石 燕，閆 薇，涂宗財，2*，胡月明

（1 南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室 南昌大學食品科學與工程系 南昌330047 2 江西師范大學功能有機小分子教育部重點實驗室 南昌330022）

商業(yè)阿拉伯膠（Commercial gum arabic，CGA），主要是由非洲地區(qū)生長的金合歡屬植物的枝和干自行滲出的黏稠狀物，經(jīng)過人工采集處理得到原始阿拉伯膠（Original gum arabic，OGA），再經(jīng)過加工而制成的琥珀色干粉[1-2]。目前，CGA常被作為乳化劑、穩(wěn)定劑及增稠劑，廣泛應用在食品工業(yè)中[3-4]。乳化作用是CGA 最主要的作用。由于生長環(huán)境、樹種等不可控因素的影響，CGA 的乳化性能并不穩(wěn)定，真正具有商業(yè)價值的阿拉伯膠產(chǎn)品并不多，因此對CGA 進行改性，提高CGA的乳化性能，擴大其應用范圍，成為當今研究的熱點[5-6]。目前，對CGA 進行改性采用較多的是酯化改性，將疏水性的基團接入CGA 分子中來提高其乳化性能。Wang 等[5]通過十二烯基琥珀酸酐對CGA 進行改性，并通過乳液的粒徑及穩(wěn)定性來評價改性CGA 的乳化能力。Sarkar 等[7]采用干法，將95%乙醇稀釋制備的OSA 溶液對CGA 進行酯化改性，表明改性的CGA 更適合作為微膠囊壁材。此外Shi 等[8]采用水相法，成功地利用OSA 對CGA 改性，結果改性后CGA 的乳化性能顯著提高。目前的酯化改性方法均需添加大量的有機溶劑對OSA 進行預處理，在應用于工業(yè)化生產(chǎn)時對環(huán)境造成污染。本研究采用乳化劑（Emulsifying agent，EA）替代有機溶劑對OSA 進行預處理，可以大大減少由于有機溶劑造成的環(huán)境污染，同時選擇OGA 為原料，將阿拉伯膠的提取、純化、酯化一步完成，減少了生產(chǎn)工藝流程，更有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

OGA，從樹上采集的顆粒狀原始阿拉伯膠，廣州市千湖貿(mào)易有限公司；OSA（優(yōu)級品），上海立德精細化工有限公司；乳化劑（食品級），武漢全康生物科技有限公司；火麻仁油（食品級），江西宏偉天然香料有限公司；甲醇和乙腈（色譜純），美國TEDA 有限公司；其余化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

快速打粉機（DF-400D），溫嶺市林大機械有限公司；高速分散機（ULTRA-TURRAX T25），德國IKA 公司；微射流（Microfluidizer Processor M-700），美國Microfluidics 公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4），常州國華電器有限公司；數(shù)顯精密增力電動攪拌器（JJ-1），江蘇金林市環(huán)宇科學儀器廠；pH 計（DZG-6021P），瑞士梅特勒-托利多有限公司；噴霧干燥機（MDR.P-5），無錫市現(xiàn)代噴霧干燥設備有限公司；高效液相色譜儀（D-2000 HSM），日本Hitachi 公司；傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet Nexus FT-IR），美國Thermo Nicolet 公司；激光粒度分布儀（BT-9300HT），丹東百特科技有限公司；馬爾文電位儀（Zetasizer Nano ZSP），上海思百吉儀器系統(tǒng)有限公司；安東帕旋轉流變儀，奧地利安東帕公司。

1.3 方法

1.3.1 OGA 的前處理 將OGA 放入快速粉碎機中粉碎（轉速2 500 r/min，粉碎時間1 min），過100目篩，得到OGA 粉末。取質(zhì)量為m 的OGA 粉末溶于蒸餾水，不斷攪拌至溶解完全，過濾后保留OGA 溶液，備用。將不溶物烘干稱重（m0），則溶液中OGA 粉末的質(zhì)量m1=m-m0。

1.3.2 OSA 乳液的制備 稱取一定量的EA，加到3%（以m1質(zhì)量計）的OSA 中，加熱至溶解完全，在高速剪切分散機的作用下緩慢將此混合物加入冰水中，形成預乳狀液，經(jīng)動態(tài)超高壓微射流（壓力40 MPa）處理2 次，形成乳狀液，用冰水保存，備用。

1.3.3 OSA-GA 的制備 參考石燕等[9]的方法，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)OGA 溶液pH 值至8.85，然后將制備好的OSA 乳液在一定時間內(nèi)分批緩慢加入OGA 溶液中。整個反應過程均采用氫氧化鈉維持體系的pH 值，待反應完成時，用鹽酸將體系的pH值調(diào)至6.00，將其噴霧干燥得到OSA-GA。

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1 OGA 質(zhì)量分數(shù)對反應的影響 固定pH值8.85，反應時間1 h，反應溫度33 ℃，OSA 乳液3%（以m1質(zhì)量計），改變OGA 的初始含量（30%，35%，40%，45%，50%），考察OGA 質(zhì)量分數(shù)對反應的影響。

1.3.4.2 反應體系的pH 值對反應的影響 固定OGA 初始質(zhì)量分數(shù)為40%，反應時間1 h，反應溫度33 ℃，OSA 乳液3%（以m1質(zhì)量計），改變反應的pH 值（7.5，8.0，8.5，9.0，9.5），考察pH 值對反應的影響。

1.3.4.3 反應時間對反應的影響 固定OGA 初始質(zhì)量分數(shù)為40%，反應pH 8.5，反應溫度33 ℃，OSA 乳液3%（以m1質(zhì)量計），改變反應時間（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h），考察反應時間對反應的影響。

1.3.4.4 反應體系溫度對反應的影響 固定OGA初始含量為40%，反應pH 8.5，反應時間1.5 h，OSA 乳液3%（以m1質(zhì)量計），改變反應溫度（15，25，35，45，55 ℃），考察反應溫度對反應的影響。

1.3.5 響應面試驗設計 在單因素試驗的基礎上，利用Design-Expert 10.0 軟件進行響應面試驗設計，以OSA-GA 的接酯量為響應值，以反應體系pH（A），反應時間（B）和反應體系溫度（C）為響應因素，做三因素三水平的響應面試驗設計，中心試驗重復3 次，共計17 個試驗點，試驗因素水平見表1。

表1 響應面分析法的因素與水平Table 1 The factors and levels of response surface methodology

1.3.6 OSA-GA 接酯量的測定 參照Qiu 等[10]的方法，并稍作修改。色譜條件：色譜柱，Waters Nova-Pak C18 柱（3.9 nm×150 nm，4 μm）；流動相：乙腈-超純水（體積比35∶65），流速：1.00 mL/min，進樣量10 μL；檢測器波長210 nm。

1.3.6.1 標準曲線的制作 精確稱取1.000 g OSA，用乙腈定容至100 mL，得到質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的母液。取2.00 mL 母液于50 mL 容量瓶中，用乙腈定容后不斷振動使其水解36 h。分別取水解的母液0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mL 于25 mL 容量瓶中，乙腈定容后進行液相分析，得到標準曲線為Y=1020.5X-2.4131，R2= 0.9998，（X——OSA 的濃度（mg/mL）；Y——峰面積）。

1.3.6.2 接酯量的測定 總接酯量（OS）的測定方法：精確稱取OSA-GA（M1，1.000 g），置于50 mL離心管中，向其加入20 mL 4 mol/L 氫氧化鈉溶液，磁力攪拌24 h 以上，使其水解完全。將經(jīng)氫氧化鈉處理的2 mL 溶液置于25 mL 容量瓶中，向其中加入10 mL 1 mol/L 鹽酸，用乙腈定容后進行HPLC 分析?？侽S 的質(zhì)量（Mtotal，g）由標準曲線和峰面積決定，總OS 質(zhì)量與產(chǎn)物質(zhì)量百分比（OStotal，%）的計算公式如下：

游離OS 的測定方法：精確稱取OSA-GA（M2，0.5000 g）于50 mL 離心管中，向其加入5 mL 超純水，磁力攪拌溶解完全，向離心管中加入10 mL 甲醇，混勻，5 000×g 離心5 min，取上清液1 mL，與1 mL 超純水（pH 3）混合，進行液相分析，游離OS的質(zhì)量（Mfree，g）由標準曲線和峰面積決定，游離OS 質(zhì)量占產(chǎn)物質(zhì)量百分比（OSfree，%）的計算公式如下：

1.3.7 紅外光譜測定 采用無水乙醇將OSA-GA中部分殘留的OSA 洗凈后放在35 ℃烘箱中，干燥3 h 后，在紅外燈下將樣品與KBr 粉末混合并充分研磨，壓片后將其置于紅外光譜儀中掃描，掃描范圍4 000～400 cm-1，利用紅外軟件對圖譜進行分析[11]。

1.3.8 OSA-GA 乳液特性研究

1.3.8.1 乳化活力 分別稱取3.0 g GA，EA-GA和OSA-GA，溶于蒸餾水中，配制質(zhì)量分數(shù)為6%的溶液，在高速剪切分散乳化機的作用下緩慢向其中加入7.5 g 火麻仁油，轉速為1 300 r/min，分散2 min，制備初級的乳液，然后使用動態(tài)超高壓微射流處理初級乳液，壓力為40 MPa，處理2 次。取30 μL 新鮮制備的乳液于25 mL 容量瓶中，用0.1%十二烷基磺酸鈉定容，以0.1%十二烷基磺酸鈉作為空白對照，采用紫外分光光度計測定乳液在500 nm 處的吸光度[12-13]。

1.3.8.2 乳液的穩(wěn)定性 將制好的新鮮乳液置于10 mL 螺口瓶中，室溫靜置10 d，觀察其分層情況，同時將穩(wěn)定的乳液置于光學顯微鏡（目鏡10×，物鏡40×）下，觀察儲藏5 d 和10 d 的乳液顆粒的變化情況。

將新鮮乳液和室溫下儲藏5 d 和10 d 的乳液稀釋2 000 倍，測定粒徑和電位，確定乳液的穩(wěn)定性[14]。

1.3.8.3 乳液的流變學特性 參照Huang 等[12]的方法并略加修改。采用帶有60 nm 平板的MCR302流變儀對穩(wěn)定的乳液進行流變學測定，剪切速率為0.1～100 s-1，測試溫度25 ℃，分析乳液的表觀黏度。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 阿拉伯膠的質(zhì)量分數(shù)對反應的影響 如圖1所示，隨著OGA 質(zhì)量分數(shù)的增加，酯化反應的程度呈先增加后減小的趨勢，當OGA 含量為40%的時候，反應程度達到最大。這是由于整個反應體系中可能存在酯化和水解2 種反應，OGA 質(zhì)量分數(shù)越低，與OSA 接觸的幾率越小，不利于酯化反應的快速進行，且OSA 的水解程度將增加，因此隨著其質(zhì)量分數(shù)的增大，反應程度加強[5]。當OGA濃度增到一定程度時，整個反應體系黏度增加，導致攪拌困難，OSA 難以擴散，不利于酯化反應的進行，導致反應程度降低[15]，選擇OGA 的初始含量為40%。

圖1 阿拉伯膠質(zhì)量分數(shù)對反應的影響Fig.1 Effect of the mass fraction of gum arabic on the extent of reaction

圖2 反應體系pH 值對反應程度的影響Fig.2 Effect of the pH on the extent of reaction

2.1.2 反應體系pH 值對反應的影響 如圖2所示，隨著反應體系pH 值的增大，反應程度提高，當pH 8.5 時，反應程度最大；pH 值繼續(xù)增加，反應程度降低。究其原因：在酯化反應中，OGA 分子中的羥基是參與反應的活化中心，在弱堿性條件下，OGA 分子被解離成陰離子，該陰離子易與帶有正電荷的OSA 的羰基碳發(fā)生親核取代反應，生成OSA-GA，當pH 值較低時，會降低分子解離的速率，不利于OGA 分子中的羥基與OSA 的羰基碳的親核反應，造成酯化反應速率降低。當pH 值過高時，OSA 易與強堿發(fā)生反應，生成羧酸氫鈉，降低其與OGA 的反應活性，從而影響酯化反應的程度[7，16]。酯化反應的最佳pH 值為8.5。

2.1.3 反應時間對反應的影響 隨著反應時間的增加，反應程度呈現(xiàn)先提高后降低的趨勢（圖3）。這可能是由于酯化反應是一個存在酯化和水解2種反應的可逆反應，在初始階段，酯化反應比水解反應快，酯化反應占據(jù)主導地位，且反應時間延長增加了OSA 與OGA 接觸的機會，反應程度提高。隨著反應時間的延長，酯化反應的產(chǎn)物質(zhì)量分數(shù)增大，水解反應速率加快，導致酯化程度下降。最終選擇反應時間為1.5 h。

2.1.4 反應體系溫度對反應的影響 如圖4所示，反應程度隨反應溫度的增加呈先上升后下降的趨勢，當反應溫度25 ℃時，反應程度最大。溫度對酯化反應程度的影響是多方面的：一方面反應溫度過低，不利于解離的OGA 分子與OSA 分子接觸，同時也不能提供足夠的能量使該反應順利進行，從而導致反應速率降低。另一方面，溫度升高到一定值后，酯化產(chǎn)物和OSA 的水解程度增大，使反應程度降低。最終選擇反應溫度為25 ℃。

圖3 反應時間對反應程度的影響Fig.3 Effect of reaction time on the extent of reaction

圖4 反應體系的溫度對反應程度的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on the extent of reaction

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗設計結果與方差分析 利用Design-Expert 10.0 軟件的Box-Behnken 設計，建立反應體系pH、反應溫度和反應時間三因子回歸模型方程式為：

表2 Box-Behnken 試驗設計與結果Table 2 Box-Behnken design and experimental results

（續(xù)表2）

OS（%）=1.99+0.00625A+0.022B-0.089C+0.035AB+0.017AC+0.035BC-0.072A2-0.069B2-0.19C2。

由表3 可知，該模型的回歸項極顯著（P＜0.0001），失擬項不顯著（P=0.4196＞0.05），決定系數(shù)R2=0.9739，說明酯化反應的取代度與模型預測結果有較高的一致性。模型的校正系數(shù)R2Adj=0.9404，說明試驗結果中94.04%受試驗因素的影響，可用該模型分析與預測對OSA-GA 工藝。由回歸方程和方差分析，各因素對酯化反應影響的順序為C（反應溫度）＞B（反應時間）＞A（反應pH）。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.2.2 各因素的交互效應分析 回歸分析結果的響應面及其等高線如圖5所示。響應面是響應值與各試驗變量因素之間的函數(shù)關系式，考慮了兩兩因素交互作用對試驗結果的影響。響應面曲面坡度的陡峭和等高線的形狀可反映交互作用的強弱趨勢[17-18]。

由圖5a 可知，反應體系的pH 值和反應時間的交互作用對響應值影響不十分顯著，當反應pH值一定時，反應時間延長使酯化反應的接酯量呈先上升后下降的趨勢，影響顯著；當反應時間一定時，反應pH 值對酯化反應的接酯量影響不大，僅在pH 值較低時存在響應。同理，分析圖5c 和5e，得出交互項對酯化反應的影響：各因素的交互作用均不顯著，然而，固定反應pH 值或反應時間，分析反應溫度，得出隨著反應溫度的升高，酯化反應的接酯量呈先上升后下降的趨勢，影響較顯著，這與方差分析結果一致。由工藝優(yōu)化試驗得到預測的OSA-GA 最佳工藝條件為：反應pH 8.52，反應時間1.56 h，反應溫度22.8 ℃，預測產(chǎn)品的接酯量為2.00%?？紤]實際操作情況，將最佳工藝條件調(diào)整為反應pH 8.5，反應時間1.56 h，反應溫度23℃。以調(diào)整的最佳合成工藝對OGA 進行改性，對工藝進行驗證，得到產(chǎn)物的接酯量為1.97%，與理論值2.00%相比，相對誤差為1.5%。說明建立的模型能很好地預測OSA-GA 的接酯量，優(yōu)化工藝較可靠。

圖5 各因素的交互作用對酯化反應影響的響應面及等高線Fig.5 Response Surface and contour lines of the interaction of various factors on esterification reaction

2.3 紅外光譜的測定

原始阿拉伯膠經(jīng)預處理直接噴霧干燥得到GA，經(jīng)相同改性的乳化劑——阿拉伯膠（Emulsifying agent-gum arabic，EA-GA）及OSA-GA 的紅外光譜圖如圖6所示。三者具有相似的特征圖譜。在波數(shù)3 420 cm-1處出現(xiàn)大而寬的吸收峰，是GA 分子中的-OH（-NH）鍵的締合伸縮振動；2 930 cm-1處的為GA 分子中的亞甲基-CH 伸縮振動引起的吸收峰，在波數(shù)2 200 cm-1處的為空氣中CO2的吸收峰，1 600 cm-1處為-N-H 平面彎曲振動引起的[19]。與未改性的GA 和EA-GA 相比，酯化改性產(chǎn)物OSA-GA 紅外譜圖的最大變化是：在1 724 cm-1處出現(xiàn)新的特征峰，這是酯鍵（-COOR）的羰基伸縮振動吸收峰[20]，表明OSA-GA 分子中酯羰基的存在[21]，OSA 成功接枝到GA 分子中。

圖6 改性前、后阿拉伯膠的紅外光譜圖Fig.6 FTIR spectra of gum arabic before and after modification

2.4 乳液特性分析

2.4.1 乳化活力 三者的乳化活力如圖7所示，與GA 相比，EA-GA 的乳化活力有一定的提高，這可能由于EA 是一種親油型的乳化劑，它的加入，提高了對油相的親和力，從而提高其乳化活力。二者沒有顯著性差異，這與石燕等[9]的研究結果不完全一致，可能是因為該改性方法所需反應溫度較低，不能引起GA 發(fā)生“熟化”作用[22]。相對于GA 和EA-GA，OSA-GA 的乳化性能得到明顯的提高，這因為GA 經(jīng)酯化反應后，OSA 分子中疏水和親油雙功能基團的接入使其對水和油的親和力增強，從而提高其乳化活力[23-24]。

2.4.2 儲存時間對乳液粒徑和電位的影響 儲存時間對各個乳液的粒徑和電位的影響見表4。不同的乳液呈現(xiàn)不同的粒徑和電位值。儲存期間，OSA-GA 表現(xiàn)出最小的粒徑和電位值，這可能因為OSA 分子中的兩性基團能夠促進OSA-GA 形成較好的親水性-疏水性平衡，在液滴周圍形成穩(wěn)定的薄膜，且OSA 分子的接入使油滴顆粒之間產(chǎn)生更大的空間位阻，從而提高其乳化穩(wěn)定性[5，25]。酯化反應引入部分正電荷的OSA，從而降低了其電位值。

圖7 GA、EA-GA 和OSA-GA 的乳化活力Fig.7 Emulsiying activity of GA，EA-GA and OSA-GA

表4 儲存時間對乳液粒徑和電位的影響Table 4 Effect of storage time on particle size and ζ-potential of emulsion

2.4.3 儲存時間對乳液微觀結構的影響 通過光學顯微鏡觀察儲存時間對乳液微觀結構的影響，從微觀角度分析酯化改性對GA 乳液穩(wěn)定性的影響。通過觀察螺母瓶中靜置的乳液，發(fā)現(xiàn)GA 和EA-GA 乳液分別在第1 天和第6 天出現(xiàn)分層現(xiàn)象。同時將未分層的乳液置于顯微鏡下觀察，結果如圖8所示，整個儲存過程中OSA-GA 乳液液滴最穩(wěn)定，視野范圍內(nèi)未出現(xiàn)乳液聚集現(xiàn)象，表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，這也與粒徑和電位的結果類似?？赡苁且驗镺SA-GA 分子中疏水烷基和親水羧基的接入可以吸附在液滴表面，通過空間位阻效應阻礙液滴的聚集[7]，進而使乳液穩(wěn)定。綜上表明，采用OSA 對GA 進行酯化改性，能夠提高GA 的乳化穩(wěn)定性。

圖8 儲存時間對乳液微觀結構的影響Fig.8 Effect of storage time on the microstructure of emulsion

2.4.4 儲存時間對乳液表觀黏度的影響 如圖9所示，酯化改性的OSA-GA 乳液與GA 和EA-GA乳液的流變學行為相似，隨著剪切速率的增加，所有的乳液黏度均逐漸降低，表現(xiàn)為剪切稀釋。GA溶液的流變學行為主要與較大分子組分的阿拉伯半乳聚糖蛋白分子聚集密切相關[1]。在新制備的乳液中，EA-GA 乳液的表觀黏度高于GA 乳液，這可能是由乳化劑的加入導致GA 分子中的阿拉伯半乳聚糖蛋白分子的尺寸發(fā)生變化[26]。與GA 和EA-GA 乳液相比，OSA-GA 乳液的表觀黏度明顯較高，這可能是由于OSA 分子的接入使GA 的分子質(zhì)量增加，抑制了OSA-GA 分子的運動，且親水的羧酸基團的引入，使得其與水分子之間的作用力增強，因此表觀黏度增加[8，27]。

3 結論

以OGA 為原料，采用乳化劑對OSA 進行預處理，在單因素試驗基礎上，選擇反應體系pH值、反應時間和反應溫度進行響應面分析的數(shù)據(jù)擬合，得到OSA-GA 的最佳合成工藝條件為：反應pH 8.5，反應時間1.56 h，反應溫度23 ℃。在此工藝條件下，OSA-GA 的接酯量為1.97%。紅外光譜結果分析表明：OSA 分子成功接入OGA 中。對比阿拉伯膠，結合粒徑、電位以及微觀結構數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)較高的表觀黏度有利于避免乳液中顆粒的聚集及分層，經(jīng)酯化改性的OSA-GA 乳化性能顯著提高。這種基于乳化劑替代有機溶劑的酯化改性方法，不僅提高了阿拉伯膠的乳化性能，擴大了其應用范圍，而且避免了因有機溶劑的使用而造成的環(huán)境污染。對原始阿拉伯膠進行提取、提純、酯化一步完成，減少了生產(chǎn)工藝流程，節(jié)約了生產(chǎn)成本。

圖9 儲存時間對乳液表觀黏度的影響Fig.9 Effect of storage time on the viscosity of emulsion