李姝 ，王松濤，吳萌萌，邵華武，趙建，焦威*

1. 中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所（成都 610041）；2. 瀘州品創(chuàng)科技有限公司（瀘州 646000）；3. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院資源微生物學(xué)及生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（成都 610064）

苦蕎麥俗稱苦蕎（Fagopyrum tataricum（L.）Gaertn.），學(xué)名韃靼蕎麥，屬雙子葉蓼科蕎麥屬[1]?？嗍w在我國(guó)種植歷史悠久，其味苦、性平寒，具有活氣血、續(xù)精神、實(shí)腸胃等功效，是少有的亦食亦藥糧食作物[2]。我國(guó)是苦蕎的發(fā)源地，也是苦蕎的主產(chǎn)國(guó)之一，苦蕎在我國(guó)的山西、內(nèi)蒙古、陜西、江西、云南、貴州、四川等地均有分布，特別是在西南地區(qū)有大面積種植[3]。近年來(lái)已有研究表明，黃酮類物質(zhì)是苦蕎中最重要的生物活性物質(zhì)，其具有降三高、抑菌、抗炎、抗氧化、抗癌、緩解動(dòng)脈粥樣硬化、預(yù)防老年癡呆等多種生理功能[4-10]。

苦蕎中的活性黃酮類化合物主要包含蘆丁、槲皮素和山柰酚等[11-12]。苦蕎種子不同部位黃酮類化合物含量差異較大，其中以苦蕎麩皮中黃酮類化合物的含量最高，是苦蕎類食品加工中具有利用價(jià)值的副產(chǎn)物[13-14]。王軍[15]研究發(fā)現(xiàn)采用乙醇熱回流法、微波輔助法、超聲波輔助法分別提取苦蕎麩皮總黃酮，得率均在5%～6%之間。由于僅采用溶劑提取法獲得的提取物中黃酮含量較低，效率較差，為獲得較高含量的苦蕎麩皮黃酮富集品，進(jìn)一步純化加工顯得尤為重要。鑒于食品安全生產(chǎn)對(duì)于溶劑、方法的限制，黃酮類物質(zhì)的精制方法主要包括沉淀法、逆流色譜法、層析法、大孔樹(shù)脂法等。其中，大孔樹(shù)脂法以其價(jià)格低廉、吸附容量大、可反復(fù)使用、可應(yīng)用于食品、藥品生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)成為實(shí)驗(yàn)室以及規(guī)模化生產(chǎn)中最常用有效的純化方法[16]。而HPLC法以其分離效果好、分析時(shí)間短、樣品量少等特點(diǎn)成為最適用于黃酮類物質(zhì)檢測(cè)的方法[17]。目前，利用HPLC法同時(shí)測(cè)定經(jīng)不同大孔樹(shù)脂富集的苦蕎麩皮精提物中多種黃酮成分的文獻(xiàn)尚未見(jiàn)報(bào)道。

此次試驗(yàn)擬通過(guò)3種大孔樹(shù)脂純化獲得苦蕎麩皮黃酮富集品，并采用HPLC建立同時(shí)測(cè)定苦蕎麩皮富集品中4種黃酮類物質(zhì)的分析方法，用于黃酮類成分的含量測(cè)定，以期為苦蕎提取物的食品生產(chǎn)利用及質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

LC-16型高效液相色譜儀（日本島津公司）；SHZ-DIII循環(huán)水式多用真空泵（鞏義市科華儀器設(shè)備有限公司）；YRE-301旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；HZK-FA210萬(wàn)分之一電子分析天平（福州華志科學(xué)儀器有限公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州匯成科工貿(mào)有限公司）；PCWJ-10超純水系統(tǒng)（成都品成科技有限公司）；凈品級(jí)ADS-7、AB-8、D101型大孔吸附樹(shù)脂（天津浩聚樹(shù)脂科技有限公司）。

乙醇（純度≥95%，食品級(jí)，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、磷酸（色譜純），Knowles；蘆?。兌取?9%）、煙花苷（純度≥98%）、槲皮素（純度≥99%）、山柰酚標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%），成都普思生物科技股份有限公司；苦蕎麩皮原料（四川環(huán)太生物科技股份有限公司）。

1.2 色譜分析條件

采用Intersustain C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈和0.2%磷酸水溶液分別作為流動(dòng)相A和B。梯度洗脫程序：0～25 min，15%～25% A；25～35 min，25%～50% A；35～45 min，50%～90% A；45～55 min，90% A。進(jìn)樣量20 μL，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm。

1.3 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

分別精密稱取10 mg蘆丁、2 mg煙花苷、5 mg槲皮素和1 mg山柰酚，用甲醇充分溶解后分別定容于10 mL容量瓶中，制成質(zhì)量濃度分別1，0.2，0.5和0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)樣品母液。分別準(zhǔn)確量取4，1，3和1 mL上述標(biāo)準(zhǔn)樣品母液于10 mL容量瓶中，加入甲醇定容，備用。

1.4 大孔樹(shù)脂富集苦蕎麩皮黃酮

取適量苦蕎麩皮，以料液比1∶10（g/mL），加入70%乙醇，在60 ℃下熱回流提取3 h，提取3次，合并3次提取液，減壓濃縮至干，得苦蕎麩皮黃酮粗品。

取上述苦蕎麩皮黃酮粗品，加水制備成1 mg/mL的上樣液，以90%乙醇、2 BV/h的洗脫速度，采用ADS-7、AB-8、D101型大孔吸附樹(shù)脂分別對(duì)苦蕎麩皮黃酮粗品進(jìn)行洗脫純化，收集6 BV洗脫液，減壓濃縮至干，得到不同大孔樹(shù)脂富集的苦蕎麩皮黃酮富集品。

1.5 待測(cè)樣品溶液的制備

分別精密稱取10 mg不同大孔樹(shù)脂富集的苦蕎麩皮黃酮富集品，用甲醇充分溶解，定容于10 mL容量瓶中，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品色譜圖

取各標(biāo)準(zhǔn)品混合液，分別在200～500 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光光譜掃描，分析4種黃酮類物質(zhì)的最大吸收光譜。4種黃酮類物質(zhì)在256和360 nm左右有最大吸收峰，同時(shí)考慮到標(biāo)準(zhǔn)品在256 nm處基線不穩(wěn)定，而在360 nm處基線穩(wěn)定，因此選擇360 nm作為黃酮類化合物的檢測(cè)波長(zhǎng)（圖1）。按1.2小節(jié)條件，分別精密吸取20 μL混合標(biāo)準(zhǔn)品、ADS-7、AB-8、D101型大孔樹(shù)脂富集的苦蕎麩皮黃酮富集品溶液進(jìn)樣，結(jié)果顯示，以乙腈-0.2%磷酸水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，可以很好地將目標(biāo)峰分開(kāi)，各相鄰色譜峰之間的理論塔板數(shù)均大于30 000，分離度均大于1.5（圖2）。

2.2 檢測(cè)方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系

將混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入甲醇稀釋，分別配制成5個(gè)質(zhì)量濃度水平。按1.2小節(jié)條件進(jìn)樣，以相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得到蘆丁、煙花苷、槲皮素、山柰酚的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍，結(jié)果見(jiàn)表1和圖3。

結(jié)果顯示，蘆丁、煙花苷、槲皮素和山柰酚分別在25～400，1.25～20，9.375～150和0.625～10 μg/mL的濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均在0.999 6及以上。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品紫外吸收?qǐng)D

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)品（A）和ADS-7（B）、AB-8（C）、D101（D）富集的待測(cè)樣品色譜圖

表1 4種黃酮類成分的線性關(guān)系

圖3 4種黃酮類成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 精密度試驗(yàn)

取20 μL混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.2小節(jié)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄各黃酮成分的峰面積。結(jié)果顯示，蘆丁、煙花苷、槲皮素和山柰酚峰面積的δRSD分別為1.3%，1.7%，1.7%和0.9%，表明儀器精密度較好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將制備的同一份樣品溶液，分別于配制后的0，2，4，8，12，24和48 h進(jìn)樣20 μL，記錄各組分的峰面積。結(jié)果顯示，蘆丁、煙花苷、槲皮素和山柰酚峰面積的δRSD分別為2.4%，2.8%，1.6%和2.8%，表明待測(cè)樣品溶液中4種黃酮類物質(zhì)在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取5份適量苦蕎麩皮黃酮富集品，按1.5小節(jié)方法制備待測(cè)樣品溶液。精密吸取20 μL待測(cè)樣品溶液，按1.2小節(jié)依次進(jìn)樣，結(jié)果顯示，蘆丁、煙花苷、槲皮素和山柰酚含量的δRSD分別為3.5%，3.3%，3.3%和3.2%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的苦蕎麩皮黃酮富集品，分別加入一定量的蘆丁、煙花苷、槲皮素和山柰酚儲(chǔ)備液，其加入的量約相當(dāng)于樣品量的100%，每份樣品重復(fù)6次。按1.2小節(jié)條件進(jìn)樣，結(jié)果顯示，蘆丁、煙花苷、槲皮素和山柰酚的平均回收率分別為99.48%，100.86%，100.93%和102.27%，符合分析要求。δRSD分別為3.2%，3.2%，3.0%和1.7%，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3 不同大孔樹(shù)脂富集樣品檢測(cè)結(jié)果

分別取不同大孔樹(shù)脂富集的苦蕎麩皮黃酮富集品，制備待測(cè)樣品溶液，按1.2小節(jié)條件進(jìn)樣，并分析4種黃酮類化合物的含量，結(jié)果如表3所示。不同大孔樹(shù)脂富集的苦蕎麩皮黃酮富集品中蘆丁、煙花苷、槲皮素和山柰酚4種黃酮類化合物的總含量由高到低為ADS-7型大孔樹(shù)脂＞AB-8型大孔樹(shù)脂＞D101型大孔樹(shù)脂。

表3 不同大孔樹(shù)脂富集的苦蕎麩皮黃酮富集品檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

此次試驗(yàn)建立了高效液相色譜同時(shí)檢測(cè)不同大孔樹(shù)脂富集的苦蕎麩皮黃酮樣品中蘆丁、煙花苷、槲皮素和山柰酚4種黃酮類成分的含量檢測(cè)方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADS-7型大孔樹(shù)脂富集的苦蕎麩皮中4種黃酮的總含量相較AB-8和D101型大孔樹(shù)脂更高，且該方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，可作為不同大孔樹(shù)脂富集苦蕎麩皮黃酮類物質(zhì)的檢測(cè)方法。該方法為相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的質(zhì)量控制和進(jìn)一步研究提供了參考。