李 旭 葉 放 劉一秀 趙 宇 謝 鑫 楊立群 屠冠軍

1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院足踝外科，遼寧沈陽(yáng) 110024；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心，遼寧沈陽(yáng) 110847；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)遼寧省計(jì)劃生育研究所，遼寧沈陽(yáng) 110031；4.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)院骨科，遼寧沈陽(yáng) 110001

低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是誘導(dǎo)低氧基因和維持細(xì)胞氧內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的核心因子，可以調(diào)節(jié)能量代謝，血管形成，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞分化，基質(zhì)合成等相關(guān)基因的表達(dá)[1]。間盤組織處于一種低氧環(huán)境中，研究表明HIF－1α 在間盤中有表達(dá)[2]。Ha[3]等研究發(fā)現(xiàn)，在不同程度人突出椎間盤中，HIF-1α 的表達(dá)程度與細(xì)胞凋亡程度之間存在高度相關(guān)性，而其作用于髓核細(xì)胞凋亡的路徑尚不完全清楚。本研究探討HIF-1α 在間盤細(xì)胞凋亡中的作用，通過(guò)檢測(cè)HIF-1α 誘導(dǎo)凋亡途徑中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，揭示HIF-1α 在SD 大鼠髓核細(xì)胞線粒體凋亡路徑中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

選擇剛斷奶的30日齡SD 大鼠，一共20 只，清潔級(jí)，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（遼）2013-0001，檢疫合格備用，經(jīng)過(guò)相關(guān)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核同意，選擇光線充足、通風(fēng)良好的實(shí)驗(yàn)環(huán)境，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后備用，其中10 只為雌性，10 只為雄性，體重為50～60 g。

SABC 免疫組化試劑盒（博士德公司，批號(hào)：QD82102），兔抗鼠Ⅱ型膠原一抗（Neomakers 公司，批號(hào)：SC17852），山羊抗兔抗體（IgG）（北京百奧萊博科技有限公司，批號(hào)：F030212），單克隆兔抗鼠HIF-1α一抗（Santa Cruz 公司），CAY10585（cayman 公司，批號(hào)：10012682-5），CoCl2（上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司，批號(hào)：20080890），CO2培養(yǎng)箱（德國(guó)Seracell），三氣低氧培養(yǎng)箱（型號(hào)：Heraeus cell 150），倒置相差顯微鏡（奧特光學(xué)器材廠），正置光學(xué)顯微照相系統(tǒng)（奧特光學(xué)器材廠，型號(hào)：Olympus BX51），電泳儀（美國(guó)IKA 公司），轉(zhuǎn)印儀（美國(guó)IKA 公司），722 分光光度計(jì)（美國(guó)IKA 公司），流式細(xì)胞儀（Calibar BD USA）。

1.2 髓核細(xì)胞原代培養(yǎng)及純化

在無(wú)菌條件下取30日齡SD 大鼠腰椎髓核組織，用小剪刀將其剪碎成約1 mm3的碎塊。以0.25%的胰蛋白酶液于室溫下消化20 min。低速離心（1000 r/min）10 min，吸取上清液，以2%的Ⅱ型膠原酶于孵箱中消化過(guò)夜。髓核細(xì)胞經(jīng)無(wú)菌尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾（孔徑75 μm），計(jì)數(shù)。將細(xì)胞接種于12 孔板中，按1×104/mL 密度接種。在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM/F12 加20%的胎牛血清，每3 天換液1 次，按時(shí)用倒置顯微鏡觀察、拍照。細(xì)胞融合為單層時(shí)用胰蛋白酶消化并進(jìn)行細(xì)胞傳代。

將培養(yǎng)所得細(xì)胞懸液置于無(wú)血清培養(yǎng)瓶中靜置4 h，實(shí)時(shí)在相差顯微鏡下對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞貼壁搖晃培養(yǎng)瓶貼壁細(xì)胞不浮起時(shí)，將上液倒入另一培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，反復(fù)操作，以便將髓核細(xì)胞分離開來(lái)。

1.3 使用SABC 法對(duì)Ⅱ型膠原進(jìn)行檢測(cè)

細(xì)胞爬片后以10%福爾馬林固定，30% H2O2一份加純甲醇50 份混合以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，滴加5% BSA 封閉液阻斷，室溫20 min 后加稀釋的兔抗鼠Ⅱ型膠原一抗，37℃1 h，滴加山羊抗兔IgG 抗體，37℃20 min，滴加試劑SABC，DAB 顯色后脫水、透明、封片后觀察。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及施加處理因素

將培養(yǎng)所得的髓核細(xì)胞分為四組進(jìn)行處理，具體如下。A 組（低氧條件組）：O25%，CO25%，N290%（模擬正常間盤環(huán)境）；B 組（過(guò)度低氧條件組）：O22%，CO25%，N293%（模擬退變間盤環(huán)境）；C 組（低氧并經(jīng)Co-Cl2處理組）：O25%，CO25%，N290%（HIF-1α 高表達(dá)）；D 組（低氧條件并經(jīng)CAY10585 處理組）：O25%，CO25%，N290%（HIF-1α 表達(dá)受抑制）。通過(guò)促進(jìn)（C組）與抑制（D 組）HIF-1α 表達(dá)，并與對(duì)照組（A 組）進(jìn)行比較，驗(yàn)證HIF-1α 表達(dá)多少與p53、Bax、caspase3、Bcl-2 表達(dá)趨勢(shì)間的關(guān)系及與髓核細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系。各組在各自條件下培養(yǎng)24 h。CoCl2濃度為200 mmol/L，CAY10585 濃度為0.01 mmmol/L。

1.5 Western Blot 檢測(cè)各蛋白表達(dá)

收集各組細(xì)胞，提取蛋白，蛋白定量，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印，封閉過(guò)夜，堿性磷酸酶顯色。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

消化，洗滌，調(diào)整細(xì)胞濃度到1×106/mL 后離心，固定，PI 染色，上機(jī)檢測(cè)，輸入計(jì)算機(jī)分析細(xì)胞凋亡的百分率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行相關(guān)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較先行ANOVA 檢測(cè)，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 使用倒置相差顯微鏡對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察

髓核細(xì)胞在顯微鏡下為梭形或多角形，輪廓比較清楚，細(xì)胞核為圓形（圖1）。

圖1 倒置顯微鏡下查看培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)（100×）

2.2 免疫組化法Ⅱ型膠原染色

髓核細(xì)胞漿中表達(dá)的Ⅱ型膠原在顯微鏡下染色呈現(xiàn)為棕色染色，細(xì)胞核核圓形呈藍(lán)色染色（圖2）。

圖2 顯微鏡下觀察染色的髓核細(xì)胞鏡下形態(tài)（SABC，400×）

2.3 Western Blot 檢測(cè)各相關(guān)蛋白表達(dá)的情況及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組髓核細(xì)胞凋亡的情況

Western Blot 呈現(xiàn)的結(jié)果顯示，HIF-1α、p53、Bax、Bcl-2、caspase3 在各組中均有表達(dá)（圖3）。單因素方差分析結(jié)果顯示，各組的相關(guān)蛋白表達(dá)情況及髓核細(xì)胞凋亡情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。C 組中HIF-1α 蛋白的表達(dá)高于A 組和B 組，B 組中HIF-1α 蛋白的表達(dá)高于A 組，D 組中HIF-1α 蛋白的表達(dá)低于A 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。p53、Bax、caspase3 蛋白表達(dá)的趨勢(shì)在各組中相一致，在C組中最高，且表達(dá)程度高于A 組和B 組，B 組高于A 組，D 組表達(dá)最低，而且亦低于A 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Bcl-2 蛋白的表達(dá)情況上，C 組中最低，低于A 組，D 組最高，高于A 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，單因素方差分析結(jié)果顯示，各組的凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中C 組高于B 組和A 組，B 組高于A 組，D 組低于A 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

圖3 Western Blot 檢測(cè)各相關(guān)蛋白表達(dá)的情況

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡的情況

細(xì)胞凋亡率上，C 組＞B 組＞A 組＞D 組（圖4）。

2.5 HIF-1α、p53、Bax、Bcl-2 及caspase3 變化與凋亡率的相關(guān)性分析

HIF-1α、p53、Bax、Bcl-2 及caspase3 變化與凋亡率均呈正相關(guān)性（P＜0.05）（表2）。

3 討論

目前臨床上多種脊柱退變性疾病都是由椎間盤的退變[4]引起的，嚴(yán)重影響著患者的工作及生活質(zhì)量，而在對(duì)此類疾病的治療方面不論是通過(guò)非手術(shù)治療還是通過(guò)手術(shù)治療都不能得到令人滿意的效果。因此，很多學(xué)者越來(lái)越熱衷于探索椎間盤退變的分子生物學(xué)機(jī)制研究，以期在出現(xiàn)癥狀之前可以早期干預(yù)椎間盤組織的退變并逆轉(zhuǎn)此過(guò)程[5]，以達(dá)到早期治療脊柱退行性疾病的目的。椎間盤組織中的髓核細(xì)胞是主要功能細(xì)胞，研究表明髓核細(xì)胞凋亡在間盤組織退變過(guò)程中起到了至關(guān)重要的作用[6-7]。

表1 四組相關(guān)蛋白表達(dá)情況及髓核細(xì)胞凋亡情況的比較（±s）

表1 四組相關(guān)蛋白表達(dá)情況及髓核細(xì)胞凋亡情況的比較（±s）

B 組與A 組比較，*P＜0.05

組別HIF-1αp53BaxBcl-2caspase3凋亡率（%）A 組B 組C 組D 組F 值P 值tC 組與A 組比較值PC 組與A 組比較值tC 組與B 組比較值PC 組與B 組比較值tD 組與A 組比較值PD 組與A 組比較值0.241±0.025 0.352±0.031*0.591±0.021 0.204±0.031 12.635＜0.05 25.819 0.000 14.273 0.000 23.111 0.000 0.417±0.029 0.446±0.021*0.721±0.023 0.311±0.019 11.058＜0.05 18.365 0.000 19.434 0.000 30.731 0.000 0.511±0.032 0.581±0.011*0.784±0.035 0.293±0.018 10.117＜0.05 12.872 0.000 12.373 0.000 27.896 0.000 0.516±0.018 0.409±0.019 0.384±0.033 0.582±0.026 9.869＜0.05 7.852 0.000 1.468 0.180 10.538 0.000 0.281±0.029 0.322±0.018*0.433±0.029 0.217±0.023 13.386＜0.05 8.287 0.000 7.272 0.000 13.049 0.000 0.181±0.021 0.252±0.033*0.328±0.019 0.095±0.018 14.362＜0.05 11.607 0.000 14.630 0.002 19.907 0.000

圖4 各組細(xì)胞的凋亡情況

表2 HIF-1α、p53、Bax、Bcl-2 及caspase3 變化與凋亡率的相關(guān)性分析

HIF-1α 是Semenza 等于20世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞內(nèi)重要因子，其參與了體內(nèi)的許多生物學(xué)過(guò)程，起到維持細(xì)胞、組織在低氧條件下的內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定，從而使細(xì)胞適應(yīng)此種低氧的環(huán)境[8-10]。間盤組織中因?yàn)闆](méi)有血管，因此營(yíng)養(yǎng)只能是通過(guò)終板和纖維環(huán)的途徑來(lái)進(jìn)行傳遞。隨著人的機(jī)體老化以及某些病理的因素，終板軟骨組織逐漸出現(xiàn)鈣化，因此氧氣等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)路徑受到阻塞，致使椎間盤組織內(nèi)的低氧狀態(tài)愈加嚴(yán)重。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[1]，椎間盤組織中的髓核細(xì)胞正是處于這種低氧濃度的組織環(huán)境之中，因此可以誘導(dǎo)髓核細(xì)胞通過(guò)某個(gè)途徑來(lái)表達(dá)HIF-1α，進(jìn)而以達(dá)到使整個(gè)間盤組織能夠適應(yīng)這種低氧濃度的組織內(nèi)環(huán)境，但也有相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明HIF-1α 的過(guò)度表達(dá)也可能起反作用，加速間盤組織的退變過(guò)程[5]。目前，在對(duì)軟骨細(xì)胞的研究中也發(fā)現(xiàn)HIF-1α 對(duì)其具有調(diào)節(jié)作用[11]，髓核細(xì)胞與軟骨細(xì)胞屬于同源細(xì)胞，具有很高的相似性，髓核細(xì)胞也是主要靠無(wú)氧代謝過(guò)程來(lái)獲取其代謝所需的能量[12]。有研究[13-14]表明，髓核細(xì)胞處于間盤這種低氧濃度的環(huán)境之中，可以促使髓核細(xì)胞表達(dá)HIF-1α，而HIF-1α 洽是這種細(xì)胞內(nèi)的重要調(diào)節(jié)因子，從而使間盤組織中的細(xì)胞適應(yīng)這種低氧濃度環(huán)境。在這個(gè)過(guò)程中其參與了間盤組織的營(yíng)養(yǎng)代謝，血管的形成，以及髓核細(xì)胞凋亡和分化等重要環(huán)節(jié)[15]。

以往的研究[16]表明，HIF-1α 可以通過(guò)多種方式和途徑以使細(xì)胞適應(yīng)生存于這種低氧濃度的環(huán)境。Moritz 等[17]的研究說(shuō)明，HIF-1α 可使脾細(xì)胞能夠在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中適應(yīng)低氧條件，但是其研究也說(shuō)明當(dāng)?shù)脱醮碳み^(guò)大時(shí)HIF-1α 反而可以導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。退變間盤組織中的氧濃度更低，退變間盤組織中測(cè)得的氧分壓明顯低于正常的間盤組織。文獻(xiàn)報(bào)道[3]在臨床手術(shù)中所得的人突出間盤中，其間盤的突出程度不同，測(cè)得的HIF-1α 的表達(dá)程度也明顯不同，同樣測(cè)得的髓核細(xì)胞凋亡程度也明顯不同，其二者的相關(guān)性分析結(jié)果表明二者之間存在高度相關(guān)性。筆者在之前的研究中證明了大鼠的髓核細(xì)胞中HIF-1α 過(guò)度表達(dá)可以導(dǎo)致原代培養(yǎng)的髓核細(xì)胞凋亡的增加，因此筆者認(rèn)為在一定情況下HIF-1α 是髓核細(xì)胞發(fā)生凋亡的一個(gè)誘因。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的程序性死亡過(guò)程，其發(fā)生過(guò)程受到一定程度的調(diào)控，HIF-1α 可以通過(guò)一定的調(diào)節(jié)過(guò)程來(lái)影響凋亡相關(guān)基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，最終可能造成細(xì)胞凋亡[18]。近些年來(lái)研究的重點(diǎn)集中于HIF-1α 在腫瘤細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制，相關(guān)研究證明HIF-1α 可以在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)某些調(diào)節(jié)機(jī)制從而激活能促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡的分子、或者是能夠抑制抗凋亡的相關(guān)分子的表達(dá)，從而達(dá)到促發(fā)細(xì)胞凋亡的一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，最終使細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，這個(gè)過(guò)程就是所說(shuō)的基因調(diào)控機(jī)制，其最終的結(jié)果就是通過(guò)一個(gè)共同的路徑影響細(xì)胞的程序性死亡過(guò)程[19]。調(diào)控細(xì)胞發(fā)生凋亡的分子有很多，如Bcl-2 家族、細(xì)胞周期蛋白或其他調(diào)節(jié)分子。本研究分析HIF-1α、p53、Bax、Bcl-2 及caspase3 變化與凋亡率的相關(guān)性，結(jié)果顯示，HIF-1α、p53、Bax、Bcl-2 及caspase3 變化與凋亡率均呈正相關(guān)性（P＜0.05）。p53 是一種抑癌因子，研究表明，在低氧條件下，低氧誘導(dǎo)因子突變型肝癌細(xì)胞不能增加p53 的表達(dá)，而野生型則可以促進(jìn)p53 表達(dá)，并可以發(fā)現(xiàn)有大量的肝癌細(xì)胞發(fā)生程序性死亡[20]。Greijer 等[21]的研究表明，p53 基因敲除后低氧促發(fā)的細(xì)胞凋亡明顯受到抑制。而對(duì)于在髓核細(xì)胞中HIF-1α是通過(guò)哪些方式來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡卻沒(méi)有定論，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)調(diào)控HIF-1α 蛋白的表達(dá)并同時(shí)測(cè)定p53、Bcl-2、Bax、caspase3 蛋白的表達(dá)情況，提示了HIF-1α 表達(dá)與髓核細(xì)胞的線粒體凋亡路徑有一定相關(guān)性，但具體的作用機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。

4 小結(jié)

HIF-1α 表達(dá)程度的增加可以誘發(fā)髓核細(xì)胞的凋亡程度也相應(yīng)提高，從而說(shuō)明了HIF-1α 可以通過(guò)某種機(jī)制促發(fā)髓核細(xì)胞凋亡。通過(guò)HIF-1α 不同表達(dá)程度下檢測(cè)線粒體凋亡路徑中相關(guān)因子p53、Bax、Bcl-2、caspase3 的表達(dá)情況，說(shuō)明了HIF-1α 與這些蛋白表達(dá)的相關(guān)性，也預(yù)示了HIF-1α 對(duì)SD 大鼠髓核細(xì)胞線粒體凋亡路徑的影響作用。