孫世明，白曉云，史愛瑩，胡雪蓮，趙 甜，生 威，方國(guó)臻

（天津科技大學(xué)省部共建食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津300457）

章魚胺（Octopamine），1-（4-羥基苯基）-2-氨基乙醇，作為一種神經(jīng)遞質(zhì)[1]，對(duì)生物體的感覺行為、運(yùn)動(dòng)行為和記憶等有不同程度的影響[2-3]。對(duì)免疫系統(tǒng)也有一定的影響[4]。目前檢測(cè)章魚胺的方法包括電化學(xué)生物傳感器法、氣相色譜法、高效液相色譜法、薄層色譜法等[5]。熒光傳感器以簡(jiǎn)單、快速、低成本和高靈敏度的優(yōu)勢(shì)得到研究者的關(guān)注。上轉(zhuǎn)換熒光納米粒子（UCNPs）[6]，具有熒光強(qiáng)度穩(wěn)定，生物兼容性好，穿透性強(qiáng)，無背景輻射干擾等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。然而，上轉(zhuǎn)換納米材料缺乏有效的選擇性，樣品基質(zhì)的復(fù)雜性限制了其在分析領(lǐng)域中的應(yīng)用，因此在建立檢測(cè)方法時(shí)對(duì)上轉(zhuǎn)換納米粒子進(jìn)行靶向修飾是非常必要的。

分子印跡聚合物[9-11]（molecularly imprinted polymers，MIPs）是一種采用仿生抗原-抗體技術(shù)合成的具有高選擇性、特異性的聚合物，對(duì)模板分子具有特異性吸附。表面分子印跡溶膠-凝膠技術(shù)是一種通過溶膠-凝膠法在支撐材料表面合成分子印跡聚合物的技術(shù)[12-14]。該技術(shù)合成的分子聚合物具有選擇性高，吸附速率快和穩(wěn)定好等特點(diǎn)。本研究結(jié)合上轉(zhuǎn)換納米粒子的良好熒光性能和分子印跡聚合物的高選擇性，制備對(duì)章魚胺具有特異性吸附的熒光分子印跡聚合物，建立一種章魚胺的熒光傳感檢測(cè)方法，并用于食品中章魚胺的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑與材料 章魚胺（OA）、組胺、色胺、酪胺標(biāo)準(zhǔn)品（99.9%）；五水硝酸鉺（Er（NO3）3·5H2O）、五水硝酸鐿【Yb（NO3）3·5H2O）】、六水硝酸釔【Y（NO3）3·6H2O】標(biāo)準(zhǔn)品（99.9%），Sigma-ALdrich公司；APTES（3-氨丙基三乙氧基硅烷）、TEOS（正硅酸四乙酯），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其它試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備 熒光分光光度儀（F-2500型），日本HITACHI 公司；移液器（Eppendorf 100-1000 μL 型），德國(guó)Eppendorf 公司；磁力攪拌器（ZNCL-TS 型）、水浴磁力攪拌鍋（DF-101S 型），鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；超純水系統(tǒng)（QSPTOC 型），美國(guó)MiLLipore 公司；臺(tái)式氮吹儀（MTN-2800D 型），AUTO SCIENCE 公司；電熱真空干燥箱（ZK-35B 型），天津三水科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 上轉(zhuǎn)換熒光納米粒子的制備 采用水熱法[15-17]合成上轉(zhuǎn)換熒光納米粒子，將8 mL 乙醇，8 mL 油酸，700 mg 氫氧化鈉粉加入150 mL 圓底玻璃燒瓶中，劇烈攪拌至液體變白。逐滴加入5 mL超純水，攪拌至溶液變澄清。滴加0.101 g/mL 氟化鈉水溶液3 mL，0.5 moL/L 硝酸釔1.56 mL，0.5 moL/L 硝酸鐿400 μL，0.5 moL/L 硝酸鉺40 μL，攪拌30 min，將反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，230 ℃加熱12 h。將反應(yīng)得到白色固體沉淀離心分離，用無水乙醇洗滌3 次，60 ℃真空干燥。

1.2.2 上轉(zhuǎn)換熒光納米粒子表面包覆二氧化硅（UCNPs@SiO2）的制備 稱取50 mg UCNPs 分散在80%乙醇溶液中，加入催化劑28%氨水2 mL，逐滴滴加TEOS，攪拌8 h。滴加APTES 200 μL，持續(xù)攪拌1 h。以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心10 min，離心產(chǎn)物用去離子水和乙醇交替洗滌3 次，60 ℃真空干燥12 h[18]。

1.2.3 上轉(zhuǎn)換熒光分子印跡材料（UCNPs@SiO2@MIP）的制備 將1 mmoL 章魚胺超聲溶解到12 mL 乙醇中，常溫磁力攪拌下逐滴滴加4 mmoL APTES，攪拌15 min，加入50 mg UCNPs@SiO2，攪拌15 min，再逐滴加入6 mmoL TEOS，加入100 μL 氨水催化，攪拌15 min，通入氮?dú)?5～20 min，密封攪拌10 h。離心產(chǎn)物用乙醇和水交替超聲輔助洗脫數(shù)次，直至模板全部洗脫。真空干燥24 h，避光保存。

1.2.4 樣品前處理 稱取5.00 g 乳酪，將其攪拌均勻，加入10 mL 甲醇，渦旋振蕩2 min，超聲提取20 min，于4 ℃、8 500 r/min 離心10 min，將上清液過濾，剩余的殘?jiān)?0 mL 甲醇提取1 次，合并兩次所得上清液，在40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，然后用5 mL 甲醇復(fù)溶。

量取5 mL 黃酒，加入20 mL 正己烷去脂肪，用適量活性炭脫色，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，用5 mL甲醇復(fù)溶。

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)化的合成反應(yīng)條件

2.1.1 分子印跡聚合物合成溶劑種類 選用乙醇、乙腈、甲醇3 種溶劑為反應(yīng)溶劑，對(duì)比3 種溶劑得到的印跡聚合物和非印跡聚合物的印跡因子（IF）。如表1所示，當(dāng)乙醇為反應(yīng)溶劑時(shí)，合成的分子印跡聚合物吸附效果最好，印跡因子IF 為2.38。本研究選擇乙醇作最佳反應(yīng)溶劑。

2.1.2 分子印跡聚合物反應(yīng)時(shí)間 聚合反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短會(huì)影響印跡層的厚度，從而影響聚合物對(duì)目標(biāo)物的吸附效果和選擇性。如果反應(yīng)時(shí)間過短，聚合物就不能形成較好的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和印跡位點(diǎn)，從而影響聚合物對(duì)目標(biāo)物的吸附。如果反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)造成印跡層過厚，使上轉(zhuǎn)換材料熒光下降，進(jìn)而降低聚合物的靈敏性。由表2 可知，在反應(yīng)時(shí)間10 h 時(shí)，合成的分子印跡聚合物吸附效果最好，印跡因子IF 最大值為1.67。最終選擇最佳反應(yīng)時(shí)間為10 h。

表1 反應(yīng)溶劑種類的優(yōu)化Table 1 Optimization of reaction solvent types

表2 印跡聚合物反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化Table 2 Optimization of reaction time of imprinted polymer

2.1.3 UCNPs@SiO2添加量 UCNPs@SiO2為傳感器的載體，其用量對(duì)傳感器靈敏性有較大影響。UCNPs@SiO2添加量過多會(huì)使部分的聚合物無法接枝到UCNPs@SiO2的表面形成良好的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致分子印跡聚合物的吸附能力和選擇性下降；添加量過少，則降低材料的靈敏性。本研究保持反應(yīng)體系中其它量不變，而改變UCNPs@SiO2的添加量。由表3 可知，隨著UCNPs@SiO2量的增加，IF 呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，當(dāng)UCNPs@SiO2用量為50 mg 時(shí)，IF 最大值為2.11，吸附效果最佳。

2.1.4 模板分子與功能單體和交聯(lián)劑配比 模板分子、功能單體和交聯(lián)劑的配比直接影響聚合物的吸附效果，由表4 可知，當(dāng)三者比例為1∶4∶4 時(shí)，印跡聚合物不能形成較好的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而影響聚合物對(duì)目標(biāo)物分子的吸附；當(dāng)三者比例為1∶4∶10 時(shí)，造成印跡聚合物的印跡層過厚，從而降低上轉(zhuǎn)換材料的熒光強(qiáng)度；當(dāng)三者比例為1∶4∶6 時(shí)，印跡聚合物吸附效果最好，IF 為2.42。

表3 UCNPs@SiO2 添加量的優(yōu)化Table 3 Optimization of UCNPs@SiO2 addition

2.2 透射電鏡表征

由圖1 可知，UCNPs（A）為表面光滑的棒狀結(jié)構(gòu)，具有優(yōu)良的單分散性，平均長(zhǎng)度約2 μm。UCNPs@SiO2@MIP（B）和UCNPs@ SiO2@NIP（C）并無明顯差異，其表面均包覆一層印跡層，聚合物大小均一，形態(tài)規(guī)則，說明印跡層合成。

表4 不同配比功能單體和交聯(lián)劑的優(yōu)化Table 4 Optimization of conditions for functional monomers and cross linker with different ratios

圖1 合成材料的透射電鏡圖Fig.1 TEM image of the synthetic materials

2.3 吸附性能評(píng)價(jià)

2.3.1 動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn) 用UCNPs@SiO2@MIP 和UCNPs@SiO2@NIP 對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行吸附并繪制動(dòng)態(tài)吸附曲線，見圖2。隨著吸附時(shí)間的增加，章魚胺印跡聚合物與非印跡聚合物對(duì)章魚胺吸附量逐漸增大，當(dāng)吸附時(shí)間為2 h 時(shí)，UCNPs@SiO2@MIP 和UCNPs@SiO2@NIP 對(duì)目標(biāo)物的吸附到達(dá)平衡。非印跡聚合物的吸附效果明顯低于印跡聚合物的吸附效果。這主要是由于印跡聚合物的表面具有與目標(biāo)物化學(xué)結(jié)構(gòu)及形狀相匹配的識(shí)別位點(diǎn)，而非印跡聚合物僅存在非特異性物理吸附，因此UCNPs@SiO2@MIP 比UCNPs@SiO2@NIP 對(duì)目標(biāo)物有更高的吸附能力。

圖2 印跡聚合物及非印跡聚合物動(dòng)態(tài)吸附曲線Fig.2 Dynamic adsorption curve of imprinted polymer and non-imprinted polymer

2.3.2 靜態(tài)吸附平衡試驗(yàn) 用UCNPs@SiO2@MIP對(duì)不同濃度的章魚胺進(jìn)行吸附，記錄聚合物的熒光強(qiáng)度。

由圖3 可知，隨著章魚胺濃度的增加，熒光分子印跡聚合物的熒光強(qiáng)度也增加，當(dāng)章魚胺質(zhì)量濃度在2～10 mg/L 范圍時(shí)，分子印跡聚合物的熒光增強(qiáng)程度（F/F0）呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系。分子印跡聚合物的熒光強(qiáng)度與章魚胺濃度的線性回歸方程為Y = 0.0361X + 0.988，相關(guān)系數(shù)為0.995。當(dāng)UCNPs@SiO2@MIP 為熒光傳感器檢測(cè)章魚胺時(shí)，根據(jù)三倍信噪比計(jì)算得到的檢出限為0.37 mg/L。

圖3 UCNPs@SiO2@MIP 在不同濃度的章魚胺溶液中的熒光光譜圖Fig.3 Fluorescence emission spectra of UCNPs@SiO2@MIP with addition of the indicated concentrations of OA

2.3.3 分子印跡聚合物特異性評(píng)價(jià) 為了評(píng)價(jià)分子印跡聚合物對(duì)目標(biāo)物的選擇性，選擇組胺、色胺、酪胺作為結(jié)構(gòu)類似物，質(zhì)量濃度為8 mg/L，分別用UCNPs@SiO2@MIP 和UCNPs@SiO2@NIP 對(duì)其競(jìng)爭(zhēng)性吸附。如圖4 可知，章魚胺對(duì)UCNPs@SiO2@MIP 的熒光增強(qiáng)程度（F/F0）明顯高于其它類似物的熒光增強(qiáng)程度；而對(duì)UCNPs@SiO2@NIP 的熒光增強(qiáng)程度與其它的類似物基本相同，主要是由于UCNPs@SiO2@MIP 印跡層中存在章魚胺的識(shí)別位點(diǎn)，對(duì)章魚胺具有更好的識(shí)別能力和選擇性。

圖4 UCNPs@SiO2@MIP 和UCNPs@SiO2@NIP對(duì)OA、His、Tyr 和Try 的選擇吸附Fig.4 Selective adsorption of OA，His，Tyr and Try by UCNPs@SiO2@MIP and UCNPs@SiO2@NIP

圖5 UCNPs@SiO2@MIP 和UCNPs@SiO2@NIP對(duì)OA、His、Tyr 和Try 的競(jìng)爭(zhēng)性吸附Fig.5 Competitive adsorption of OA，His，Tyr and Try by UCNPs@SiO2@MIP and UCNPs@SiO2@NIP

為了進(jìn)一步探究UCNPs@SiO2@MIP 對(duì)模板分子章魚胺的識(shí)別能力及選擇性，將質(zhì)量濃度為8 mg/L 的章魚胺溶液，章魚胺和組胺混合溶液，章魚胺溶液和色胺混合溶液，章魚胺和酪胺混合溶液以及4 種生物胺混合溶液作為吸附溶液，分別用UCNPs@SiO2@MIP 和UCNPs@SiO2@NIP 吸附，測(cè)定吸附前、后的熒光強(qiáng)度，結(jié)果見圖5?？梢钥闯黾尤敫蓴_物，熒光強(qiáng)度并沒有發(fā)生明顯變化，說明UCNPs@SiO2@MIP 對(duì)章魚胺有較好的選擇識(shí)別性。

3 實(shí)際樣品檢測(cè)

將所建立的熒光傳感檢測(cè)方法應(yīng)用于黃酒和乳酪中章魚胺的檢測(cè)。由表5 可知，從黃酒和乳酪中均未檢出章魚胺，在4 個(gè)添加水平（0，2，4，8 mg/kg）下，章魚胺的回收率為86%～98%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.54%～4.65%。

表5 熒光方法檢測(cè)黃酒乳酪中OA 的添加回收率Table 5 The recovery of OA-containing samples by fluorescence analysis

4 結(jié)論

采用表面印跡技術(shù)合成具有高穩(wěn)定性、高選擇性、高靈敏度的熒光分子印跡聚合物UCNPs@SiO2@MIP。將其用于食品中章魚胺的檢測(cè)，快速、簡(jiǎn)便。