曹亞倫，戴志遠(yuǎn)，2*，沈 清，2，陶美潔，李思敏，葉 繁

（1 浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 杭州310012 2 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州310012）

棕櫚油酸（C16：1n7，Palmitoleic acid）是一種16 碳的ω-7 系單不飽和脂肪酸。近年來(lái)，隨著對(duì)魚(yú)油研究的深入，相對(duì)于脂肪酸中的“明星”ω-3系脂肪酸而言，鮮為人知的ω-7 系列脂肪酸也逐漸受到關(guān)注，它和ω-3 一樣有很多健康益處，還具有一些ω-3 沒(méi)有的功能。棕櫚油酸是自然界中最常見(jiàn)的ω-7，它具有獨(dú)特的功效，是保健市場(chǎng)上的一種新產(chǎn)品。ω-3 具有預(yù)防心血管疾病和促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育等功效[1]。與ω-3 脂肪酸相比，ω-7 有著不同的作用機(jī)制，ω-7 脂肪酸能起激素樣作用[2-3]，刺激肌肉胰島素，促進(jìn)葡萄糖代謝并抑制脂肪的形成[4-6]，從而改善人體健康狀況[7-9]?？梢?jiàn)棕櫚油酸在醫(yī)療保健領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。

棕櫚油酸在常見(jiàn)的油料作物中含量較低，而在澳洲堅(jiān)果油中含30%[10]，沙棘果油中含35%[11]。有報(bào)道稱(chēng)貓兒屎籽（Decaisnea insignis）油中棕櫚油酸的含量達(dá)55.9%，植物貓爪（Dolichandra unguis）含量約64%[12]。棕櫚油酸存在于一些種子油中，從種子油及沙棘油中分離棕櫚油酸價(jià)格昂貴，且其供應(yīng)不足以滿(mǎn)足市場(chǎng)需要，需尋找新的棕櫚油酸來(lái)源。深海魚(yú)油為ω-3 系脂肪酸的最主要來(lái)源，也是棕櫚油酸的來(lái)源。目前魚(yú)油工業(yè)主要以分離ω-3 系多不飽和脂肪酸為主，以魚(yú)油為原料生產(chǎn)的棕櫚油酸較少。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于棕櫚油酸富集的研究大多以沙棘果油為原料[13-15]，而從魚(yú)油中富集棕櫚油酸的研究暫未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)使用的原料——秘魯鳀油含約8%的棕櫚油酸，因此以鳀魚(yú)油為原料進(jìn)行棕櫚油酸初步分離富集研究，為生產(chǎn)更高純度棕櫚油酸提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

魚(yú)油，秘魯進(jìn)口精制鳀魚(yú)油，由浙江海力生集團(tuán)有限公司提供。95%乙醇（分析純）、甲醇（分析純）、正己烷（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水硫酸鈉（分析純），西隴化工股份有限公司；棕櫚油酸乙酯標(biāo)品（色譜純），美國(guó)Sigma 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜儀（7890A），美國(guó)Aglilent 公司；電子天平（AL204 型），梅特勒－托利多有限公司；定時(shí)恒溫磁力攪拌器（JB-3 型），上海雷磁新涇儀器有限公司；循環(huán)水式多用真空泵（SHB-Ⅲ），鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；分子蒸餾設(shè)備，天津市金舜堯化工設(shè)備廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 魚(yú)油脂肪酸乙酯的制備[16]稱(chēng)取一定量的鳀魚(yú)油于三頸燒瓶中，水浴加熱至50 ℃，加入一定量的氫氧化鈉-乙醇溶液（m/m=0.02∶1），醇油比（無(wú)水乙醇/鳀魚(yú)油）為3∶5（m/m），水浴攪拌加熱75 min。反應(yīng)結(jié)束后將混合物倒入分液漏斗，然后用適量5%NaCl 溶液洗3 次，靜置至液體分層，去下層水相層。取上層含油相于60 ℃旋蒸除盡乙醇，加入一定量無(wú)水硫酸鈉除去水分，過(guò)濾得到鳀魚(yú)油混合脂肪酸乙酯。

1.3.2 魚(yú)油脂肪酸組分分析[17]稱(chēng)取約1 g 乙酯化魚(yú)油于15 mL 容量瓶中，加入一定量的正己烷溶解魚(yú)油，用正己烷定容至刻度線(xiàn)，搖勻。取1 mL上述溶液用有機(jī)膜過(guò)濾到樣品瓶中，做氣相色譜分析。

色譜條件：HP-88 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.20 μm）；柱箱溫度，初始溫度70 ℃，后運(yùn)行溫度100 ℃，以15 ℃/min 的速率升至150 ℃，再以3 ℃/min 的速率升至220 ℃保持5 min；進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣口溫度250 ℃；檢測(cè)器溫度280 ℃；燃?xì)鉃楦呒儦錃猓細(xì)鉃榭諝?，尾吹氣為氮?dú)狻?/p>

1.3.3 尿素包合法[18]尿素包合法是一種根據(jù)脂肪酸飽和度的不同將其分離的方法。其原理是尿素在結(jié)晶過(guò)程中形成具有一定空間體積的晶體，飽和脂肪酸不含雙鍵，直徑較小，易與尿素分子形成穩(wěn)定的包合物；不飽和脂肪酸含有雙鍵會(huì)使其碳鏈彎曲，其碳鏈占據(jù)較大的體積空間，難與尿素形成包合物。使用尿素包合法可以除去大部分飽和脂肪酸，從而提高棕櫚油酸含量。

將尿素和95 乙醇按比例（尿素∶乙醇=1∶2，g/g）混合，在75 ℃下水浴攪拌加熱直至尿素全部溶解，加入魚(yú)油（魚(yú)油∶尿素=1∶2，g/g）繼續(xù)攪拌加熱，回流1 h 使脂肪酸和尿素充分混勻，置低溫下包合結(jié)晶。包合結(jié)束后迅速抽濾，將濾液旋蒸濃縮除去乙醇，用熱水洗滌，分離出上層有機(jī)相。對(duì)抽濾后的尿包相加入熱水破壞尿素魚(yú)油絡(luò)合物，其中的脂肪酸被釋放出來(lái)，再用熱飽和食鹽水洗至下層澄清，取上層脂肪酸。通過(guò)氣相色譜分析非尿包相與尿包魚(yú)油產(chǎn)物的脂肪酸組成。

1.3.4 分子蒸餾試驗(yàn)[19]在分子蒸餾設(shè)備的出料口上裝上配套的接收燒瓶，在接收燒瓶口涂抹密封脂保證系統(tǒng)密閉性，打開(kāi)真空泵、增壓泵和冷凝水，打開(kāi)加熱器加熱導(dǎo)熱油，打開(kāi)熱油泵將熱油運(yùn)送至蒸發(fā)面處；將乙酯化鳀魚(yú)油200 g 放入設(shè)備的進(jìn)樣口，待設(shè)備的真空度和蒸發(fā)溫度達(dá)到要求后，調(diào)節(jié)刮膜轉(zhuǎn)速和進(jìn)料速度開(kāi)始進(jìn)樣，考察不同的蒸餾溫度、刮膜轉(zhuǎn)速、進(jìn)料速度對(duì)分離樣品中棕櫚油酸的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面分析優(yōu)化分子蒸餾富集棕櫚油酸的操作條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料魚(yú)油的脂肪酸組成

將棕櫚油酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品和乙酯化魚(yú)油用氣相色譜儀分析，得到其脂肪酸組成及其占總脂肪酸比例，結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2 與表1。

圖1 對(duì)棕櫚油酸標(biāo)品的氣相色譜分析表明，在試驗(yàn)條件下棕櫚油酸出峰時(shí)間為9.57 min。從圖2 和表1 可看出，原料魚(yú)油中棕櫚油酸屬于單不飽和脂肪酸，占總脂肪酸的8.41%。魚(yú)油中飽和脂肪酸占39.92%，其中C16：0占總脂肪酸的23.54%，單不飽和脂肪酸占25.34%，多不飽和脂肪酸占28.33%；中C20：5占總脂肪酸的15.47%。在富集試驗(yàn)中主要除去以C16：0為主的飽和脂肪酸和以C20：5為主的多不飽和脂肪酸。利用不同分離技術(shù)將這2 類(lèi)脂肪酸去除。在本試驗(yàn)中采用尿素包合法與分子蒸餾技術(shù)。

圖1 棕櫚油酸乙酯標(biāo)品氣相色譜圖Fig.1 GS of palmitoleic acid ethyl ester

圖2 原料魚(yú)油氣相色譜圖Fig.2 GS of fish oil

表1 原料魚(yú)油的脂肪酸組成及含量Table 1 Fatty acid composition and content of raw fish oil

2.2 尿素包合處理對(duì)魚(yú)油脂肪酸的影響

尿素包合法是利用尿素分子在結(jié)晶過(guò)程中可與飽和、單不飽和脂肪酸形成包合物，而不易與多不飽和脂肪酸包合的原理，達(dá)到對(duì)多不飽和脂肪酸分離純化的目的。原料魚(yú)油經(jīng)乙酯化處理后，采用尿素包合法富集其中的棕櫚油酸乙酯，得到非尿包相和尿包相，進(jìn)氣相色譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4 與表2。

原料魚(yú)油經(jīng)尿素包合法處理得到的產(chǎn)物非尿包相中棕櫚油酸的含量由8.41%提升至13.57%，得率為60.1%。氣相色譜分析表明（見(jiàn)表2 和圖4），尿素包合可除去大部分的飽和脂肪酸C14：0、C16：0及C18：0，只損失少量的棕櫚油酸，這是因?yàn)槟蛩匕戏ㄊ歉鶕?jù)不飽和度的差異實(shí)現(xiàn)分離的，尿素遇到脂肪化合物會(huì)形成六棱晶體結(jié)構(gòu)，直鏈的飽和脂肪酸比碳鏈彎曲的不飽和脂肪酸更易進(jìn)入尿素晶體管道內(nèi)，因此尿素包合法可以有效除去飽和脂肪酸[20]。

2.3 分子蒸餾單因素試驗(yàn)

2.3.1 刮膜轉(zhuǎn)速對(duì)富集效果的影響 刮膜轉(zhuǎn)速是影響分子蒸餾富集效果的因素之一。此次試驗(yàn)所采用的分子蒸餾條件為：設(shè)備真空度3.0×10-3kPa，進(jìn)料速度1 mL/min，蒸餾溫度70 ℃。在此條件下考察不同刮膜轉(zhuǎn)速對(duì)棕櫚油酸富集的影響，如圖5所示。

圖3 尿包相氣相色譜圖Fig.3 GS of urea phase

圖4 非尿包相氣相色譜圖Fig.4 GS of non-urea phase

表2 非尿包相與尿包相的主要脂肪酸組成及含量Table 2 Main fatty acid composition and content of non-urea phase and urea phase

由圖5 可知，在蒸餾溫度70 ℃時(shí)，隨著刮膜轉(zhuǎn)速的加快，棕櫚油酸含量提高，直至轉(zhuǎn)速達(dá)140 r/min 后棕櫚油酸含量沒(méi)有明顯提高，這是因?yàn)楫?dāng)刮膜轉(zhuǎn)速較低時(shí)，從進(jìn)料口進(jìn)入的魚(yú)油在重力和刮膜的作用下不能完全均勻地分布在蒸發(fā)表面上，低沸點(diǎn)組分不能完全蒸發(fā)到達(dá)冷凝器，冷凝流入輕相接受瓶中，從而導(dǎo)致分子蒸餾分離效果不佳。當(dāng)刮膜轉(zhuǎn)速加快，低沸點(diǎn)組分得以蒸發(fā)，分離效果有所提升。當(dāng)刮膜轉(zhuǎn)速大于140 r/min 時(shí)，棕櫚油酸富集效率沒(méi)有明顯增加，是因?yàn)榇斯文まD(zhuǎn)速足以使物料在蒸發(fā)表面上形成均勻的液膜，使輕組分得以完全蒸發(fā)出來(lái)。由上述結(jié)果可知，刮膜轉(zhuǎn)速對(duì)物料的分離效果影響不明顯，最終確定適合的刮膜轉(zhuǎn)速為140 r/min。

2.3.2 進(jìn)料速度對(duì)富集效果的影響 進(jìn)料速度是影響分子蒸餾富集效果的因素之一。本試驗(yàn)的分子蒸餾條件為：刮膜轉(zhuǎn)速140 r/min，設(shè)備真空度3.0×10-3kPa，蒸餾溫度70 ℃。在此條件下考察不同進(jìn)料速度對(duì)棕櫚油酸富集的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。

由圖6 可知，在進(jìn)料速度大于1 mL/min 時(shí)，隨著進(jìn)料速度的加快，輕相中棕櫚油酸的含量有所降低，變化不大，而輕相得率不斷降低且變化明顯，這是因?yàn)檫M(jìn)料速度快時(shí)，物料在刮膜作用下形成的液膜過(guò)快地流過(guò)蒸發(fā)面，物料得不到足夠的時(shí)間加熱，輕組分難以完全蒸發(fā)出來(lái)，且蒸發(fā)面上的液膜較厚，液膜外層也不能充分加熱，從而導(dǎo)致分子蒸餾的分離效果不理想，輕組分的得率低?？紤]到進(jìn)料速度過(guò)慢使整個(gè)操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，將進(jìn)料速度設(shè)定為1 mL/min。

2.3.3 蒸餾溫度對(duì)富集效果的影響 蒸餾溫度是分子蒸餾富集效果的決定性因素，因不同脂肪酸在高真空度下的沸點(diǎn)不同，故蒸餾溫度決定脂肪酸的分離效果及得率。本試驗(yàn)的分子蒸餾條件為：刮膜轉(zhuǎn)速140 r/min，設(shè)備真空度3.0×10-3kPa，進(jìn)料速度1 mL/min。在此條件下考察一級(jí)分子蒸餾溫度對(duì)棕櫚油酸富集的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。

由圖7 可知，當(dāng)蒸餾溫度低于65 ℃時(shí)，隨著溫度的升高輕相得率和棕櫚油酸含量都增大，這是因?yàn)榇藴囟认潞凶貦坝退岬妮p組分脂肪酸不斷被蒸餾出來(lái)，到65 ℃時(shí)大部分棕櫚油酸被蒸餾出來(lái)進(jìn)入輕相，而多不飽和脂肪酸等因溫度不夠流入重相。當(dāng)蒸餾溫度在65～75 ℃時(shí)，隨著蒸餾溫度的升高，收集的輕相中棕櫚油酸含量不斷降低，輕相得率提高，這是因?yàn)檎麴s溫度過(guò)高多不飽和脂肪酸也被蒸餾出來(lái)，隨著溫度的升高多不飽和脂肪酸進(jìn)入輕相。最終確定合適的分子蒸餾溫度為65 ℃。

圖5 刮膜轉(zhuǎn)速對(duì)分子蒸餾的影響Fig.5 Effect of scrape speed on molecular distillation

圖6 進(jìn)料速度對(duì)分子蒸餾的影響Fig.6 Effect of feed rate on molecular distillation

圖7 蒸餾溫度對(duì)分子蒸餾的影響Fig.7 Effect of temperature on molecular distillation

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化分子蒸餾工藝

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇對(duì)產(chǎn)物棕櫚油酸含量影響顯著的3 個(gè)因素：蒸餾溫度（X1）、進(jìn)料速度（X2）、刮膜轉(zhuǎn)速（X3）做三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，得到分子蒸餾的最優(yōu)條件。

通過(guò)Design-Expert 軟件進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析，得到如下多元二次響應(yīng)面回歸模型：

Y=31.56+2.43X1-2.03X2+0.81X3+0.29X1X2-0.45X1X3+0.36X2X3-6.03X12-1.11X22+0.098X32。

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平表Table 3 Experimental design factors and levels

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果表Table 4 Experiment schemes and results of the response surface

由表5 可知，模型的F 值為73.82，P＜0.0001，表明該模型顯著，可用于試驗(yàn)。3 個(gè)影響因素中——蒸餾溫度（X1）和進(jìn)料速度（X2）的影響顯著（P＜0.001），3 個(gè)交互項(xiàng)的影響不顯著，二次項(xiàng)X12的影響極顯著（P＜0.001），說(shuō)明產(chǎn)物的棕櫚油酸含量主要受蒸餾溫度和進(jìn)料速度的影響。試驗(yàn)校正決定系數(shù)R2Adj=0.9718，表明該試驗(yàn)中棕櫚油酸含量97.18%的可能性包含在回歸方程模型的9 個(gè)因子中，說(shuō)明模型合適。另外，R2=0.9852，說(shuō)明在棕櫚油酸含量的實(shí)際值與模型的預(yù)測(cè)值有較好的擬合度。CV=2.53%，該值低表示該試驗(yàn)準(zhǔn)確，可靠性高。

表5 回歸模型方差分析表Table 5 The result of regression model of variance analysis

（續(xù)表5）

2.4.2 響應(yīng)面圖分析結(jié)果 分析得出的響應(yīng)面圖見(jiàn)圖8。

從圖8 可看出，刮膜轉(zhuǎn)速與進(jìn)料速度的交互作用對(duì)棕櫚油酸含量的影響最弱。與刮膜轉(zhuǎn)速相比，進(jìn)料速度所對(duì)應(yīng)的曲面坡度較陡，說(shuō)明進(jìn)料速度的變化對(duì)棕櫚油酸含量的影響較明顯。隨著進(jìn)料速度的減慢，棕櫚油酸含量有所提高，這是因?yàn)檫M(jìn)料速度減慢有利于在蒸發(fā)面上形成更薄的液膜，有利于輕組分蒸發(fā)出來(lái)，從而提高棕櫚油酸含量。刮膜轉(zhuǎn)速和進(jìn)料速度與蒸餾溫度的交互作用對(duì)棕櫚油酸含量的影響顯著。與進(jìn)料速度和刮膜轉(zhuǎn)速相比，蒸餾溫度所對(duì)應(yīng)的曲面坡度較陡，表明蒸餾溫度對(duì)棕櫚油酸含量的影響顯著。

2.4.3 最優(yōu)條件及驗(yàn)證 利用Design-Expert 軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到分離棕櫚油酸的最優(yōu)條件：蒸餾溫度65.74 ℃，刮膜轉(zhuǎn)速160 r/min，進(jìn)料速度0.63 mL/min，同時(shí)產(chǎn)物中的棕櫚油酸含量達(dá)到最大值33.23%。

采用優(yōu)化條件對(duì)魚(yú)油進(jìn)行分子蒸餾并測(cè)定其棕櫚油酸含量，判斷優(yōu)化條件是否準(zhǔn)確。實(shí)際試驗(yàn)時(shí)適當(dāng)調(diào)整最優(yōu)條件，即蒸餾溫度65 ℃，刮膜轉(zhuǎn)速160 r/min，進(jìn)料速度0.5 mL/min，最終測(cè)得產(chǎn)物中的棕櫚油酸含量為32.29%，與預(yù)測(cè)的取代度近似，說(shuō)明模擬條件可行。

圖8 兩因素交互作用對(duì)棕櫚油酸含量的影響Fig.8 Effect of interaction of two factors on Palmitoleic acid content

2.5 尿素包合及分子蒸餾后魚(yú)油中棕櫚油酸乙酯含量

原料魚(yú)油首先經(jīng)尿素包合法處理，除去大部分飽和脂肪酸，然后在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面分析優(yōu)化得到分子蒸餾富集棕櫚油酸的最優(yōu)條件。采用氣相色譜分析分子蒸餾收集的魚(yú)油的脂肪酸組成，測(cè)定棕櫚油酸含量。經(jīng)尿素包合和分子蒸餾處理，魚(yú)油中主要脂肪酸的組成變化見(jiàn)圖9、表6。

從表6 可看出，尿素包合處理主要除去飽和脂肪酸，使產(chǎn)物中的棕櫚油酸含量由8.41%提至13.57%，得率60.1%。然后分子蒸餾處理，主要除去EPA 和DHA 等長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，使魚(yú)油中棕櫚油酸的含量由13.57%提至32.29%。分子蒸餾后收集的輕相得率26.29%，棕櫚油酸乙酯的回收率60.5%。

圖9 分子蒸餾產(chǎn)物的氣相色譜圖Fig.9 GS of molecular distillation product

表6 原料魚(yú)油經(jīng)兩次處理后其產(chǎn)物的脂肪酸組成及含量Table 6 Fatty acid composition and content of fish oil product

3 結(jié)論

利用尿素包合法和分子蒸餾分離特性的不同對(duì)魚(yú)油中的棕櫚油酸進(jìn)行富集。首先通過(guò)尿素包合處理，在反應(yīng)溫度75 ℃，m魚(yú)油∶m尿素∶m乙醇=1∶2∶4 的條件下，產(chǎn)物中棕櫚油酸的含量由8.41%提至13.57%，得率60.1%。然后分子蒸餾處理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面分析優(yōu)化得到分子蒸餾富集棕櫚油酸的最優(yōu)條件：設(shè)備真空度3.0×10-3kPa，刮膜轉(zhuǎn)速160 r/min，進(jìn)料速度0.5 mL/min，蒸餾溫度65 ℃，使魚(yú)油中棕櫚油酸的含量由13.57%提至32.29%，得率26.29%。原料魚(yú)油經(jīng)尿素包合和分子蒸餾，產(chǎn)品中的棕櫚油酸乙酯含量從8.41%提到32.29%，回收率為60.5%。