吳雅廷，劉海亮,2

(1.石河子大學生命科學學院新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室，新疆 石河子 832003；2.同濟大學附屬東方醫(yī)院再生醫(yī)學研究所，上海 200123)

柚皮素是一種黃酮類化合物，主要存在于柑橘類的水果中[1-2]，國內外研究表明柚皮素具有抗氧化[3]、抗癌[4]、抗衰老[5]、神經保護[6]等多種生物活性功能。研究發(fā)現(xiàn)柚皮素對多種細胞的活力有一定的調控作用，例如對血管內皮細胞活力具有明顯的促進作用[7]；對神經小膠質細胞的增殖具有一定的促進作用[8]，并且能夠抑制神經細胞凋亡[9]。相關研究提出柚皮素對脂肪間充質干細胞(adipose-derived stem cell,ADSC)中相關基因的表達具有一定的調控作用[10-11]，因此探究柚皮素對脂肪間充質干細胞細胞活力是否具有一定的影響具有一定的研究意義。

ADSC因其具有自我更新速度快、能夠穩(wěn)定增殖、具備多項分化潛能的特點[12]，作為臨床上較為理想的干細胞治療的細胞來源[13]，有關其維持細胞干性功能的研究具有非常重要的意義[14-15]。

本實驗通過柚皮素對體外培養(yǎng)的ADSC的干預作用探究其對ADSC增殖情況的影響。該實驗過程中通過探究柚皮素對ADSC的細胞周期及與ADSC增殖相關的P16ink4a的蛋白表達情況、活性氧類(ROS)含量、細胞衰老狀況的影響，了解了柚皮素對ADSC增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

成人脂肪間充質干細胞來源于同濟大學表觀遺傳學實驗室，細胞鑒定工作在實驗室前期相關實驗中已經完成[16]。

DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清溝自于美國Gibco公司。柚皮素(HPLC>98%)購自于北京世紀奧科生物技術有限公司。CCK-8試劑盒、細胞周期試劑盒、活性氧(ROS)檢測試劑盒、β-半乳糖苷酶染色試劑盒購自于碧云天生物技術有限公司、P16ink4a-抗體及兔抗體購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與藥物處理 ADSC培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱。當細胞濃度達到80%～90%時，用0.25%Trypsin EDTA消化細胞，按照1∶3的比例對細胞進行傳代培養(yǎng)。按照作用于細胞的柚皮素濃度不同，以低濃度(6.25μmol/L)、中間濃度(25μmol/L)、高濃度(100μmol/L)的濃度梯度加入96孔板處理細胞24h，其中對照組以等體積的PBS取代柚皮素對細胞進行干預。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖 收集對數(shù)生長期的細胞以5×103/孔接種于96孔板，每組設置5個復孔，貼壁培養(yǎng)過夜后柚皮素干預24h和48h后，每孔加10μL CCK-8溶液并使其混合均勻。使用酶標儀在450nm波長處檢測吸光值。該實驗進行3次以上統(tǒng)計分析。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞周期 收集對數(shù)生長期的細胞以1×104/孔接種于6孔板，每組設置3個復孔，貼壁培養(yǎng)過夜后柚皮素干預24h后，終止培養(yǎng)，用0.25%Trypsin EDTA消化細胞，離心(離心半徑13.5cm，1000r/min,5min)并棄上清液，預冷PBS洗滌細胞3次。用預冷的70%無水乙醇固定過夜，再加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液200μL，避光染色 30min，用流式細胞儀在激發(fā)波長488nm波長處檢測染色結果，用FlowJo軟件分析細胞周期。該實驗進行3次以上統(tǒng)計分析。

1.2.4 Western印跡法檢測P16ink4a的表達水平 收集對數(shù)生長期的細胞以1×104/孔接種于6孔板，每組設置3個復孔，貼壁培養(yǎng)過夜后柚皮素干預24h后，終止培養(yǎng)吸去上清加入無酶RIPA細胞裂解液置于冰上裂解10min，4℃離心(離心半徑13.5cm，12000r/min，10min)收集蛋白，利用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定hADSC蛋白濃度，調整蛋白濃度保持一致加蛋白上樣緩沖液混勻并煮沸。進行SDS-PAGE電泳(120V，60min)，根據(jù)三色預染蛋白marker和P16ink4a蛋白大小進行切膠，按照轉膜的“三明治”結構進行轉膜(60V，80min)，封閉液室溫封閉1h，加P16ink4a抗體按1∶1000稀釋好后4℃孵育過夜并洗去多余的一抗，再用兔抗體(1∶10000)孵育2h。利用化學發(fā)光法檢測蛋白表達情況，利用雅酶試劑盒將發(fā)光液(A液∶B液=1∶1)加到PVDF膜上，孵育3min。吸去多余的液體在化學發(fā)光成像系統(tǒng)(ImageQuant LAS)進行灰度分析。該實驗進行3次以上統(tǒng)計分析。

1.2.5 β-半乳糖苷酶染色 收集對數(shù)生長期的p16代次的細胞以5×103/孔接種于12孔板，每組設置3個復孔，在37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱貼壁培養(yǎng)過夜后，用含柚皮素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24h后，無菌PBS洗滌12孔板中貼壁細胞3次，每孔加入4%多聚甲醛細胞固定液100μL室溫固定細胞30min并吸去固定液，用PBS沖洗2遍。用細胞β-半乳糖苷酶染色試劑盒進行染色，每孔加染色液100μL(A液1%、B液1%、C液93%、X-Gal染液5%)，37℃培養(yǎng)箱避光染色過夜，PBS沖洗2遍，用DAPI(0.1%)染色液染核，PBS沖洗2遍，每孔再加500μL無菌PBS使細胞保持濕潤，在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞染色結果，觀察過程中選取5個規(guī)定區(qū)域，對每個區(qū)域總細胞進行計數(shù)和染色細胞計數(shù)取平均值。該實驗進行3次以上統(tǒng)計分析。

1.2.6 細胞內ROS檢測 收集對數(shù)生長期的細胞以5×103/孔接種于96孔板，每組設置5個復孔，在37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱貼壁培養(yǎng)過夜后柚皮素干預24h后，再加入ROS檢測試劑5μL避光繼續(xù)培養(yǎng)30min。使用iD3酶標儀在480、525nm 處檢測吸光值分析ADSC內ROS含量。

1.2.7 mRNA測序 6孔板培養(yǎng)脂肪間充質干細胞，濃度為25μmol/L柚皮素處理細胞24h后吸去培養(yǎng)基，用PBS沖洗2～3次，加入一定量TRIzol(美國Invitrogen公司)裂解細胞并提取總RNA，并用分光光度計(美國Thermo公司)對總RNA進行定量。對符合質量標準(A260/A280>1.8)的樣品進行測序。數(shù)據(jù)分析基于高通量測序結果，建立參照基因組索引:Bowtie v2.0.6(bowtie-bio.source-forge.net/bowtie2)計算每個樣本的基因表達水平。差異基因表達通過熱圖和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes;https:∥www.genome.jp/kegg)進行分析。KEGG分析時，P<0.05作為判斷基因顯著富集的閾值。測序數(shù)據(jù)可以根據(jù)需要聯(lián)系通信作者，予以提供。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 柚皮素對ADSC增殖的影響

不同濃度柚皮素干預24、48h后ADSC的細胞活性檢測結果如圖1所示，當不同濃度柚皮素干預24h后，與對照組相比，當柚皮素在低濃度(6.25μmol/L) 時增殖率為95.8%，與對照組之間差異無統(tǒng)計學意義，在中間濃度(25μmol/L)時明顯促進了細胞的增殖(P<0.01)，細胞的增殖速率為120.3%；在高濃度(100μmol/L) 時增殖率為51.6%(P<0.01)，對細胞增殖具有明顯的抑制的作用。干預48h后細胞活力檢測結果如圖1所示，在低濃度(6.25μmol/L)時增殖率為97.9%，與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義；在中間濃度(25μmol/L)時增殖率為114.6%與對照組相比具有明顯的促進作用(P<0.05)，在高濃度(100μmol/L)時增殖率為48%(P<0.01)，對細胞增殖具有明顯的抑制作用。柚皮素干預細胞24、48h后，檢測結果均表現(xiàn)出濃度為25μmol/L時對細胞增殖具有明顯的促進作用，而在低濃度 (6.25μmol/L) 時對細胞增殖無明顯的促進作用，在高濃度(100μmol/L)時對細胞的增殖具有明顯的抑制作用。

圖1 不同濃度柚皮素干預下ADSC的增殖情況Fig.1 Effects of different concentrations of naringenin on cell proliferation*P<0.05，**P<0.01；ns:差異無統(tǒng)計學意義

2.2 柚皮素對ADSC細胞周期的影響

根據(jù)2.1的結果，即柚皮素濃度為25μmol/L時促進了細胞的增殖，進一步檢測了不同濃度對ADSC細胞周期的影響。藥物干預后細胞周期變化情況如圖2所示，流式細胞術結果表明，當柚皮素濃度為 25μmol/L 干預細胞后，與對照組相比，G1期細胞比例減少，快速進入S期，S期細胞比例增加，G2/M期細胞所占比例差異無統(tǒng)計學意義。細胞流式數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析結果表明，柚皮素濃度為25μmol/L時，在G0/G1期細胞所占比例明顯低于對照組(P<0.05)，S期細胞所占比例明顯高于對照組，G2/M差異無統(tǒng)計學意義。同時從圖中可以看出，當柚皮素濃度為6.25、100μmol/L時對細胞周期無明顯影響。

圖2 柚皮素對ADSC細胞周期的影響Fig.2 Effect of naringenin on cell cycle of ADSC*P<0.05；不同濃度均含2個重復樣品

2.3 柚皮素對P16ink4a的表達水平的影響

P16ink4a的表達對細胞周期具有一定的影響，因此進一步通過Western印跡法對P16ink4a蛋白在細胞中的表達情況進行了檢測。實驗結果表明濃度當濃度為25μmol/L時的柚皮素干預24h后，與對照組相比P16ink4a的蛋白明顯下調(P<0.05)，見圖3。

圖3 柚皮素干預后P16ink4a的蛋白表達水平的變化Fig.3 Changes of the P16ink4a expression of ADSC following exposure to naringenin*P<0.05

2.4 柚皮素對細胞衰老的影響

通過β-半乳糖苷酶染色檢測柚皮素對細胞衰老情況的影響。選取衰老代次細胞(p16代)并用柚皮素處理細胞24h后觀察細胞衰老的結果。β-半乳糖苷酶染色實驗結果如圖4所示，實驗組衰老的細胞明顯少于對照組在正常情況下衰老的細胞，3次染色統(tǒng)計結果對照組與實驗組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，該結果進一步表明柚皮素能夠促進hADSC增殖而抑制其衰老。

圖4 柚皮素對衰老細胞的影響Fig.4 Effect of naringenin on the aging of ADSC**P<0.01

2.5 柚皮素對細胞內活性氧含量的影響

氧化應激對細胞的增殖具有重要的影響，其中細胞內ROS含量的變化是一個非常重要的檢測指標。柚皮素干預24h后，ADSC細胞內ROS含量受到了影響，與對照組相比當柚皮素濃度為25μmol/L 時抑制了細胞內ROS含量的增加(下降到70%，P<0.01)。

2.6 mRNA測序結果分析

根據(jù)2.1～2.5實驗結果，對柚皮素干預后的ADSC進行了mRNA測序。當柚皮素濃度為25μmol/L 時處理ADSC后與對照組相比較有933個差異表達的基因，其中表達上調的基因有288個，表達下調的基因有645個。KEGG信號通路富集分析結果如圖5A所示，結果顯示核苷酸結合寡聚結構域樣受體信號通路、吞噬小體、蛋白多糖及礦物吸收受到明顯的調控。其中結瘤樣受體信號通路對細胞增殖具有一定的調控作用[17-18]，基因集富集分析結果如圖5B所示，基因集標準富集得分NES值為2.37(P=0.003)，基因集成員顯著聚集在頂部，表明柚皮素處理對該信號通路中基因基因富集情況有明顯影響；并對受該信號通路調控的基因通過熱圖進行了差異表達分析，結果如圖5C所示，當柚皮素濃度為25μmol/L時處理ADSC后與對照組相比較，DPP4、STAT1、SFRP4、SOD2的表達量被上調了，其中SOD2的表達上調受到ROS含量降低的調控[19-20]，因此SOD2上調與2.5實驗結果相一致。

圖5 mRNA測序結果分析Fig.5 Analysis of RNA-seq resultA：信號通路富集氣泡圖；B：基因集富集圖；C：差異基因表達熱圖

3 討 論

本研究通過檢測不同濃度的柚皮素對體外培養(yǎng)的ADSC干預24h(P<0.01)和48h(P<0.05)后在濃度為25μmol/L時均能夠明顯促進ADSC增殖，而在低濃度6.25μmol/L時對細胞的增殖無明顯影響，在高濃度100μmol/L時對細胞的增殖具有明顯抑制作用。同時可以發(fā)現(xiàn)干預24h的增殖速率高于 48h，這一趨勢與相關研究中提出的隨著柚皮素干預時間的增加，相對應地，對細胞的作用效果逐漸減弱[21]的規(guī)律相一致，與此同時也可能與細胞對柚皮素的吸收效率[22]及對細胞的最佳作用時間[23]有密切聯(lián)系。

接下來探究了不同濃度柚皮素對細胞周期的影響，結果表明柚皮素對ADSC細胞周期有一定的影響，當柚皮素濃度為25μmol/L時能夠促進細胞周期快速從G0/G1期快速進入S期(P<0.05)，即顯著促進細胞進入增殖期使細胞快速增殖。癌基因P16ink4a與hADSC的增殖密切相關，阻斷P16ink4a基因的表達有助于改善生理性衰老對干細胞功能的抑制，P16ink4a基因在細胞中的表達情況在一定程度上能夠反映出ADSC是否存在增殖停滯或增殖緩慢[24]。因此，在接下來的實驗中對P16ink4a蛋白表達情況進行了檢測，檢測結果表明，與對照組相比柚皮素干預后P16ink4a蛋白表達量明顯下調(P<0.05)。P16ink4a蛋白的表達情況與細胞的衰老狀況緊密相關[25-26]，因此對柚皮素干預后細胞的衰老狀況進行了檢測，實驗結果表明柚皮素對ADSC的衰老具有明顯的抑制作用(P<0.01)，這也進一步證明柚皮素對ADSC的增殖有一定的促進作用。同時有研究表明抑制細胞衰老對細胞增殖具有一定的促進作用[27]，其重要原因表現(xiàn)在細胞衰老是由于細胞周期阻滯使細胞增殖速度變慢[28]、P16ink4a基因的高表達等因素促進了細胞的衰老使細胞增殖活性降低[29]。因此，該實驗結果對細胞衰老與細胞增殖之間的關系進行了驗證。

另外，氧化應激對細胞的增殖也具有十分重要的調節(jié)作用，過度的氧化應激對ADSC的增殖具有明顯抑制作用[30]，ROS含量升高則會引起細胞功能障礙，導致細胞衰老[31]。進一步對細胞內ROS水平進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，柚皮素干預后細胞內ROS水平明顯降低(P<0.05)，即柚皮素能夠降低氧化應激對細胞帶來的損傷。

以上實驗結果表明柚皮素通過促進細胞周期從G0/G1期進入S期、下調P16ink4a基因的表達、抑制β-半乳糖苷酶含量的升高及下調細胞內ROS含量促進了ADSC的增殖。mRNA測序結果表明柚皮素干預ADSC后核苷酸結合寡聚結構域樣受體信號通路受到明顯的調控，相關研究表明該信號通路對細胞的增殖具有一定的調控作用[32-33]。并且進一步發(fā)現(xiàn)該信號通路能夠激活SOD2基因表達，SOD2的表達受ROS的調控，ROS含量降低能夠激活SOD2表達[34-35]。因此與前面結果中柚皮素能夠促進ROS水平降低的結果相一致。測序結果表明，柚皮素能夠通過激活核苷酸結合寡聚結構域樣受體信號通路上調SOD2基因的表達，從而促進ADSC的增殖。

干細胞因其具有自我更新速度快、能夠穩(wěn)定增殖、具有多向分化潛能的特點，已被廣泛應用于多種退行性疾病治療的研究當中。尤其是ADSC在干細胞治療領域具有極為廣泛的研究，例如對脊髓損傷[36]、腦中卒[37]等疾病具有較為明顯的治療效果，另外，與其他來源的間充質干細胞相比較，ADSC來源較為廣泛且取材比較容易[38]，自體來源可避免發(fā)生免疫排斥，因此可作為臨床上較為理想的干細胞治療的細胞來源。但是，近年來研究發(fā)現(xiàn)ADSC在體外傳代培養(yǎng)的過程中隨著傳代次數(shù)增加細胞有衰老的傾向[39]，同時在體內也會隨著個體的衰老出現(xiàn)功能的衰退[40]，因此維持細胞干性功能的研究具有非常重要的意義[41]。

近年來，關于天然小分子化合物生物活性的研究越來越廣泛，其中柚皮素作為一種研究較為廣泛的小分子化合物，研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤[42]、心臟保護[43]、抗氧化[44]、抗炎[45]等多種生物活性成分。另一方面，ADSC作為一種有潛力的間充質干細胞，具有廣泛的應用前景，因此促進它在體外增殖速度，增強其增殖能力，將在ADSC的臨床干細胞治療方面提供一定的應用基礎。