節(jié)，從而導致脫水耐受性增強。通過降低滲透勢來進行滲透調節(jié)，在細胞的水分保持和膨脹維持中起著關鍵作用，從而通過平衡溶質勢來最大程度地降低鹽堿脅迫的不利影響，有助于細胞生長。同時，不同木霉菌處理誘導了酶的變化，如 SOD、POD、APX、GPX 和 GR 酶活性的增加。以最大程度地降低鹽堿脅迫下ROS 引起的氧化損傷，作為多種防御機制之一，酶促抗氧化劑系統(tǒng)在提高植物抗性中起著重要作用。在抗氧化酶水平的提高可保護作物組織免受鹽堿脅迫下的膜氧化損傷，從而減輕鹽堿脅迫毒害改善玉米植株的生長。SOD、POD 和CAT 是作物抗氧化防御的關鍵成分[27]。作為抑制ROS 產生的第一種酶，SOD 是參與鹽堿脅迫耐受性的最有效的酶促抗氧化劑。基于這些機制的累積作用，鹽堿脅迫下，施用哈茨木霉和長枝木霉能夠有效緩降低脅迫對不同玉米品種幼苗造成的損傷。在促進不同品種玉米幼苗生長的同時，導致H2O2、O2-、MDA 含量的減少。簡而言之，木霉菌處理可能通過增加ROS 清除，并在鹽堿脅迫下維持滲透平衡和代謝穩(wěn)態(tài)來提高玉米的耐鹽堿性。

在生理水平上，木霉菌處理下緩解鹽堿脅迫對玉米生長的影響也歸因于作物中的ROS 水解（表4）。在正常條件下，包括超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）在內的ROS 在低濃度下可作為信號分子，但快速而過量的ROS 積累會在鹽脅迫下?lián)p害植物。 ROS 會影響細胞膜的完整性，酶活性和植物的光合作用設備[27-28]。 ROS 引起的氧化脅迫是暴露于環(huán)境脅迫下的植物的主要損害之一[29]。為了保護免受氧化脅迫的損害，作物依靠非酶和酶系統(tǒng)清除過量的ROS。例如增加酶促和非酶促抗氧化劑以清除ROS，并提高植物對鹽脅迫的耐受性[30]。因此，抗氧化防御系統(tǒng)通過調節(jié)這些酶以及在施用木霉菌后鹽堿脅迫下的抗氧化劑水平，在提高耐受性和減少有害作用方面起著重要作用。

4 結論

不同木霉菌處理后，顯著促進了兩玉米雜交品種的生長，提高了玉米幼苗的耐鹽堿性。研究結果發(fā)現(xiàn)哈茨木霉和長枝木霉處理均有效提高了鹽堿脅迫下不同基因型玉米幼苗葉片光合特性及光合色素含量，增加了ROS 的清除能力，維持滲透平和和代謝穩(wěn)態(tài)。結果表明，不同木霉菌處理能夠有效緩解鹽堿土壤脅迫對作物的危害，因此可以將木霉菌開發(fā)成為可持續(xù)農業(yè)的有效生物肥料。