阿衣吐遜·阿布都外力 帕爾哈提·柔孜高彥華努爾依力·努爾麥麥提阿布力米提·伊力?

（1.中國(guó)科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所，新疆特有藥用資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830011；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

西伯利亞白刺N(yùn)itraria sibiricaPall.是蒺藜科白刺屬植物，分布于各大洲及我國(guó)西北地區(qū)［1］，是一種藥食同源的野生植物，其種子、葉、果實(shí)均可入藥［2］。白刺果性溫、味甘、微酸，有健脾胃、助消化等藥用價(jià)值，用于治療高血壓、腸胃炎等［3］，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明白刺具有降血壓、抗氧化、抗疲勞等功效［4-6］。國(guó)內(nèi)外對(duì)唐古特白刺化學(xué)成分的研究較多，而有關(guān)西伯利亞白刺的報(bào)道較少，主要集中于籽的油脂［7］，莖、葉中色素，生物堿，黃酮及酚類(lèi)等化合物［8-10］。據(jù)報(bào)道，唐古特白刺油脂含有大量的不飽和脂肪酸［11］，而西伯利亞白刺作為同屬植物，可能含有類(lèi)似的化學(xué)成分。本研究以西伯利亞白刺果實(shí)為原料，通過(guò)不同方法提取其油脂，經(jīng)甲酯化及氣質(zhì)聯(lián)用色譜分析脂肪酸組成，并通過(guò)紅外光譜進(jìn)行表征，并通過(guò)測(cè)定清除自由基能力檢測(cè)抗氧化活性，以期為該資源的充分利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥材與試劑 西伯利亞白刺在2017 年采集于新疆和田，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所馮纓研究員鑒定為西伯利亞白刺N(yùn)itraria sibiricaPall.，保存在中國(guó)科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所新疆特有藥用資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，標(biāo)本號(hào)NS20170915。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）購(gòu)于上海梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司；石油醚、甲苯、氫氧化鉀、無(wú)水硫酸鈉、乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器 YP-20002 型電子天平（余姚市金諾天平儀器廠）；DFY-500 搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（溫嶺林大機(jī)械公司）；HH2 數(shù)顯恒溫水浴鍋（鄭州華峰儀器有限公司）；JY-400D 型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（上海比朗儀器有限公司）；F-305 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi 公司）；7890A-5975C 氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；NICOLET 6700 紅外光譜儀（美國(guó)Thermo 公司）；Spectra Max M5-酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices 公司）。

1.3 方法

1.3.1 果油提取 將西伯利亞白刺自然風(fēng)干后進(jìn)行粉碎、過(guò)篩，稱(chēng)取約50 g 粉末，按料液比1∶8加入石油醚（60～90 ℃），分別進(jìn)行3 種提取。傳統(tǒng)提取為粉末置于廣口瓶中，機(jī)械攪拌提取2 h，共3 次，合并提取液、抽濾、減壓回收石油醚，得到白刺果油，備用；索氏提取為將粉末置于索氏提取器中，圓底燒瓶中加入石油醚，于80 ℃回流提取8 h，稍微放涼之后進(jìn)行抽濾，減壓回收石油醚，得到白刺果油，備用［12］；超聲波輔助提取為粉末置于廣口瓶中置于水浴鍋加熱至50 ℃，轉(zhuǎn)移至超聲波提取儀，超聲功率200 W，超聲40 min 進(jìn)行提??；抽濾，減壓回收石油醚，得到白刺果油，備用［13］，出油率公式（1）計(jì)算。

1.3.2 脂肪酸含量測(cè)定

1.3.2.1 甲酯化分析 稱(chēng)取3 種方法制備的白刺果油各0.1 g，經(jīng)文獻(xiàn)［14］報(bào)道的方法處理后，取1 mL 溶液進(jìn)行GC-MS 分析。

1.3.2.2 色譜條件 Superco 石英彈性毛細(xì)管柱（100 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫（起始溫度140 ℃，保持5 min，以4 ℃／min 升溫至200 ℃，保持1 min，再以3 ℃／min 升溫至220 ℃，保持30 min）；載氣純氦氣（99.999%）；體積流量1.0 mL／min；進(jìn)樣口溫度260 ℃；進(jìn)樣量1 μL；分流比50∶ 1；電離方式EI；電離能量70 eV；離子源發(fā)生器溫度230 ℃；質(zhì)量掃描范圍m／z40～500，全離子掃描。

1.3.3 紅外光譜分析 取3 種方法制備的白刺果油，在4 000～500 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)測(cè)定紅外吸收光譜，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行特征峰歸屬，并確定官能團(tuán)。

1.3.4 抗氧化活性研究

1.3.4.1 DPPH 自由基清除能力 取3 種方法制備的白刺果油，溶解于無(wú)水乙醇中，配制成10 mg／mL母液，并稀釋成不同質(zhì)量濃度，各取100 μL，加入100 μL 新配制的DPPH-甲醇溶液（0.2 mmol／L）于96 孔板中，混勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，二丁基羥基甲苯（BHT）作為陽(yáng)性對(duì)照品，于517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度［15］。DPPH 自由基清除能力按公式（2）計(jì)算：

式中，Ai、Aj、A0分別為樣品組、對(duì)照組、空白組在517 nm 處的吸光度。

1.3.4.2 ABTS 自由基清除能力 取3 種方法制備的白刺果油，溶于無(wú)水乙醇中，配制成10 mg／mL母液，并稀釋成不同質(zhì)量濃度，各取20 μL，加入180 μL 新配制的ABTS 自由基溶液于96 孔板中，混勻，室溫下反應(yīng)6 min，BHT 作為陽(yáng)性對(duì)照，于734 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度［16］。ABTS 自由基清除能力按公式（3）計(jì)算：

式中，Ai、A0分別為樣品組、空白組在734 nm 處的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 出油率及脂肪酸含量 超聲輔助提取法得油率為（7.05±0.11）%，高于傳統(tǒng)提取法（5.24±0.23）% 和索氏提取法（5.73 ± 0.45）%（P＜0.05），表明在提取程度相同的情況下，超聲波輔助提取法提取效果優(yōu)于其余2 種方法。超聲波在液體內(nèi)傳播時(shí)產(chǎn)生空化作用，形成高溫高壓的環(huán)境，從而加強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)的傳質(zhì)作用，提高植物中化合物的提取速度［17］，同時(shí)超聲輔助提取法具有環(huán)保、所需時(shí)間短、能耗小、效率更高等優(yōu)勢(shì)，因此提取時(shí)間短，出油率高。在超臨界CO2萃取條件下，西伯利亞白刺籽油脂出油率為4.71%［7］；唐古特白刺果分別經(jīng)微波輔助、超聲-微波輔助提取后，出油率分別5.45%、5.71%［18-19］；西伯利亞白刺經(jīng)超聲輔助法提取后，出油率更高；另外，3 種油脂的色澤均為棕黃色。見(jiàn)表1。

表1 不同提取方法西伯利亞白刺果油中脂肪酸含量（%）Tab.1 Contents of fatty acids in oils from the fruits of N.Sibirica with different extraction methods（%）

經(jīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)（NIST08）檢索，并與標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)了西伯利亞白刺果油的脂肪酸組成，并按峰面積歸一化計(jì)算各峰面積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)表1、圖1，可知不同提取方法所制備的脂肪酸組分和含量較接近，但也有一定差別。不飽和脂肪酸含量均顯著高于飽和脂肪酸，均在95% 以上，其中亞油酸含量最高，油酸次之，并且多不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于70%；3 種方法提取的油脂飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在4%以上，以棕櫚酸和硬脂酸為主；傳統(tǒng)提取、索氏提取、超聲波輔助提取所得油脂的飽和脂肪酸／不飽和脂肪酸比例分別為1／22.86、1／21.32、1／21.27。

圖1 西伯利亞白刺油脂甲酯總離子流圖Fig.1 Total ion-chromatograms of oils extracted with different methods from the fruits of N.Sibirica

研究顯示，顯示西伯利亞白刺籽和種子所含的多不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于70%［7，20］，唐古特白刺果油中多不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為62.99%［18］，但3 種方法提取的西伯利亞白刺果實(shí)中多不飽和脂肪酸含量均高于唐古特白刺中。作為主要多不飽和脂肪酸的亞油酸，在西伯利亞白刺果油中的占比高達(dá)73.50%。亞油酸具有抗疲勞、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)肝臟、降血脂等功效［21-24］，這些作用可能是與西伯利亞白刺中多不飽和脂肪酸種類(lèi)與含量有關(guān)。

2.2 西伯利亞白刺油脂紅外光譜分析 3 種方法提取制備的西伯利亞白刺油脂在4 000～500 cm-1處顯出了典型的脂肪酸吸收峰；在3 400～3 500 cm-1處有一個(gè)強(qiáng)的寬峰，表明含有OH 官能團(tuán)；3 008 cm-1附近的弱吸收峰說(shuō)明H-C ＝鍵的存在；C-H 伸縮振動(dòng)和彎曲振動(dòng)吸收峰出現(xiàn)在3 000～2 800 cm-1；在1 730 cm-1左右處有一個(gè)強(qiáng)度較弱的吸收峰，表明有C ＝O 存在；1 750 cm-1附近的峰歸屬于O ＝C 伸縮振動(dòng)吸收峰；在1 600 和1 500 cm-1處出現(xiàn)C ＝C 伸縮振動(dòng)峰；1 400 cm-1是C-H 鍵的面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰；1 200～1 000 cm-1范圍內(nèi)的弱吸收峰是C-O 伸縮振動(dòng)峰。3 種方法所得的油脂紅外圖譜基本一致，表明提取方法對(duì)其結(jié)構(gòu)無(wú)顯著影響［25］。見(jiàn)圖2。

圖2 西伯利亞白刺果油紅外光譜圖Fig.2 IR spectra of oils from the fruits of N.Sibirica

2.3 抗氧化活性 圖3 顯示，3 種油脂對(duì)2 種自由基的清除能力均顯示出劑量依賴(lài)性，當(dāng)質(zhì)量濃度為5 mg／mL 時(shí)，傳統(tǒng)提取法、索氏提取法、超聲輔助提取法所得油脂的DPPH 自由基清除率分別為53.27%、48.79%、50.01%，IC50分別為5.15、7.13、5.53 mg／mL；對(duì)ABTS 自由基清除率分別為56.66%、53.53%、68.48%，IC50分別為 4.37、4.18、2.49 mg／mL。其中，傳統(tǒng)提取法所得的油脂對(duì)DPPH 自由基的清除能力最強(qiáng)，超聲輔助提取法所得油脂對(duì)ABTS 自由基的清除能力最強(qiáng)，而且3 種油脂清除ABTS 自由基的能力均強(qiáng)于DPPH，可能與不同的脂肪酸組成、含量、理化性質(zhì)等有關(guān)。

圖3 西伯利亞白刺果油抗氧化活性Fig.3 Antioxidant activities of oils from the fruits of N.Sibirica

3 討論

研究表明，提取方法對(duì)植物油脂的抗氧化能力強(qiáng)弱有較大的影響［26-27］。超聲波輔助法提取西伯利亞白刺果油出油率為（7.05±0.11）%，顯著高于傳統(tǒng)提取法與索氏提取法，該方法所需時(shí)間短、效率高。西伯利亞白刺果油富含對(duì)人體有益的不飽和脂肪酸，含量高達(dá)95.80%，主要由亞油酸和油酸組成。紅外吸收光譜表明，不同提取方法對(duì)油脂的分子結(jié)構(gòu)無(wú)顯著影響。抗氧化活性實(shí)驗(yàn)顯示，3 種油脂均具有較強(qiáng)的清除DPPH、ABTS 自由基作用，而且清除后者的能力更明顯。后期將探討西伯利亞白刺果油理化特性、結(jié)構(gòu)屬性與生物活性之間的關(guān)系，以期提高其開(kāi)發(fā)價(jià)值。