李易初，石鳳梅，馬立功，劉佳，孟慶林

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，哈爾濱 150086）

大豆是人類主要糧食作物之一，具有高營養(yǎng)價(jià)值、高生理活性和廣泛工業(yè)用途的寶貴農(nóng)業(yè)資源[1]。大豆菌核病的病原菌是核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary），隸屬于子囊菌門、盤菌綱、柔膜菌目、核盤菌科、核盤菌屬[2]。核盤菌在全球范圍內(nèi)可危害400 多種植物，是一種世界性分布、寄主眾多，極具破壞性的植物病原真菌[3-4]。大豆菌核病在我國黑龍江、內(nèi)蒙古等地發(fā)生較為嚴(yán)重，病害流行年份可造成大豆減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重地塊損失達(dá)50%以上。菌核病不僅能造成大豆產(chǎn)量的嚴(yán)重?fù)p失[5]，還會影響大豆的蛋白質(zhì)、油分含量和外觀品質(zhì)[6]。

研究發(fā)現(xiàn)核盤菌生長繁殖過程中，H2O2與菌核的形成密切相關(guān)，菌絲內(nèi)H2O2含量達(dá)到一定水平后，核盤菌才能由營養(yǎng)菌絲生長階段轉(zhuǎn)變到菌核形成的Initial 階段[7]。阻止核盤菌H2O2積累，會影響菌核形成，核盤菌更多以菌絲形態(tài)存在，菌絲體可直接侵染寄主植物，是核盤菌常見的侵染方式，H2O2參與核盤菌的侵染、繁殖及抗逆過程。超氧化物歧化酶SOD（superoxide dismutase）普遍存在于生物體內(nèi)，它是一種參與氧代謝的酶[8]；過氧化物酶POD（Peroxidase）是一種活性較高的氧化還原保護(hù)酶[9]。生物體內(nèi)POD及SOD 是參與氧化還原反應(yīng)的關(guān)鍵酶，POD 主要以H2O2為電子受體催化底物氧化；SOD 能催化超氧陰離子轉(zhuǎn)化成H2O2和O2[10]。研究表明當(dāng)病原入侵寄主植物時，寄主植物會釋放O2-和H2O2[11]，核盤菌侵染寄主時，H2O2被相關(guān)酶快速分解，會影響植物初期防御抗性；H2O2被快速分解后能阻止核盤菌形成菌核，未萌發(fā)成子囊盤的菌核無法釋放子囊孢子侵染寄主，而核盤菌菌絲具有侵染性，分解H2O2的酶類活性會影響核盤菌菌株的致病力。目前，關(guān)于核盤菌致病機(jī)理的研究主要集中在病原菌侵染時產(chǎn)生的各種酶類及草酸毒性[12-14]，國內(nèi)外鮮見病原菌自身氧化酶活性差異與致病力強(qiáng)弱關(guān)系的研究報(bào)道，致病力強(qiáng)弱與POD 及SOD 活性關(guān)系尚未明確。因此，試驗(yàn)針對這一問題開展初步研究，通過強(qiáng)弱致病力差異菌株自身POD 和SOD 活性比較，分析核盤菌致病強(qiáng)弱與POD 和SOD 活性的關(guān)系，明確POD 及SOD 活性對核盤菌致病力的影響，為揭示核盤菌致病力機(jī)制提供新的思路，為進(jìn)一步揭示核盤菌致病力差異和致病機(jī)理提供理論支持。

1 材料與方法

收集黑龍江省不同地區(qū)不同地塊的大豆菌核病樣本，根據(jù)采集地點(diǎn)編號。菌核浸泡在75%乙醇溶液30 s 表面消毒，無菌水沖洗干凈，用手術(shù)刀切取菌核薄片，濾紙吸干菌核薄片水分，擺放在PDA 平板25 ℃條件培養(yǎng)，試驗(yàn)物品提前消毒滅菌，所有操作均在無菌條件下進(jìn)行[15]。按照上述方法分離得到大豆菌核病菌株10 份（見表1），4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 供試菌株編號及采集地點(diǎn)Table1 The strains numbers of S.sclerotiorum on soybean and collecting locations

1.1 核盤菌菌株致病力分化

選擇室內(nèi)離體葉片接種法進(jìn)行菌株間致病力差異試驗(yàn)[16]，根據(jù)培養(yǎng)相同時間侵染形成的病斑大小，判斷菌株致病力強(qiáng)弱。盆栽播種感病大豆品種農(nóng)青豆，28 d 后摘取植株最新一片完全展開的健康三出復(fù)葉進(jìn)行試驗(yàn)。供試菌株在PDA 平板活化72 h，沿菌落外緣打取R=0.5 cm 菌塊。菌碟擺放于復(fù)葉的中間葉片，注意避開主葉脈，接種時將著生菌絲一面貼合在葉面上，輕壓菌塊貼緊葉面不掉落[17]。每個供試菌株設(shè)3 次重復(fù)，對照處理組接種同等大小的純PDA 塊。試驗(yàn)過程中延長離體葉片存活時間，摘取葉片時保留葉柄，接種后葉柄包裹濕潤脫脂棉保濕。接種葉片集中擺放在鋪有濕潤紗布的平盤中，保鮮膜覆蓋包裹平盤，25 ℃恒溫保濕培養(yǎng)，所有試驗(yàn)用品提前滅菌消毒。72 h 調(diào)查發(fā)病情況并測量病斑直徑，十字交叉法測量病斑直徑，每個病斑在3 個不同不位置測量直徑取平均值。

1.2 酶粗液的提取

1.2.1 POD 酶粗液的提取

滅菌冷凝的PDA 平板上平鋪一層滅菌的玻璃紙，核盤菌PDA 平板活化72 h，外緣5 mm 菌塊擺放在玻璃紙中心25 ℃培養(yǎng)，每個菌株培養(yǎng)3 皿，培養(yǎng)時間和致病力試驗(yàn)時間一致72 h。粗酶液提取方法結(jié)合酶活測試盒推薦方法并在實(shí)際操作過程中略有改動[18]。刮取3 皿玻璃紙的菌絲存放在5 mL 離心管，用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?.6 g 菌絲加入5 mL 50 mmol·L-1預(yù)冷的 PBS 緩沖液（pH=7.4），在預(yù)冷的研缽研磨充分（或用勻漿器勻漿），樣本保持溫度2～8 ℃，離心 0.34 h（3 000 r·min-1），收集上清液，即為粗酶液。每個樣品取1 mL 粗酶液待檢測，其余粗酶液分裝冷凍備用。粗酶液提取后盡快試驗(yàn)，若不能馬上試驗(yàn)，需將標(biāo)本放置在-20 ℃冰箱保存，試驗(yàn)過程中避免反復(fù)凍融。

1.2.2 SOD 酶粗液的提取

SOD 粗酶液提取方法與POD 酶粗液提取方法相同。

1.3 酶活性的測定

1.3.1 POD 酶活性測定

按照POD 測試盒48 T（購自上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司）說明書的方法測定酶活性。根據(jù)試劑盒說明設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白對照孔及待測樣品孔。標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL；空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同；待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL（樣品最終稀釋度為5 倍）。加樣時需將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，輕輕晃動混勻，加樣過程中盡量不觸及孔壁。每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL，空白孔除外。用封板膜封板置37 ℃溫育1 h，揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s 后棄去，如此重復(fù)5 次，拍干。每孔順次加入顯色劑A 50 μL，顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色 0.25 h。每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。加入終止液0.25 h 后，以空白孔調(diào)零，450 nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，根據(jù)樣品的OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

1.3.2 SOD 酶活性測定

按照SOD 活性測試盒48 T（購自上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司）說明書方法測定SOD 活性，試驗(yàn)原理與步驟與POD 活性測定試驗(yàn)相同。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 22.0 軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 核盤菌致病力差異

接種72 h 用十字法測量葉片病斑直徑，供試菌株侵染得到病斑直徑數(shù)據(jù)見表2，按照病斑直徑從小到大順序排列供試菌株。菌株BQI033 接種72 h 后，PDA 菌塊氣生菌絲生長緩慢，與葉片貼合處未見菌絲侵染，接種處大豆葉片完好，無病斑形成，僅記錄接種菌塊直徑；BQI031 接種菌塊氣生菌絲生長延伸至大豆葉片表面，菌塊最外圈接觸的葉片部位顏色發(fā)生變化，病部葉片顏色變深、水浸狀，記錄病斑直徑0.6 cm；QD003 接種處褪綠，可見不規(guī)則病斑，病部葉片呈橄欖綠色，病斑直徑為1.0 cm。QA009 接種菌塊著生白色菌絲團(tuán)，接種處病斑較大、病部葉片深褐色，黃暈明顯，病斑擴(kuò)大不受葉脈限制；TY058 侵染致病面積最大，接種菌塊縮小變薄，瓊脂顏色變深，病斑黑色圓形外緣有黃暈，病斑處組織濕腐伴有白色菌絲生長（如圖1）。菌株BQI033、BQI031 和QA001 接種葉片未見明顯病斑，僅觀察到接種菌塊菌絲生長；菌株 QD003、MS010、BQ025 和 QA009 侵染形成病斑直徑≥1.0 cm，發(fā)病部位葉片顏色變深，接種處出現(xiàn)菌核病發(fā)病初期特征性水浸狀病癥；菌株 QA009、HG011、BA007 和 TY058 形 成 病 斑 直徑≥1.5 cm，病部近圓形，病斑黑褐色，外圈顏色發(fā)黃。

圖1 接種不同菌株形成的差異病斑（72 h）Fig.1 The disease spot different after inoculated with different strains（72 h）

SPSS 22.0 分析數(shù)據(jù)可知，10 個菌株接種后得到的病斑直徑差異較大，差異極顯著。試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，供試菌株的致病力差異在P＜0.05 水平差異極顯著。根據(jù)供試菌株病斑直徑差異可知試驗(yàn)核盤菌的菌株間致病力存在差異，接種后病斑較小其致病力較弱，病斑較大其致病力較強(qiáng)。結(jié)合病樣采集地點(diǎn)，致病力較弱菌株BQI033、BQI031 均來自雙鴨山市寶清縣；同來自綏化市慶安縣的菌株QA0013 和QA009，雖病樣采集地點(diǎn)相同，但致病力差異較大，病斑直徑差0.87 cm；菌株BQI031 和QA001 病斑直徑差異較小僅為0.03 cm，但樣品采集地點(diǎn)不同，分別來自寶清縣和慶安縣。試驗(yàn)結(jié)果表明：黑龍江省內(nèi)核盤菌菌株間致病力存在較大差異，致病力強(qiáng)弱差異與采集地點(diǎn)無相關(guān)性。菌株來源相同，存在致病力分化；來源不同的菌株，致病力表現(xiàn)也有相同。

表2 致病力分化試驗(yàn)結(jié)果（72 h）Table 2 The test results of differentiation pathogenic（ 72 h）

2.2 核盤菌體內(nèi)POD 及SOD 酶活性關(guān)系

菌株按照致病力從弱到強(qiáng)順序排列，記錄POD 和SOD 酶活試驗(yàn)結(jié)果見表3：BQI033 的SOD 酶活值為642.16 U·g-1，是供試菌株中 SOD 酶活最低值，其菌內(nèi)POD 酶活值1.15 U·g-1也為最低值；菌株TY058的SOD 酶活值是1 493.34 U·g-1，在供試菌株SOD酶活值中最高，其POD 酶活值也為最高值2.61 U·g-1。10 個菌株中有4 個菌株體內(nèi)POD 與SOD 活性排序相同，分別為菌株 BQI033、BQI031、BQ025 和TY058，占總體菌株的40%；3 個菌株體內(nèi)二種酶活在總體排位相近僅差一位，分別是QA001、QA009 和BA007，占總體菌株的30%。余下3 個菌株體內(nèi)中POD 與SOD 酶活性表現(xiàn)略有差別，QD003 菌株SOD 活性偏弱，SOD 活性較強(qiáng)；MSO10 體內(nèi) SOD 活性較強(qiáng)，在所有菌株SOD 活性中排在第二位是1 052.37 U·g-1，而POD 酶活性偏低，是總體菌株的第七位；HGO11 的POD 活性較高，排在所有菌株P(guān)OD 酶活性的第二位，其SOD 活性只排在第五位。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)單菌株體內(nèi)的POD 及SOD 兩種酶活性存在相似性，POD 活性強(qiáng)，SOD 活性也強(qiáng)，SOD 在生物體內(nèi)主要是清除其體內(nèi)的氧自由基；POD 酶起到催化過氧化氫、氧化酚類和胺類并消除其毒性的作用，兩種酶在功能上相輔相成。70 %供試單菌株體內(nèi)兩種酶活性在總體菌株的排序位置相同或相近，核盤菌菌株體內(nèi)SOD 和POD 酶活性表現(xiàn)相似。通過試驗(yàn)結(jié)果可知，POD 和SOD 兩種酶的活性強(qiáng)弱隨著核盤菌菌株不同存在個體差異，兩種酶在同一菌株中的活性表現(xiàn)相同或相近，活性強(qiáng)弱相似，僅有少數(shù)菌株中SOD 和POD 酶活性存在差異。

表3 核盤菌供試菌株內(nèi)SOD 及POD 酶活性Table 3 The relationship between SOD and POD enzyme activity in strains

2.3 核盤菌POD 活性比較

按致病力強(qiáng)弱順序排列供試菌株樣品并對比POD 活性測定結(jié)果，菌株 BQI033、BQI031 和 QA001的致病力較弱，侵染形成的病斑直徑均＜1.0 cm，上述3 個菌株體內(nèi)的 POD 酶活值均＜1.6 U·g-1；菌株QD003、MS010、BQ025、QA009、HG011 和 BA007 侵染得到的病斑直徑在1.0～2.0 cm 之間，POD 活性測試結(jié)果在 1.6～2.0 U·g-1之間；菌株 TY058 的致病力最強(qiáng)，POD 活性亦最強(qiáng)，病斑直徑為2 cm，POD 酶活值為2.61 U·g-1（如圖2 所示）。試驗(yàn)結(jié)果可知，供試菌株中大部分菌株的菌內(nèi)POD 活性與菌株的致病力正相關(guān)，菌株致病力強(qiáng)，其體內(nèi)POD 活性也強(qiáng)，隨著不同菌株致病力的增強(qiáng)，不同菌株體內(nèi)POD 活性值也增大。其中，供試菌株 QD003 的 POD 活值是 1.75 U·g-1，相鄰菌株 MS010 的 POD 酶活性為 1.63 U·g-1，QD003 較MS010 的致病力弱，而POD 酶活性卻略強(qiáng)于 MS010；菌株 BA007 的 POD 活性是 1.83 U·g-1，而致病力稍差的HG011 體內(nèi)POD 活性卻高于BA007是 1.93 U·g-1。菌株 QD003 和 BA007 的 POD 酶活性未完全與菌株的致病力強(qiáng)弱正相關(guān)，推測原因可能是相鄰菌株間致病力差異較小，POD 活性變化不明顯。由結(jié)果初步推測：核盤菌內(nèi)不同菌株致病力不同，致病力強(qiáng)的菌株，菌株體內(nèi)POD 活性強(qiáng)。隨著供試菌株致病力從弱到強(qiáng)順次排序，不同菌體內(nèi)POD酶活值逐漸增大，10 個菌株的酶活值總體趨勢遞增。

圖2 病斑直徑與菌株內(nèi)POD 酶活性的關(guān)系Fig.2 The relationship between spot diameter and POD enzyme activity in strains

2.4 核盤菌SOD 活性比較

圖3 病斑直徑與菌株內(nèi)SOD 酶活性的關(guān)系Fig.3 The relationship between spot diameter and SOD enzyme activity in strains

菌株QA009 到TY058 的致病力較強(qiáng)，侵染形成的病斑直徑≥1.5 cm，SOD 酶活性均高于1 000 U·g-1；菌株BQI033 和TY058 致病力差異最大，兩株菌株對應(yīng)的SOD 酶活性之差＞800 U·g-1，酶活性分別為642.16 U·g-1和 1 493.34 U·g-1；其中 QA001 和MS010 較致病力相似的相鄰菌株的SOD 酶活性高，未與趨勢線完全吻合。菌株BQI033、BQI031、QA001的致病力逐漸增強(qiáng)，3 個菌株內(nèi)的SOD 酶活數(shù)值亦依次遞增；從菌株BQ025 到TY058，不同菌體內(nèi)SOD酶活性值大小與菌株致病力強(qiáng)弱關(guān)系一致。觀察所有供試菌株SOD 活數(shù)值，不同菌株間SOD 酶活值總體趨勢與菌株致病力強(qiáng)弱變化相關(guān)。菌株之間QA001、QD003 和 MS010 的 SOD 酶存在波動，兩個菌株的SOD 活性未完全與菌株致病力變化一致。

綜上所示，同屬一個菌株的POD 及SOD 酶活性變化趨勢相同，不同菌株間POD 及SOD 酶活性存在差異；SOD 酶活試驗(yàn)結(jié)果與POD 酶活結(jié)果總體表現(xiàn)一致，隨著菌株致病力的增強(qiáng)，菌株體內(nèi)SOD 及POD 酶活性也較致病力弱的菌株的酶活值大，不同菌株間酶活性變化趨勢與菌株致病力強(qiáng)弱變化表現(xiàn)一致。從菌株內(nèi)SOD 和POD 活性趨勢及與致病力強(qiáng)弱的關(guān)系等不同角度分析，發(fā)現(xiàn)少數(shù)菌株間酶活性和致病力關(guān)系存在差異，供試菌株中酶活性未完全按照致病力增強(qiáng)而增大的菌株均出自菌株QA001、QDOO3 和MS010。推測此種情況出現(xiàn)的原因，菌株個體存在差異或因菌株間致病力差異較小，酶活變化不明顯所致。具體原因有待下一步試驗(yàn)證明，核盤菌的致病力與其體內(nèi)POD 及SOD 酶活性的關(guān)系仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

3 討論

通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黑龍江地區(qū)大豆菌核病致病菌株間致病力差異顯著，存在核盤菌致病力分化現(xiàn)象，并明確致病力分化與菌株來源地?zé)o明顯相關(guān)性，此研究結(jié)果與劉春來等[19]研究結(jié)果一致。也有試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同采樣地點(diǎn)的大豆菌核病病原菌，它們的菌落形狀和生長速率差異極顯著，核盤菌存在區(qū)域?qū)；訹20]。大豆菌核病生物學(xué)特性研究存在區(qū)域轉(zhuǎn)化性，而致病力強(qiáng)弱卻受地理因素影較小，核盤菌菌絲的生長速度與致病力強(qiáng)弱密切相關(guān)，近幾年黑龍江省大豆種植面積減少且不集中，菌核樣品采集數(shù)量有限，對核盤菌致病機(jī)制仍需繼續(xù)研究。

研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)核盤菌中菌絲體與死體營養(yǎng)體菌核的形態(tài)轉(zhuǎn)變與其體內(nèi)的氧含量有關(guān)，核盤菌菌株體內(nèi)氧含量增高時，菌絲體向死體營養(yǎng)體菌核變化；反之，核盤菌內(nèi)SOD 和POD 酶活性大，可快速分解催化體內(nèi)的過氧化氫和氧自由基[21]，菌株體內(nèi)氧含量少，核盤菌仍處在可直接侵染寄主的菌絲體狀態(tài)，具有較強(qiáng)的致病力。當(dāng)病原菌侵染寄主植物時，寄主在調(diào)動體內(nèi)最早期的防衛(wèi)反應(yīng)時會產(chǎn)生大量的活性氧[22]，妨礙病原菌的定殖侵染。菌株體內(nèi)的POD 及SOD 活性較強(qiáng)，在侵入寄主體內(nèi)時，不斷進(jìn)行氧化還原反應(yīng)催化活性氧轉(zhuǎn)變成O2和H2O，阻斷信號傳導(dǎo)并減弱寄主的抗性反應(yīng)，寄主易被侵染，因而菌株表現(xiàn)為致病力較強(qiáng)。核盤菌菌態(tài)與致病力的關(guān)系和核盤菌侵染過程中阻斷信號傳遞與致病力的關(guān)系兩方面分析，菌株體內(nèi)POD 和SOD 活性均與菌株致病力相關(guān)，試驗(yàn)得到核盤菌菌內(nèi)參與氧化還原酶活性與致病力正相關(guān)結(jié)果一致。通過試驗(yàn)初步推斷，核盤菌致病強(qiáng)弱與菌株體內(nèi)POD 和SOD 酶活性呈正相關(guān)，菌株致病力越強(qiáng)，菌株體內(nèi)POD 及SOD 酶活性越強(qiáng)。由于核盤菌致病機(jī)理研究中對病原菌本身氧化還原酶活性研究較少，分析比較的報(bào)道較少，核盤菌菌體內(nèi)POD 和SOD 活性與致病力關(guān)系需進(jìn)一步試驗(yàn)，同時仍需不同來源地核盤菌試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

黑龍江地區(qū)大豆菌核病菌致病力分化較大，同地區(qū)核盤菌菌株存在致病力分化現(xiàn)象，且此種分化與菌株來源地?zé)o相關(guān)性。試驗(yàn)初步發(fā)現(xiàn)核盤菌菌內(nèi)POD 活性與SOD 活性表現(xiàn)相近，同一菌株體內(nèi)POD酶活性強(qiáng)，則SOD 活性亦強(qiáng)；核盤菌致病強(qiáng)弱與菌體內(nèi)POD 及SOD 酶活性呈正相關(guān)，核盤菌致病力越強(qiáng)，POD 及 SOD 活性越強(qiáng)。