嚴(yán)少杰

（廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510006）

菜心（Brassica campestrisL.ssp.chinensisvar.utilisTsen et Lee）有“蔬菜之冠”的美譽(yù)[1]，是華南地區(qū)的標(biāo)志性蔬菜，栽培歷史超過百年；菜心風(fēng)味獨(dú)特，營養(yǎng)價(jià)值高，深受消費(fèi)者喜愛。培育出高產(chǎn)且優(yōu)質(zhì)的菜心品種，是菜心育種工作者的重要目標(biāo)?，F(xiàn)階段菜心育種仍以系統(tǒng)選育和雜交選育為主[2]。目前，利用這些傳統(tǒng)育種方法選育出了一些菜心品種[3-5]，但育種周期長、效率低[6]。因此，需要開發(fā)更加優(yōu)質(zhì)的育種手段來加快菜心高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種的選育。近年來，分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)為菜心優(yōu)良品種的選育提供了便利，不僅可以加快育種進(jìn)程，而且可以定向地優(yōu)化目標(biāo)性狀。

分子標(biāo)記輔助育種涉及構(gòu)建家系群體的連鎖分析和構(gòu)建自然群體的關(guān)聯(lián)分析兩種分析方法。其中，關(guān)聯(lián)分析無需構(gòu)建作圖群體，與連鎖分析的數(shù)量性狀基因座（quantitative trait locus，QTL）定位相比，在一定程度上縮短了育種周期；關(guān)聯(lián)分析利用的是自然群體材料，可檢測(cè)同一座位上的多個(gè)等位基因，具有遺傳背景豐富及分辨率高的優(yōu)勢(shì)。因此，相比QTL 定位，關(guān)聯(lián)分析具有更大的潛力發(fā)現(xiàn)復(fù)雜性狀所涉及的多基因及它們之間的相互關(guān)系[7]。關(guān)聯(lián)分析在植物研究中起步較晚，目前，利用該方法已經(jīng)在水稻[8]、棉花[9]、煙草[10]等植物育種中取得了顯著成績。但該方法在菜心上的應(yīng)用較少，目前僅見夏巖石等[11]利用SSR 標(biāo)記對(duì)菜心品質(zhì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，尚未見利用關(guān)聯(lián)分析對(duì)菜心經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行研究的報(bào)道。鑒于此，本研究以148 份菜心種質(zhì)的自然群體為研究材料，并測(cè)量其株高、株質(zhì)量、薹高、薹質(zhì)量和薹粗5 個(gè)經(jīng)濟(jì)性狀，然后結(jié)合SSR 標(biāo)記的群體基因分型結(jié)果，開展關(guān)聯(lián)分析，探測(cè)與這些經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的優(yōu)異變異位點(diǎn)，并篩選典型載體材料，為菜心分子標(biāo)記輔助育種提供一定的技術(shù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的148 份菜心種質(zhì)材料，由廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院（107 份）和廣州大學(xué)作物抗逆境中心（41 份）提供，材料的編號(hào)、名稱和熟性等信息詳見表1。

表1 菜心種質(zhì)材料的信息Table 1 Information of B. campestris materials

續(xù)表1

續(xù)表1

1.2 試劑與設(shè)備

DNA 提取所用試劑1%β-巰基乙醇、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）提取液、氯仿、異戊醇、70%乙醇、6 μL 10 mg/mL 的RNase A）、PCR 反應(yīng)試劑（10×PCR Buffer、TaqDNA 聚合酶）以及電泳所用試劑（10×TBE 緩沖液、瓊脂粉、聚丙烯酰胺粉），均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

電泳槽及電泳儀，MGV-216-33 雙面三倍寬垂直電泳槽及電泳儀，美國CBS 公司；微孔板分光光度計(jì)，Nano DropTM分光光度計(jì)，Thermo ScientificTM；BenQ M 800 掃描儀，明基BenQ；EDC-810 基因擴(kuò)增儀，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；卷尺、游標(biāo)卡尺、電子秤等。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及重要農(nóng)藝性狀的調(diào)查

148 份菜心種質(zhì)材料于2018 年7 月10 日和10 月24 日分別在寧夏銀川市園藝產(chǎn)業(yè)園和廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院南沙試驗(yàn)基地播種及種植，種質(zhì)種植區(qū)域均長2 m、寬1 m，常規(guī)水肥管理。待菜心長至“齊口花”時(shí)期，每份材料隨機(jī)選取3 株，測(cè)定其株高、株質(zhì)量、薹高、薹質(zhì)量及薹粗5 個(gè)重要農(nóng)藝性狀。

株高（PH，cm）：用卷尺在采收期測(cè)定地面到植株頂部的高度。

株質(zhì)量（PW，g）：用電子秤在采收期測(cè)定植株去除根部的質(zhì)量。

薹高（SH，cm）：用卷尺在采收期測(cè)定菜薹到植株頂部的高度。

薹質(zhì)量（SW，g）：用電子秤在采收期測(cè)定薹部以上的質(zhì)量。

薹粗（SD，cm）：用游標(biāo)卡尺在采收期測(cè)定菜心薹徑基部的寬度。

1.4 基因分型

采用李榮華等[12]改進(jìn)的CTAB 法提取菜心材料的DNA，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 質(zhì)量、使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 濃度，并將所提取的DNA 稀釋至30 ng/μL，作為PCR 擴(kuò)增模板。

用于本研究的147 對(duì)SSR 引物中，41 對(duì)CX 系列是根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室菜心轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)的SSR 引物[13]；106 對(duì)SLAF 系列是根據(jù)“3T6”和“四九-19 號(hào)菜心”基因組survey 測(cè)序數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)的SSR 引物[14]。

PCR 反應(yīng)體系總體積為10 μL，其中包含30 ng/μL的DNA 模板2 μL，10×PCR Buffer 1 μL，10 μmol/L的正反向引物各0.2 μL，10 mmol/L dNTPs 0.3 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.1 μL，dd H2O 6.4 μL。

PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min，之后按94 ℃變性45 s、55 ℃45 s 和72 ℃延伸1 min 運(yùn)行35 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃充分延伸10 min，之后置于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，按照郭培國等[15]改良的銀染技術(shù)顯色，使用BenQ M 800 掃描儀掃描保存銀染圖片。

利用GelBuddy 軟件對(duì)銀染圖片進(jìn)行曝光度及圖片角度等調(diào)整，使變異位點(diǎn)帶更加直觀，并對(duì)變異位點(diǎn)帶進(jìn)行判讀，按1（有條帶）、0（無條帶）和2（數(shù)據(jù)缺失）統(tǒng)計(jì)各材料的基因分型數(shù)據(jù)。

1.5 農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用SPSS 17.0 軟件，分析計(jì)算農(nóng)藝性狀的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、變異系數(shù)。依據(jù)環(huán)境方差和遺傳方差計(jì)算廣義遺傳率（H2）[16]，計(jì)算公式見式（1）。

1.6 SSR 標(biāo)記的多態(tài)性信息量和種質(zhì)材料的親緣關(guān)系計(jì)算

根據(jù)各標(biāo)記的基因分型數(shù)據(jù)，利用PIC-Calc0.6 軟件，計(jì)算各標(biāo)記的多態(tài)性信息量（polymorphism information content，PIC），計(jì)算每個(gè)標(biāo)記的PIC 平均值[16]；利用SPAGeDi1.3d，并將其中所有負(fù)值設(shè)為0，計(jì)算各材料間的親緣關(guān)系系數(shù)（K）[17]。

1.7 連鎖不平衡及群體結(jié)構(gòu)分析

用TASSEL 3.0 軟件連鎖不平衡分析功能，分析計(jì)算各種質(zhì)材料對(duì)應(yīng)的標(biāo)記變異數(shù)據(jù)，得出標(biāo)記的連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）信息[18]，以D'（strandarized disequilibrium coefficients）衡量兩兩位點(diǎn)間的連鎖不平衡關(guān)系。利用Sructure2.3 軟件對(duì)菜心材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析[16]，K取值1～10，將MCMC（markov chain monte carlo）的不作數(shù)迭代（length of burn-in period）設(shè)為100 000 次，每個(gè)K值進(jìn)行10 次計(jì)算。根據(jù)似然值最大原則選取最合理的K值，繪制菜心群體遺傳結(jié)構(gòu)圖，并獲得關(guān)聯(lián)分析校正協(xié)變量（Q值）[19]。

1.8 關(guān)聯(lián)分析及發(fā)掘優(yōu)異等位變異

應(yīng)用TASSEL 3.0 軟件的混合線性模型（mixed linear model，MLM）程序，以群體結(jié)構(gòu)（Q）矩陣為協(xié)變量、親緣關(guān)系系數(shù)（K）為協(xié)變量，將農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)和標(biāo)記變異數(shù)據(jù)進(jìn)行MLM（Q+K）回歸分析[17,20]。發(fā)現(xiàn)與菜心農(nóng)藝性狀密切關(guān)聯(lián)的SSR 標(biāo)記，并計(jì)算出標(biāo)記位點(diǎn)對(duì)表型變異的解釋率（R2）；閾值選擇以P＜0.05 為顯著水平，P＜0.01 為極顯著水平。以獲得關(guān)聯(lián)位點(diǎn)為基礎(chǔ)，參考王娟等[21]的方法，計(jì)算與表型性狀顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的表型效應(yīng)值，得到與表型性狀顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)等位變異、表型效應(yīng)及典型品種。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜心農(nóng)藝性狀的變異情況及性狀間相關(guān)性測(cè)定

2018 年在銀川和南沙種植的種質(zhì)材料5 個(gè)重要農(nóng)藝性狀的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見表2。由表2 中可知，菜心種質(zhì)各材料的性狀差異明顯，變異范圍較廣。變異分析數(shù)據(jù)表明，在兩地分別測(cè)定的5 個(gè)性狀存在廣泛的變異，5 個(gè)性狀的平均變異系數(shù)為45.5%，變異范圍為19.9%～73.9%；其中，南沙測(cè)定的薹質(zhì)量變異幅度最大，達(dá)73.9%；銀川測(cè)定的薹粗變異幅度最小，為19.9%；薹粗變異系數(shù)小于30%，低于其他性狀的變異幅度。5 個(gè)性狀的平均廣義遺傳率為44.4%，其中株高和薹高的廣義遺傳率超過50%，其余性狀的廣義遺傳率低于30%，表明相比于其他性狀，株高和薹高性狀受環(huán)境影響較小。

表2 菜心材料農(nóng)藝性狀變異統(tǒng)計(jì)Table 2 Variation of agronomic traits of B. campestris accessions

2.2 菜心SSR 位點(diǎn)遺傳多樣性評(píng)價(jià)

利用200 對(duì)SSR 引物擴(kuò)增菜心種質(zhì)DNA，發(fā)現(xiàn)147對(duì)SSR 引物多態(tài)性良好，條帶清晰且重復(fù)性好。利用147對(duì)SSR 引物共檢測(cè)到252 個(gè)等位變異位點(diǎn)，平均每個(gè)SSR 標(biāo)記存在1.71 個(gè)等位變異（見表3），標(biāo)記的多態(tài)性信息含量（PIC）為0.052 6～0.522 2，平均值為0.379 3。

表3 147 對(duì)SSR 標(biāo)記多樣性統(tǒng)計(jì)Table 3 Diversity statistics of 147 SSR markers

續(xù)表3

2.3 SSR 位點(diǎn)間的連鎖不平衡分析

菜心基因組的SSR 位點(diǎn)間的連鎖不平衡分析結(jié)果見表4（見第41 頁）。在252 個(gè)位點(diǎn)的31 626 種組合中，進(jìn)行顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＜0.01 分析時(shí)，觀察到連鎖不平衡組合654 種，所占比例為2.1%。在0.2＜D'≤0.4 的連鎖不平衡位點(diǎn)組合最多，為300 種。

表4 SSR 位點(diǎn)間的連鎖不平衡分析Table 4 Analysis of D' of LD for SSR loci

2.4 群體結(jié)構(gòu)及親緣關(guān)系分析結(jié)果

運(yùn)用Structure 2.3 軟件對(duì)148 份菜心材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，隨著預(yù)測(cè)類群數(shù)K值的增加，LnP(D)持續(xù)增加且未出現(xiàn)明顯的拐點(diǎn)（圖1A）。以ΔK的最大值來確定K值的方法，經(jīng)計(jì)算K=2 時(shí)，ΔK出現(xiàn)最大值和拐點(diǎn)（圖1B），表明該群體最佳類群數(shù)為2。根據(jù)K=2 時(shí)構(gòu)建的群體結(jié)構(gòu)（見圖2），148 份材料中類群I 有83 份，包括60份早熟材料和23 份中熟材料；其余的65 份材料在類群Ⅱ中，包括29 份早熟、30 份中熟和6 份晚熟材料?；跈z測(cè)到的252 個(gè)變異位點(diǎn)，利用SPAGeDi1.3d 軟件計(jì)算出148 份菜心種質(zhì)材料的兩兩組合為10 878，親緣關(guān)系系數(shù)小于0.05 的組合占到總組合的70.22%，親緣關(guān)系系數(shù)為0 的組合占到總組合的52.99%。

圖1 K 值與lnP(D)、ΔK 值折線圖Fig.1 Line chart of K with lnP(D) and ΔK

圖2 148 份菜心材料群體結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Population structure of 148 B. campestris accessions

2.5 農(nóng)藝性狀間與SSR 標(biāo)記的關(guān)聯(lián)

采用MLM（Q+K）模型，對(duì)SSR 標(biāo)記和菜心性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，分析結(jié)果見表5。

由表5 可知，MLM（Q+K）模型中，在銀川發(fā)現(xiàn)有9 個(gè)位點(diǎn)分別與株高（CX120-280）、薹高（CX140-185）、薹粗（SLAF277-230、SLAF283-280、SLAF308-320、SLAF309-240 及SLAF344 -285）、薹質(zhì)量（SLAF277 -230 和SLAF308-320）在P＜0.01 水平上極顯著關(guān)聯(lián)，其中兩個(gè)位點(diǎn)為增效表型效應(yīng)，其余位點(diǎn)為減效表型效應(yīng)；在南沙發(fā)現(xiàn)的6 個(gè)位點(diǎn)分別與薹粗（SLAF283-280、SLAF308-320、SLAF309-240 及SLAF344-285）、薹質(zhì)量（SLAF277-230 和SLAF308-320）在P＜0.01 水平上極顯著關(guān)聯(lián)，所有位點(diǎn)均為減效表型效應(yīng)。

表5 與性狀極顯著相關(guān)（P＜0.01）的SSR 標(biāo)記位點(diǎn)及其對(duì)表型變異的解釋率Table 5 The SSR locus associated with traits and their explained phenotypic variations (P＜0.01)

兩地菜心品種的變異位點(diǎn)與性狀關(guān)聯(lián)結(jié)果表明：位點(diǎn)對(duì)表型變異的兩地解釋率在銀川為6.91%～9.6%，在南沙為8.31%～24.91%。銀川和南沙兩地在P＜0.01 水平上有相同的位點(diǎn)與性狀顯著關(guān)聯(lián)，它們是薹粗與SLAF283-280、SLAF308-320、SLAF309-240 及SLAF344-285，薹質(zhì)量與SLAF277-230 和SLAF308-320，其中位點(diǎn)SLAF308-320 在銀川和南沙兩地均檢測(cè)到與薹粗和薹質(zhì)量兩個(gè)性狀在P＜0.01 水平上極顯著關(guān)聯(lián)。

以位點(diǎn)顯著相關(guān)的性狀為依據(jù)，篩選出18 個(gè)典型材料，其中有5 個(gè)早熟品種，12 個(gè)中熟品種和1 個(gè)晚熟品種。

3 討論

群體結(jié)構(gòu)的存在影響等位變異位點(diǎn)連鎖不平衡，導(dǎo)致關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果不準(zhǔn)確。混合組群中群體結(jié)構(gòu)的存在會(huì)增加等位變異位點(diǎn)的LD 值，影響關(guān)聯(lián)分析的分率，可能導(dǎo)致性狀與變異位點(diǎn)的假關(guān)聯(lián)結(jié)果增加[22]。群體結(jié)構(gòu)分析得到的協(xié)變量Q值可用于進(jìn)行群體矯正，避免性狀與標(biāo)記間的假關(guān)聯(lián)[19]。本研究利用252 個(gè)變異位點(diǎn)對(duì)供試菜心種質(zhì)材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，經(jīng)計(jì)算K=2 時(shí)，ΔK出現(xiàn)最大值和拐點(diǎn)以及LnP(D)未出現(xiàn)明顯拐點(diǎn)，將148份菜心群體分為兩個(gè)組群。早熟及中熟品種分到兩個(gè)不同類群，而晚熟品種均分到類群II。從早、中、晚熟品種的分類群的情況來看，組群與菜心熟性有一定的相關(guān)性。群體結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果顯示，所選菜心材料群體結(jié)構(gòu)簡單，來源比較單一?？赡苁且?yàn)椴诵钠鹪从谌A南地區(qū)，是白菜的一個(gè)變種，且菜心育種上多采用系統(tǒng)方法，部分良好的菜心品種多用于雜交選育，從而導(dǎo)致菜心遺傳背景狹窄[6]。

植物的重要性狀多為數(shù)量性狀[23]，性狀的最終表達(dá)由基因和環(huán)境相互影響。關(guān)聯(lián)分析是以基因或標(biāo)記間存在連鎖不平衡為基礎(chǔ)，通過軟件分析檢測(cè)遺傳標(biāo)記與目標(biāo)自然群體性狀相關(guān)性的分析方法[19]。與連鎖分析相比，關(guān)聯(lián)分析以自然群體作為材料進(jìn)行研究，節(jié)省了構(gòu)建群體的時(shí)間，且關(guān)聯(lián)作圖的精度高[23]，可在較短時(shí)間獲悉標(biāo)記與性狀間的關(guān)系。本試驗(yàn)將菜心材料分別種植于南沙和銀川兩地，對(duì)菜心的5 個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行測(cè)量，隨后對(duì)兩地表型數(shù)據(jù)與發(fā)現(xiàn)的SSR 位點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。對(duì)所選的5 個(gè)性狀進(jìn)行變異分析，結(jié)果顯示，5 個(gè)性狀的平均變異系數(shù)為45.5%，在南沙采集到的菜心樣品變異系數(shù)較大，與早熟菜心在秋季測(cè)得的薹質(zhì)量變異較大的研究結(jié)果一致[24]，供試菜心品種間的遺傳差異較大。采用MLM（Q+K）模型對(duì)標(biāo)記和作物性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，對(duì)菜心表型性狀和252 個(gè)SSR 標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)了6個(gè)位點(diǎn)在銀川和南沙兩地均檢測(cè)到與相同性狀在P＜0.01水平上顯著關(guān)聯(lián)。其中標(biāo)記SLAF308-320 與薹粗及薹質(zhì)量兩個(gè)性狀顯著關(guān)聯(lián)，與在野生大豆[25]、海島棉[26]及玉米[27]上發(fā)現(xiàn)的SSR 標(biāo)記同時(shí)與2 個(gè)或以上性狀相關(guān)聯(lián)的情況類似，提示菜心性狀間可能存在的遺傳相關(guān)或基因多效性即一因多效的遺傳基礎(chǔ)。MLM（Q+K）模型的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，這6 個(gè)位點(diǎn)可能是不受環(huán)境影響的穩(wěn)定標(biāo)記，有報(bào)道稱MLM（Q+K）可以有效抑制加關(guān)聯(lián)的產(chǎn)生，是群體關(guān)聯(lián)分析最佳模型[28]。

自Thornsberry 等[29]首次在植物上運(yùn)用關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)dwarf 8 基因上的幾個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與玉米開花期的變異顯著關(guān)聯(lián)，隨后關(guān)聯(lián)分析被廣泛用于探究與植物性狀和標(biāo)記間的關(guān)系。在菜心群體遺傳研究中，有學(xué)者通過標(biāo)記開展了對(duì)菜心分子遺傳的探究[11,30]。而在其他作物如水稻[31]、小麥[32]等上，已經(jīng)運(yùn)用分子標(biāo)記輔助選擇對(duì)作物育種進(jìn)行篩選培育，加速了新品種的培育進(jìn)程。分子標(biāo)記輔助選擇育種的首要前提是有與作物性狀相關(guān)的候選標(biāo)記，而關(guān)聯(lián)分析是快速發(fā)掘候選標(biāo)記的有力手段。本研究以分別種植在寧夏銀川與廣州南沙兩個(gè)不同環(huán)境的148 份菜心種質(zhì)材料為試驗(yàn)材料，獲得性狀數(shù)據(jù)用于開展SSR 標(biāo)記與性狀的關(guān)聯(lián)分析，以MLM（Q+K）為模型關(guān)聯(lián)分析中發(fā)現(xiàn)了兩地表型性狀數(shù)據(jù)中，薹粗、薹質(zhì)量檢測(cè)到相同的標(biāo)記與這些性狀存在一定的相關(guān)關(guān)系，這些標(biāo)記可以為菜心的分子輔助選擇育種提供參考。