阿衣吐遜·阿布都外力 帕爾哈提·柔孜高彥華努爾依力·努爾麥麥提阿布力米提·伊力?
(1.中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所,新疆特有藥用資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆烏魯木齊 830011;2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052;3.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049)
西伯利亞白刺N(yùn)itraria sibiricaPall.是蒺藜科白刺屬植物,分布于各大洲及我國西北地區(qū)[1],是一種藥食同源的野生植物,其種子、葉、果實(shí)均可入藥[2]。白刺果性溫、味甘、微酸,有健脾胃、助消化等藥用價(jià)值,用于治療高血壓、腸胃炎等[3],現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明白刺具有降血壓、抗氧化、抗疲勞等功效[4-6]。國內(nèi)外對(duì)唐古特白刺化學(xué)成分的研究較多,而有關(guān)西伯利亞白刺的報(bào)道較少,主要集中于籽的油脂[7],莖、葉中色素,生物堿,黃酮及酚類等化合物[8-10]。據(jù)報(bào)道,唐古特白刺油脂含有大量的不飽和脂肪酸[11],而西伯利亞白刺作為同屬植物,可能含有類似的化學(xué)成分。本研究以西伯利亞白刺果實(shí)為原料,通過不同方法提取其油脂,經(jīng)甲酯化及氣質(zhì)聯(lián)用色譜分析脂肪酸組成,并通過紅外光譜進(jìn)行表征,并通過測(cè)定清除自由基能力檢測(cè)抗氧化活性,以期為該資源的充分利用提供參考。
1.1 藥材與試劑 西伯利亞白刺在2017 年采集于新疆和田,經(jīng)中國科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所馮纓研究員鑒定為西伯利亞白刺N(yùn)itraria sibiricaPall.,保存在中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所新疆特有藥用資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,標(biāo)本號(hào)NS20170915。
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)購于上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司;2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)購于北京索萊寶生物科技有限公司;石油醚、甲苯、氫氧化鉀、無水硫酸鈉、乙醇等均為國產(chǎn)分析純。
1.2 儀器 YP-20002 型電子天平(余姚市金諾天平儀器廠);DFY-500 搖擺式高速萬能粉碎機(jī)(溫嶺林大機(jī)械公司);HH2 數(shù)顯恒溫水浴鍋(鄭州華峰儀器有限公司);JY-400D 型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(上海比朗儀器有限公司);F-305 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi 公司);7890A-5975C 氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀(美國Agilent 公司);NICOLET 6700 紅外光譜儀(美國Thermo 公司);Spectra Max M5-酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices 公司)。
1.3 方法
1.3.1 果油提取 將西伯利亞白刺自然風(fēng)干后進(jìn)行粉碎、過篩,稱取約50 g 粉末,按料液比1∶8加入石油醚(60~90 ℃),分別進(jìn)行3 種提取。傳統(tǒng)提取為粉末置于廣口瓶中,機(jī)械攪拌提取2 h,共3 次,合并提取液、抽濾、減壓回收石油醚,得到白刺果油,備用;索氏提取為將粉末置于索氏提取器中,圓底燒瓶中加入石油醚,于80 ℃回流提取8 h,稍微放涼之后進(jìn)行抽濾,減壓回收石油醚,得到白刺果油,備用[12];超聲波輔助提取為粉末置于廣口瓶中置于水浴鍋加熱至50 ℃,轉(zhuǎn)移至超聲波提取儀,超聲功率200 W,超聲40 min 進(jìn)行提取;抽濾,減壓回收石油醚,得到白刺果油,備用[13],出油率公式(1)計(jì)算。
1.3.2 脂肪酸含量測(cè)定
1.3.2.1 甲酯化分析 稱取3 種方法制備的白刺果油各0.1 g,經(jīng)文獻(xiàn)[14]報(bào)道的方法處理后,取1 mL 溶液進(jìn)行GC-MS 分析。
1.3.2.2 色譜條件 Superco 石英彈性毛細(xì)管柱(100 m×0.25 mm,0.25 μm);程序升溫(起始溫度140 ℃,保持5 min,以4 ℃/min 升溫至200 ℃,保持1 min,再以3 ℃/min 升溫至220 ℃,保持30 min);載氣純氦氣(99.999%);體積流量1.0 mL/min;進(jìn)樣口溫度260 ℃;進(jìn)樣量1 μL;分流比50∶ 1;電離方式EI;電離能量70 eV;離子源發(fā)生器溫度230 ℃;質(zhì)量掃描范圍m/z40~500,全離子掃描。
1.3.3 紅外光譜分析 取3 種方法制備的白刺果油,在4 000~500 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)測(cè)定紅外吸收光譜,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行特征峰歸屬,并確定官能團(tuán)。
1.3.4 抗氧化活性研究
1.3.4.1 DPPH 自由基清除能力 取3 種方法制備的白刺果油,溶解于無水乙醇中,配制成10 mg/mL母液,并稀釋成不同質(zhì)量濃度,各取100 μL,加入100 μL 新配制的DPPH-甲醇溶液(0.2 mmol/L)于96 孔板中,混勻,室溫下避光反應(yīng)30 min,二丁基羥基甲苯(BHT)作為陽性對(duì)照品,于517 nm 波長處測(cè)定吸光度[15]。DPPH 自由基清除能力按公式(2)計(jì)算:
式中,Ai、Aj、A0分別為樣品組、對(duì)照組、空白組在517 nm 處的吸光度。
1.3.4.2 ABTS 自由基清除能力 取3 種方法制備的白刺果油,溶于無水乙醇中,配制成10 mg/mL母液,并稀釋成不同質(zhì)量濃度,各取20 μL,加入180 μL 新配制的ABTS 自由基溶液于96 孔板中,混勻,室溫下反應(yīng)6 min,BHT 作為陽性對(duì)照,于734 nm 波長處測(cè)定吸光度[16]。ABTS 自由基清除能力按公式(3)計(jì)算:
式中,Ai、A0分別為樣品組、空白組在734 nm 處的吸光度。
2.1 出油率及脂肪酸含量 超聲輔助提取法得油率為(7.05±0.11)%,高于傳統(tǒng)提取法(5.24±0.23)% 和索氏提取法(5.73 ± 0.45)%(P<0.05),表明在提取程度相同的情況下,超聲波輔助提取法提取效果優(yōu)于其余2 種方法。超聲波在液體內(nèi)傳播時(shí)產(chǎn)生空化作用,形成高溫高壓的環(huán)境,從而加強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)的傳質(zhì)作用,提高植物中化合物的提取速度[17],同時(shí)超聲輔助提取法具有環(huán)保、所需時(shí)間短、能耗小、效率更高等優(yōu)勢(shì),因此提取時(shí)間短,出油率高。在超臨界CO2萃取條件下,西伯利亞白刺籽油脂出油率為4.71%[7];唐古特白刺果分別經(jīng)微波輔助、超聲-微波輔助提取后,出油率分別5.45%、5.71%[18-19];西伯利亞白刺經(jīng)超聲輔助法提取后,出油率更高;另外,3 種油脂的色澤均為棕黃色。見表1。
表1 不同提取方法西伯利亞白刺果油中脂肪酸含量(%)Tab.1 Contents of fatty acids in oils from the fruits of N.Sibirica with different extraction methods(%)
經(jīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(NIST08)檢索,并與標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行比對(duì),確認(rèn)了西伯利亞白刺果油的脂肪酸組成,并按峰面積歸一化計(jì)算各峰面積的質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果見表1、圖1,可知不同提取方法所制備的脂肪酸組分和含量較接近,但也有一定差別。不飽和脂肪酸含量均顯著高于飽和脂肪酸,均在95% 以上,其中亞油酸含量最高,油酸次之,并且多不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于70%;3 種方法提取的油脂飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在4%以上,以棕櫚酸和硬脂酸為主;傳統(tǒng)提取、索氏提取、超聲波輔助提取所得油脂的飽和脂肪酸/不飽和脂肪酸比例分別為1/22.86、1/21.32、1/21.27。
圖1 西伯利亞白刺油脂甲酯總離子流圖Fig.1 Total ion-chromatograms of oils extracted with different methods from the fruits of N.Sibirica
研究顯示,顯示西伯利亞白刺籽和種子所含的多不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于70%[7,20],唐古特白刺果油中多不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為62.99%[18],但3 種方法提取的西伯利亞白刺果實(shí)中多不飽和脂肪酸含量均高于唐古特白刺中。作為主要多不飽和脂肪酸的亞油酸,在西伯利亞白刺果油中的占比高達(dá)73.50%。亞油酸具有抗疲勞、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)肝臟、降血脂等功效[21-24],這些作用可能是與西伯利亞白刺中多不飽和脂肪酸種類與含量有關(guān)。
2.2 西伯利亞白刺油脂紅外光譜分析 3 種方法提取制備的西伯利亞白刺油脂在4 000~500 cm-1處顯出了典型的脂肪酸吸收峰;在3 400~3 500 cm-1處有一個(gè)強(qiáng)的寬峰,表明含有OH 官能團(tuán);3 008 cm-1附近的弱吸收峰說明H-C =鍵的存在;C-H 伸縮振動(dòng)和彎曲振動(dòng)吸收峰出現(xiàn)在3 000~2 800 cm-1;在1 730 cm-1左右處有一個(gè)強(qiáng)度較弱的吸收峰,表明有C =O 存在;1 750 cm-1附近的峰歸屬于O =C 伸縮振動(dòng)吸收峰;在1 600 和1 500 cm-1處出現(xiàn)C =C 伸縮振動(dòng)峰;1 400 cm-1是C-H 鍵的面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰;1 200~1 000 cm-1范圍內(nèi)的弱吸收峰是C-O 伸縮振動(dòng)峰。3 種方法所得的油脂紅外圖譜基本一致,表明提取方法對(duì)其結(jié)構(gòu)無顯著影響[25]。見圖2。
圖2 西伯利亞白刺果油紅外光譜圖Fig.2 IR spectra of oils from the fruits of N.Sibirica
2.3 抗氧化活性 圖3 顯示,3 種油脂對(duì)2 種自由基的清除能力均顯示出劑量依賴性,當(dāng)質(zhì)量濃度為5 mg/mL 時(shí),傳統(tǒng)提取法、索氏提取法、超聲輔助提取法所得油脂的DPPH 自由基清除率分別為53.27%、48.79%、50.01%,IC50分別為5.15、7.13、5.53 mg/mL;對(duì)ABTS 自由基清除率分別為56.66%、53.53%、68.48%,IC50分別為 4.37、4.18、2.49 mg/mL。其中,傳統(tǒng)提取法所得的油脂對(duì)DPPH 自由基的清除能力最強(qiáng),超聲輔助提取法所得油脂對(duì)ABTS 自由基的清除能力最強(qiáng),而且3 種油脂清除ABTS 自由基的能力均強(qiáng)于DPPH,可能與不同的脂肪酸組成、含量、理化性質(zhì)等有關(guān)。
圖3 西伯利亞白刺果油抗氧化活性Fig.3 Antioxidant activities of oils from the fruits of N.Sibirica
研究表明,提取方法對(duì)植物油脂的抗氧化能力強(qiáng)弱有較大的影響[26-27]。超聲波輔助法提取西伯利亞白刺果油出油率為(7.05±0.11)%,顯著高于傳統(tǒng)提取法與索氏提取法,該方法所需時(shí)間短、效率高。西伯利亞白刺果油富含對(duì)人體有益的不飽和脂肪酸,含量高達(dá)95.80%,主要由亞油酸和油酸組成。紅外吸收光譜表明,不同提取方法對(duì)油脂的分子結(jié)構(gòu)無顯著影響??寡趸钚詫?shí)驗(yàn)顯示,3 種油脂均具有較強(qiáng)的清除DPPH、ABTS 自由基作用,而且清除后者的能力更明顯。后期將探討西伯利亞白刺果油理化特性、結(jié)構(gòu)屬性與生物活性之間的關(guān)系,以期提高其開發(fā)價(jià)值。