張晨曦，董 露，盧雨潔，宣時(shí)釗，劉瑋琳，韓劍眾

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 杭州310018）

脂質(zhì)體（liposome）是由兩親分子在水中自組裝形成的微球體，它通常由天然磷脂和膽固醇組成。20世紀(jì)60年代，英國(guó)學(xué)者Bangham 等[1]將磷脂分散在水中后發(fā)現(xiàn)，磷脂可自發(fā)形成多層的封閉式囊泡結(jié)構(gòu)，將其命名為脂質(zhì)體。鑒于其具有較高的生物相容性和生物降解性，尺寸可調(diào)控性和表面可修飾等優(yōu)點(diǎn)，在過(guò)去的幾十年里，脂質(zhì)體的研究已從靶向藥物的包埋和提高基因治療效率，擴(kuò)展到食品工業(yè)對(duì)親水、親油性營(yíng)養(yǎng)素的運(yùn)載，如功能性脂質(zhì)、抗氧化劑、酶與蛋白質(zhì)以及維生素和礦物質(zhì)[2-4]等，從而提高被包埋物的穩(wěn)定性和生物利用率，同時(shí)達(dá)到定時(shí)、定位釋放的目的[5]。然而，由于傳統(tǒng)脂質(zhì)體一般由卵磷脂和膽固醇等組成，屬于熱力學(xué)不穩(wěn)定體系[6]，容易受到外界光照、pH值、溫度等條件影響，產(chǎn)生聚集、藥物泄露、磷脂氧化等現(xiàn)象[7-8]。人體攝入后在消化系統(tǒng)中脂質(zhì)體易被低酸、酶等降解，被包埋物提前釋放而失活，生物利用性降低，這些缺點(diǎn)在很大程度上限制了脂質(zhì)體在食品中的廣泛應(yīng)用[9]。

水凝膠是高分子材料形成的親水性三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其親水基團(tuán)與水分子結(jié)合，將水分子連接在網(wǎng)狀內(nèi)部，性質(zhì)柔軟、吸水量大，可維持一定的形狀。水凝膠按其原料來(lái)源可分為天然與合成兩大類，其中，天然的親水性高分子包括多糖類（淀粉、纖維素、海藻酸、透明質(zhì)酸、殼聚糖等）和多肽類（膠原、聚L-賴氨酸、聚L-谷胺酸等）。水凝膠形成方式可分為化學(xué)交聯(lián)和物理交聯(lián)?；瘜W(xué)交聯(lián)是指高分子鏈通過(guò)共價(jià)鍵互相連接，形成具有更高機(jī)械強(qiáng)度的凝膠，然而多數(shù)化學(xué)交聯(lián)劑（如戊二醛、碳化二亞胺和二苯基磷酰基疊氮化物）具有細(xì)胞毒性，使細(xì)胞存在接觸殘留有毒化學(xué)品的風(fēng)險(xiǎn)[10-11]。物理交聯(lián)則使用鹽離子與酶，使高分子鏈之間通過(guò)氫鍵、離子鍵、疏水性相互作用等方式連接形成網(wǎng)狀凝膠結(jié)構(gòu)[12-13]。水凝膠可以吸收大量水分，使得水凝膠能夠包封藥物并降低其降解速度；此外，水凝膠可在一定程度控制被包封藥物的釋放速率，具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值[14]。

近來(lái)，研究人員將脂質(zhì)體與水凝膠結(jié)合，制備成新型水凝膠藥物載體，成功突破了脂質(zhì)體應(yīng)用的限制，并在運(yùn)輸上表現(xiàn)出更優(yōu)越的性能。在醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域，Cheng 等[15]將脂質(zhì)體與明膠甲基丙烯酰分子通過(guò)UV 光交聯(lián)制備脂質(zhì)體水凝膠，除了具有優(yōu)異的藥物釋放特性，在壓縮、拉伸和周期性循環(huán)上還表現(xiàn)出優(yōu)異的機(jī)械性能；李偉澤等[16]將黃藤素柔性納米脂質(zhì)體制備成治療奶牛乳房炎的一種新型高效透皮水凝膠貼劑，相比傳統(tǒng)貼劑，具有藥物透皮吸收效率更高、黏附性更好、使用更方便的優(yōu)勢(shì)；另外，El Kechai 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，可通過(guò)向中耳施用透明質(zhì)酸脂質(zhì)體凝膠以持續(xù)將腎上腺皮質(zhì)激素遞送至內(nèi)耳。在食品領(lǐng)域，Tan 等[18]通過(guò)薄膜蒸發(fā)法制備類胡蘿卜素脂質(zhì)體，再用殼聚糖靜電吸附生物聚合物包覆脂質(zhì)體，進(jìn)而提高了類胡蘿卜素對(duì)環(huán)境脅迫的穩(wěn)定性。然而，目前大部分脂質(zhì)體水凝膠的研究聚焦于醫(yī)藥和護(hù)膚行業(yè)，鮮有在食品領(lǐng)域應(yīng)用的報(bào)道，也缺乏對(duì)這種膠狀體系在體內(nèi)消化行為的探究。脂質(zhì)體水凝膠在食品領(lǐng)域的研究和應(yīng)用具有廣闊的探索空間。

作為人體必需的營(yíng)養(yǎng)素之一，維生素C（vitamin C，VC）易在外界環(huán)境的影響下發(fā)生氧化變性。本研究以VC 為模型營(yíng)養(yǎng)素，通過(guò)脂質(zhì)體技術(shù)將其包埋，采用卡拉膠和乳清分離蛋白通過(guò)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶和鈉離子進(jìn)行物理交聯(lián)形成凝膠，再將脂質(zhì)體和水凝膠結(jié)合制備脂質(zhì)體水凝膠，達(dá)到脂質(zhì)體包埋、水凝膠運(yùn)載雙重控釋營(yíng)養(yǎng)物的目的。另外，通過(guò)研究脂質(zhì)體水凝膠的磷（Pi）釋放率、脂質(zhì)體氧化程度、VC 釋放率、平均粒徑及粒度分布、脂質(zhì)體水凝膠降解速率等，評(píng)價(jià)VC 脂質(zhì)體水凝膠的儲(chǔ)存和體外消化穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無(wú)機(jī)磷（Pi）測(cè)試盒、丙二醛（MDA）測(cè)試盒、抗壞血酸（VC）測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所；磷脂、膽固醇、VC，美國(guó)Sigma 公司；N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸鈉鹽（HEPES）、κ-卡拉膠，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶TG-H，泰興市一鳴生物制品有限公司；豬胃黏膜胃蛋白酶、豬胰臟中胰酶、膽鹽，美國(guó)Sigma 公司；NBD-PE，美國(guó)Molecular ProbesR公司；Fast Green，英國(guó)Sterilin 公司；其它無(wú)機(jī)試劑均購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

組織分析儀（TA.XT Plus 型），德國(guó)IKA 公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Multiskan Spectrum），美國(guó)Thermo Scientific 公司；激光粒度分析儀（MS3000型），英國(guó)Malvern 公司；高內(nèi)涵成像系統(tǒng)（Image Xpress Micro XLS System），美國(guó)Molecular Devices 公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RV 10 D S96 型），德國(guó)IKA 公司；振蕩水浴槽（SW22 型），德國(guó)Julabo 公司；高速冷凍離心機(jī)（SORVALL BiofugeRPrimo R型），美國(guó)Kendro 公司；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Prism R型），美國(guó)Labnet 公司；高速剪切機(jī)（T18 digital型），德國(guó)IKA 公司。

1.3 方法

1.3.1 脂質(zhì)體水凝膠的制備

1.3.1.1 脂質(zhì)體的制備 采用薄膜分散法制備脂質(zhì)體[19]。以質(zhì)量比6∶1 的比例稱取磷脂和膽固醇，溶解于一定量的無(wú)水乙醇中，用磁力攪拌器攪拌至固體物質(zhì)完全溶解。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀抽真空除去無(wú)水乙醇，待形成脂質(zhì)薄膜，沿圓底燒瓶壁緩緩加入含VC 的10 mmol/L HEPES 緩沖溶液（pH 7.4），在53 ℃、80 r/min 條件下充分洗膜約1 h，獲得VC 質(zhì)量濃度約5 mg/mL（研究脂質(zhì)體水凝膠儲(chǔ)存穩(wěn)定性時(shí)不加VC）、磷脂及膽固醇質(zhì)量濃度為8 mg/mL 的脂質(zhì)體。

為防止磷脂和VC 氧化分解，制備過(guò)程需全程避光。HEPES 緩沖液的配制方法是：稱取1.1915 g N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸，溶解在480 mL 0.8%氯化鈉溶液中，用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值至7.4，定容500 mL。

1.3.1.2 脂質(zhì)體水凝膠的制備 將上述脂質(zhì)體按照6 mg/mL κ-卡拉膠、0.8%乳清分離蛋白（WPI）、0.1 mol/L 氯化鈉、10 U/mL 谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的配比，制備脂質(zhì)體水凝膠。

分別將WPI 和κ-卡拉膠用超純水溶解，于50 ℃水浴加熱30 min，各取2 mL 溶液混合并攪拌。陸續(xù)將0.5 mL 谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶溶液、0.5 mL氯化鈉溶液加入上述混合物中，繼續(xù)攪拌。隨后，加入1 mL 脂質(zhì)體，將混合物攪拌均勻。將混合物繼續(xù)置于50 ℃振蕩水浴槽加熱，30 min 后即可制得脂質(zhì)體含量為16.7%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的脂質(zhì)體水凝膠。將成品于4 ℃保存，24 h 后再進(jìn)行后續(xù)檢驗(yàn)。

1.3.2 脂質(zhì)體水凝膠儲(chǔ)存穩(wěn)定性研究

1.3.2.1 外觀拍照 將脂質(zhì)體水凝膠置4 ℃冰箱中儲(chǔ)存，分別于第1，3，7，14，30 天取出，對(duì)其外觀拍照，觀察樣品外觀隨時(shí)間的變化。

1.3.2.2 Pi 釋放量 根據(jù)無(wú)機(jī)磷測(cè)定試劑盒方法，測(cè)定不同儲(chǔ)存時(shí)間（1，3，7，14，30 d）樣品的Pi釋放量，間接闡析脂質(zhì)體釋放速率。具體步驟為：分別取不同儲(chǔ)存時(shí)間點(diǎn)的樣品，以3 000 r/min 離心10 min[20]。取0.1 mL 上清液，加入0.4 mL 沉淀劑后充分混勻，再以3 500 r/min 離心10 min。取0.2 mL 待測(cè)上清液、0.5 mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)品和去離子水，加入2 mL 工作液混勻，分別制備樣品管、標(biāo)準(zhǔn)管和空白管，然后37 ℃水浴30 min，再冷卻至室溫。采用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定各組樣品的吸光度值，測(cè)定條件為：波長(zhǎng)660 nm，光徑1 cm。根據(jù)公式計(jì)算各組樣品的Pi 含量，研究水凝膠中脂質(zhì)體的釋放程度。公式如下：

1.3.2.3 脂質(zhì)氧化程度 根據(jù)丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒方法，測(cè)定不同儲(chǔ)存時(shí)間（1，3，7，14，30 d）脂質(zhì)體水凝膠的脂質(zhì)氧化程度。具體步驟為：分別取不同儲(chǔ)存時(shí)間點(diǎn)的樣品，以3 000 r/min 離心10 min[20]。取0.1 mL 上清液、10 nmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)品和無(wú)水乙醇，加入0.1 mL 試劑一，分別制備樣品管、標(biāo)準(zhǔn)管和空白管，混勻后依次加入3.0 mL 試劑二應(yīng)用液、1.0 mL 試劑二應(yīng)用液。用旋渦混勻器混勻后，置于95 ℃水浴鍋加熱40 min 后取出，用流水冷卻，再以4 000 r/min 離心10 min。取上清液，采用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定各組樣品的吸光度值，測(cè)定條件為：波長(zhǎng)532 nm，光徑1 cm。根據(jù)公式計(jì)算出各組樣品的MDA 含量，研究水凝膠的脂質(zhì)氧化程度。其計(jì)算公式：

1.3.3 脂質(zhì)體水凝膠消化性研究 參照Minekus等[21]的方法，經(jīng)改良配制模擬口腔液、模擬胃液和模擬小腸液，配方如表1所示。

1.3.3.1 脂質(zhì)體水凝膠模擬體外消化

1）消化前處理：將樣品用高速剪切機(jī)以6 Hz 頻率，先剪切6 s，攪拌均勻后再剪切5 s。

2）模擬口腔消化：消化前處理完成后，稱取4 g 樣品，依次向其中加入3.2 mL 口腔模擬消化液（simulated saliva fluid，SSF）、20.0 μL 0.3 mol/L CaCl2溶液、0.78 mL 超純水，調(diào)節(jié)pH 值為7，然后置于37 ℃恒溫水浴搖床反應(yīng)2 min，做3 組平行試驗(yàn)。

表1 體外模擬消化液成分Table 1 In vitro digestive fluids composition

3）模擬胃消化：向經(jīng)過(guò)口腔模擬消化2 min后的消化樣品中依次加入4.8 mL 胃模擬消化液（simulated gastric fluid，SGF）、30.0 μL 0.03 mol/L CaCl2溶液、1.00 mL 超純水，調(diào)節(jié)pH 值為3，再加入0.15 mL 2 000 U/mL 胃蛋白酶溶液，然后置于37 ℃恒溫水浴搖床反應(yīng)。分別在消化30，60 min 和120 min 時(shí)取樣，做3 組平行試驗(yàn)。

4）模擬小腸消化：向經(jīng)過(guò)胃部模擬消化120 min 后的消化樣品中依次加入4.3 mL 小腸模擬消化液（simulated intestinal fluid，SIF），0.57 mL 膽汁，12.0 μL 0.3 mol/L CaCl2溶液、0.57 mL超純水，調(diào)節(jié)pH 值為7，再加入0.5 mL 100 U/mL胰酶溶液，然后置于37 ℃恒溫水浴搖床反應(yīng)。分別在消化30，60 min 和120 min 時(shí)取樣，做3 組平行試驗(yàn)。

1.3.3.2 消化樣品的離心 將各消化時(shí)間點(diǎn)的消化樣品稀釋至相同體積，以1 500×g 離心10 min，取部分上清液用于后續(xù)檢測(cè)。

1.3.3.3 消化樣品平均粒徑及粒徑分布 參照Sun 等[22]的測(cè)定方法，取1.3.3.2 節(jié)的上清液，采用激光粒度分析儀測(cè)定消化樣品的平均粒徑和粒徑分布。

1.3.3.4 微觀結(jié)構(gòu) 分別取未消化，口腔消化2 min，胃消化30，60，120 min，小腸消化30，60，120 min 的消化樣品，用高內(nèi)涵成像系統(tǒng)觀察消化過(guò)程中脂質(zhì)體水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)變化[23]。脂質(zhì)體用NBD-PE 染色，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為463 nm 和536 nm；WPI 用固綠染色，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為633 nm 和760 nm。

1.3.3.5 Pi 及其包埋物VC 的釋放量 根據(jù)無(wú)機(jī)磷測(cè)定試劑盒的方法測(cè)定不同消化時(shí)間點(diǎn)消化樣品的Pi 釋放量。具體步驟如1.3.2.2 節(jié)所示。

根據(jù)抗壞血酸測(cè)定試劑盒方法測(cè)定不同消化時(shí)間點(diǎn)消化樣品的VC 釋放量。具體步驟為：分別取不同消化時(shí)間點(diǎn)消化樣品離心后的上清液0.15 mL，加入0.45 mL 試劑一應(yīng)用液，旋渦混勻，放置15 min 后以4 000 r/min 離心10 min，上層清亮液體為上清液。取0.4 mL 上清液、6 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)品和去離子水，依次加入0.5 mL 試劑二應(yīng)用液、1 mL試劑三應(yīng)用液、0.25 mL 試劑四應(yīng)用液，制備樣品管、標(biāo)準(zhǔn)管和空白管，充分混勻后37 ℃水浴30 min，加入0.1 mL 試劑五應(yīng)用液。充分混勻后靜置10 min，采用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定各組測(cè)定管吸光度值，測(cè)定條件為波長(zhǎng)536 nm，光徑1 cm。計(jì)算各組樣品的VC 含量。其計(jì)算公式如下：

1.4 數(shù)據(jù)處理

脂質(zhì)體水凝膠各指標(biāo)的測(cè)量均為3 次平行試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)，所有圖表通過(guò)Excel 2016 和Origin 8.5 分析制作得到，所有統(tǒng)計(jì)值按平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（≤0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂質(zhì)體水凝膠儲(chǔ)存穩(wěn)定性

2.1.1 外觀變化 由圖1 可知，在儲(chǔ)存期內(nèi)，脂質(zhì)體水凝膠的外觀總體上沒(méi)有發(fā)生很大變化。第7天觀察到脂質(zhì)體水凝膠有少許水分析出，第14 天和第30 天均可觀察到脂質(zhì)體水凝膠有輕微失水現(xiàn)象。整體外觀上，脂質(zhì)體水凝膠的顏色、均勻程度等均無(wú)明顯差異。由此可知，儲(chǔ)存期間脂質(zhì)體水凝膠的表觀穩(wěn)定性較好。

圖1 不同儲(chǔ)存時(shí)間脂質(zhì)體水凝膠的外觀變化Fig.1 Changes in appearance of liposomal hydrogels during storage

2.1.2 脂質(zhì)體釋放量及氧化程度 脂質(zhì)體的主要成分為磷脂，而水凝膠中其它物質(zhì)幾乎不含Pi 元素，可采用測(cè)定Pi 含量代表脂質(zhì)體的釋放量。由圖2a 可知，儲(chǔ)存期前14 d，脂質(zhì)體水凝膠的Pi 釋放量約為0.124 mmol/L；從第14 天至第30 天，釋放量增約為0.20 mmol/L。其原因可能是脂質(zhì)體水凝膠在儲(chǔ)存過(guò)程中逐漸失水，水凝膠的結(jié)構(gòu)變得松散，脂質(zhì)體從水凝膠中不斷游離。隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，水凝膠的結(jié)構(gòu)變化越大，游離出的脂質(zhì)體越多?？傮w而言，在一定的貯藏時(shí)間內(nèi)（30 d），脂質(zhì)體水凝膠可維持較低脂質(zhì)體釋放量，表明其包裹脂質(zhì)體能力較強(qiáng)，該結(jié)果與外觀結(jié)論相吻合。

脂質(zhì)體中的磷脂的大多含有不飽和脂肪酸，這使脂質(zhì)體在制備和放置過(guò)程中極易發(fā)生氧化形成過(guò)氧化脂質(zhì)[24]，而過(guò)氧化脂質(zhì)的降解產(chǎn)物中含有丙二醛（MDA），可與硫代巴比妥酸（TBA）縮合形成紅色產(chǎn)物?；诖嗽?，可采用MDA 試劑盒測(cè)定樣品中的MDA 含量，研究脂質(zhì)體的氧化程度。由圖2b 可知，在儲(chǔ)藏期內(nèi)，脂質(zhì)體水凝膠的氧化程度呈緩慢上升趨勢(shì)。第1 天至第3 天，脂質(zhì)體水凝膠氧化程度上升較快，MDA 含量增幅約0.47 nmol/mL；從第3 天開(kāi)始，MDA 含量增長(zhǎng)速率明顯減小，4 d 內(nèi)僅增長(zhǎng)約0.35 nmol/mL；從第7 天至第30 天，MDA 含量緩慢增加約0.45 nmol/mL。本試驗(yàn)制備的脂質(zhì)體中含有膽固醇成分。根據(jù)王寧等[25]的研究，膽固醇對(duì)脂質(zhì)體的過(guò)氧化損傷有很好的保護(hù)作用。同時(shí)水凝膠起到將脂質(zhì)體與外界阻隔的作用，有效降低了氧化水平。丁寶淼[26]在考察壁材組成、芯壁比、芯材類型對(duì)脂質(zhì)體氧化的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在蛋黃卵磷脂：膽固醇為8∶1（質(zhì)量比）時(shí)脂質(zhì)氧化程度最低，然而，該脂質(zhì)體在1 個(gè)月儲(chǔ)存期內(nèi)的MDA 釋放量高達(dá)5.55 nmol/mL，遠(yuǎn)高于本研究中脂質(zhì)體的氧化速率。這進(jìn)一步說(shuō)明水凝膠對(duì)脂質(zhì)體有較好的保護(hù)性，使脂質(zhì)體在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持較低的氧化程度。

圖2 儲(chǔ)存期內(nèi)脂質(zhì)體釋放量（a）及氧化程度（b）的變化趨勢(shì)Fig.2 Trend of liposomal release（a）and oxidation（b）during storage

2.2 脂質(zhì)體水凝膠的體外模擬消化特性

圖3 脂質(zhì)體水凝膠消化過(guò)程中微觀結(jié)構(gòu)變化Fig.3 Microstructural changes during liposomal hydrogel digestion

2.2.1 微觀結(jié)構(gòu)變化 本研究分別用NBD-PE和固綠標(biāo)記脂質(zhì)體和WPI，采用高內(nèi)涵成像系統(tǒng)觀察脂質(zhì)體水凝膠在消化過(guò)程中的微觀結(jié)構(gòu)變化。由圖3 可知，在未消化的脂質(zhì)體水凝膠中，脂質(zhì)體和WPI 緊密結(jié)合，脂質(zhì)體較為均勻地分布在水凝膠中。模擬口腔消化2 min 后，脂質(zhì)體和WPI開(kāi)始分散，而脂質(zhì)體仍均勻分散于凝膠四周。在模擬胃消化階段，消化至30 min 時(shí)，脂質(zhì)體和WPI呈小面積聚集狀態(tài)；60 min 時(shí)，脂質(zhì)體和WPI 逐漸分散，而WPI 仍有部分呈大塊狀聚集，這與倪瑩宙[27]的研究結(jié)果一致，即在胃酸條件下，胃蛋白酶無(wú)法完全降解WPI；120 min 時(shí)，顆粒物的分布更加稀疏，塊狀的WPI 出現(xiàn)解體現(xiàn)象。在模擬小腸消化階段，消化至30 min 時(shí)，脂質(zhì)體和WPI 明顯分散，且WPI 已分解成小顆粒狀，均勻地分布于消化樣品中；60 min 時(shí)，WPI 顆粒已明顯減少，脂質(zhì)體仍有較多殘留；120 min 時(shí)，脂質(zhì)體和WPI幾乎分解殆盡。以上現(xiàn)象說(shuō)明脂質(zhì)體水凝膠在口腔中較穩(wěn)定；模擬胃消化后，在胃蛋白酶的作用下WPI 逐漸被分解，但并未完全水解，結(jié)合作者前期研究，低酸環(huán)境減少脂質(zhì)體帶電量，減小排斥力，促進(jìn)脂質(zhì)體聚集[29]，而脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)可基本保持完整[29]。進(jìn)入模擬小腸環(huán)境后，在胰蛋白酶和胰脂肪酶消化下脂質(zhì)體和WPI 迅速分解。

2.2.2 平均粒徑及粒度分布脂質(zhì)體水凝膠在模擬口腔、胃、小腸消化過(guò)后的平均粒徑變化如圖4 和圖5所示。未消化和模擬口腔消化后的樣品平均粒徑接近。在模擬胃部消化的前期，平均粒徑先大幅度地增加，后期又開(kāi)始逐漸減??；而在模擬小腸消化階段，平均粒徑緩慢減小并逐漸趨于平穩(wěn)。從圖5 可以看出，未消化原樣的D[4，3]主要分布在1～2 μm，少有10 μm 以上的顆粒；口腔消化2 min 后的消化樣品中開(kāi)始出現(xiàn)一些的粒徑大于10 μm 的顆粒。進(jìn)入胃消化后，粒徑超過(guò)100 μm的顆粒逐漸增多，尤其是在胃消化60 min 時(shí)，粒徑100～1 000 μm 之間出現(xiàn)了一個(gè)明顯的波峰，之后，波峰逐漸減小。進(jìn)入小腸消化后，消化樣品的粒徑逐漸變小（＜10 μm），至120 min 時(shí)達(dá)到最小狀態(tài)。此結(jié)果與圖5 中表格呈現(xiàn)的D[3，2]、Dx（90）等相符。

圖4 體外消化過(guò)程中脂質(zhì)體水凝膠平均粒徑變化Fig.4 Changes in the average particle size of liposomal hydrogel during in vitro digestion

圖5 體外消化過(guò)程中脂質(zhì)體水凝膠粒度分布變化Fig.5 Changes in the particle size distribution of liposomal hydrogel during in vitro digestion

表2 體外消化過(guò)程中脂質(zhì)體水凝膠粒度分布Table 2 The particle size distribution of liposomal hydrogel during in vitro digestion

在模擬胃部消化過(guò)程中消化樣品中的微粒物質(zhì)出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，這一現(xiàn)象可能與消化環(huán)境的pH值有關(guān)。模擬胃消化環(huán)境呈酸性，由Ringgenberg等[30]的研究可知，在pH 值較低的情況下，蛋白質(zhì)、多肽等容易發(fā)生聚集，使WPI 形成較大的顆粒聚集體；另一個(gè)原因可能是由于模擬胃環(huán)境中，脂質(zhì)體間的排斥力減小，微粒間相互靠近聚集，從而形成較大的微粒聚集體。根據(jù)劉宇等[31]的研究，胃蛋白酶在50 ℃以下較為穩(wěn)定，在pH 1.0～5.0 具有較高活性，專一性較強(qiáng)，可水解球蛋白。本研究模擬胃消化環(huán)境的溫度為37 ℃，pH 3.0，消化樣品中的WPI 富含β-乳球蛋白及免疫球蛋白。在此條件下，胃蛋白酶具有較高活性，可對(duì)WPI 起顯著的水解作用。在模擬胃消化后期，消化樣品中的蛋白質(zhì)逐漸被分解成小的肽片段，粒徑呈逐漸減小趨勢(shì)。進(jìn)入模擬小腸消化階段后，消化環(huán)境pH 值為7.0，胃蛋白酶失活，然而加入的胰酶中含有胰蛋白酶和胰脂肪酶[32]，分別促進(jìn)了蛋白質(zhì)和脂類的水解反應(yīng)，使WPI 和脂質(zhì)體被逐漸分解成小分子物質(zhì)，消化樣品中的微粒粒徑呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。粒徑及其分布結(jié)果與微觀結(jié)構(gòu)保持一致。

2.2.3 脂質(zhì)體及其包埋物VC 釋放量 脂質(zhì)體水凝膠經(jīng)模擬口腔、胃、小腸消化過(guò)后Pi 含量變化趨勢(shì)如圖6A所示。脂質(zhì)體水凝膠經(jīng)過(guò)口腔消化2 min、胃消化120 min，消化樣品中Pi 含量緩慢增加，推測(cè)在口腔和胃消化過(guò)程中，脂質(zhì)體水凝膠中WPI 逐漸分解，因卡拉膠的存在，水凝膠仍保持一定的結(jié)構(gòu)，從而阻止脂質(zhì)體的進(jìn)一步釋放。從胃消化至小腸消化，消化樣品中Pi 含量明顯增大，說(shuō)明水凝膠進(jìn)一步分解，更多的脂質(zhì)體游離出。通過(guò)該趨勢(shì)圖可發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體水凝膠在模擬口腔和胃階段被破壞的程度較??；而在模擬小腸條件下，脂質(zhì)體水凝膠開(kāi)始大量分解，此結(jié)果與平均粒徑的變化相符。

如圖6b所示，隨著消化的進(jìn)行，樣品中VC含量的變化與Pi 的釋放類似，即在口腔和胃中變化不明顯，總體呈緩慢上升趨勢(shì)。進(jìn)入小腸消化后，消化樣品中的VC 含量開(kāi)始出現(xiàn)明顯增幅，尤其是在消化60 min 時(shí)，達(dá)到測(cè)量的峰值，這可能是由于胰酶對(duì)磷脂的水解作用以及膽汁鹽與脂質(zhì)體組分的相互作用[29]。本研究用的豬胰酶中含有脂肪分解酶，包括脂肪酶、磷脂酶A2和膽固醇酯酶。De Haas 等[33]早已發(fā)現(xiàn)胰脂肪酶可以催化磷脂中1-脂肪酸的水解，釋放出脂肪酸和1-?；苎字?。胰腺提取物中的磷脂酶A2能夠催化磷脂的sn-2 酯鍵，水解成甘油磷酸和2-酰基溶血磷脂，這使脂質(zhì)體磷脂雙分子層不穩(wěn)定。Howles 等[34]也證實(shí)膽固醇酯酶（膽鹽刺激脂肪酶）能夠水解磷脂。由于這3 種酶對(duì)脂質(zhì)體磷脂的化學(xué)水解作用，脂質(zhì)組裝的有序結(jié)構(gòu)被破壞，VC 從中游離出。在60～120 min，VC 含量又出現(xiàn)明顯的下降，可能是由于VC 后期受光照、熱或氧氣等外界環(huán)境的影響，發(fā)生氧化變性，使測(cè)定結(jié)果降低[35]。該結(jié)果表明，在模擬口腔和胃階段，脂質(zhì)體水凝膠的VC 釋放量低，脂質(zhì)體破壞的程度較小且較為穩(wěn)定；在模擬小腸中，VC 的釋放量明顯上升，脂質(zhì)體開(kāi)始大量分解。這一趨勢(shì)與平均粒徑的變化趨勢(shì)相符。Widjaja[36]等也有類似的結(jié)論，他們對(duì)凝膠、脂質(zhì)體和脂質(zhì)體水凝膠的載藥性能進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)普通載藥凝膠在12 h 內(nèi)100%的藥物被釋放；21 d 后載藥脂質(zhì)體藥物釋放度為78%；經(jīng)兩種不同化學(xué)物修飾的透明質(zhì)酸脂質(zhì)體水凝膠，釋放度分別降為32%和29%，緩釋效果顯著優(yōu)于單一的凝膠或脂質(zhì)體。綜上，脂質(zhì)體水凝膠對(duì)包封物的釋放有良好的控制能力。

圖6 體外消化過(guò)程中Pi 釋放量（a）及包埋物VC 釋放量（b）Fig.6 Pi release（a）and VC release（b）from liposomal hydrogel during in vitro digestion

3 結(jié)論

制備了包埋VC 的脂質(zhì)體水凝膠，對(duì)脂質(zhì)體水凝膠的儲(chǔ)存和體外消化穩(wěn)定性進(jìn)行初步研究。結(jié)果表明，脂質(zhì)體水凝膠在1 個(gè)月的儲(chǔ)存期，外觀特征未出現(xiàn)明顯差異，脂質(zhì)體釋放量較低，同時(shí)脂質(zhì)氧化程度較低。脂質(zhì)體水凝膠在模擬口腔和胃環(huán)境時(shí)，水凝膠物理結(jié)構(gòu)有一定破壞，僅有少量脂質(zhì)體從凝膠中游離，且脂質(zhì)體較為穩(wěn)定；在模擬小腸消化階段，水凝膠開(kāi)始大量分解釋放出脂質(zhì)體，以及其中的VC，表現(xiàn)出良好的小腸定點(diǎn)緩釋功能。本研究制備的VC 脂質(zhì)體水凝膠具有較為理想的儲(chǔ)存穩(wěn)定性和消化緩釋性，為具有營(yíng)養(yǎng)物靶向釋放需求的食品級(jí)運(yùn)載體系的設(shè)計(jì)提供了新思路。