李 寧，李夢雅，王之盛，彭瑞琪，余海源，薛 白，王立志，鄒華圍，胡 瑞，彭全輝

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究，成都 611130）

β-胡蘿卜素是維生素 A（Vitamin A，VA）的前體物質(zhì)，其在生殖中的重要作用早在100多年前就被發(fā)現(xiàn)。全反式視黃酸（RA）是維生素A的主要活性形式，對雄性和雌性動物的繁殖功能均有重要影響。RA可通過與細(xì)胞核激素受體（RARα，RARβ和RARγ以及RXRα，RXRβ和RXRγ）結(jié)合進(jìn)而對下游基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，也可以不通過核激素受體在細(xì)胞核以外的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)通過激酶信號級聯(lián)反應(yīng)ERK1/2[1]、p38MAPK[2]以及 JNK[3]等對動物的生殖過程進(jìn)行調(diào)控。

Kisspeptin是下丘腦弓狀核中Kiss1基因編碼的蛋白質(zhì)[4]，其受體G蛋白偶聯(lián)受體54（GPR54）在促性腺激素釋放激素（GnRH）、黃體生成激素（LH）和卵泡生成素（FSH）釋放的調(diào)節(jié)方面起關(guān)鍵作用[5]。諸多報道表明，β-胡蘿卜素能改善動物繁殖性能[6-8]，但是β-胡蘿卜素通過何種激酶信號途徑調(diào)控肉牛母牛卵泡發(fā)育并不清楚。

因此，本文通過飼養(yǎng)和屠宰試驗旨在揭示β-胡蘿卜素促進(jìn)肉牛母牛卵泡發(fā)育的分子機理，為促進(jìn)肉牛卵泡發(fā)育、提高卵泡質(zhì)量，提高肉牛母牛繁殖力提供營養(yǎng)調(diào)控手段。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

β-胡蘿卜素購自成都艾凱生物科技有限公司，純度為20%。

1.2 試驗動物與試驗設(shè)計

選取12頭健康體重相近（285 kg±12.3 kg）15月齡母牛（西雜牛♂×犏?！猓S機分為2組，每組6頭。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，處理組在對照組的基礎(chǔ)上每頭每天額外添加β-胡蘿卜素1 200 mg[9]。整個試驗持續(xù)3個月。每天將β-胡蘿卜素與1 kg TMR飼糧混合均勻后撒在料槽里供牛只自由采食，保證每天牛只將混有β-胡蘿卜素的飼料全部采食。

1.3 試驗飼糧

配方設(shè)計參照中國肉牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 815-2004）[10]，飼糧組成與營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼糧組成與營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1 Ingredients and nutrient levels of the diet（air-dry basis）

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗前所有牛只都驅(qū)蟲健胃。正式試驗前預(yù)試1周，讓牛只熟悉飼養(yǎng)人員和操作流程。每天清掃牛糞。每2周牛舍消毒一次。試驗期間，牛舍溫度保持在10～25℃。

1.5 樣品的采集

在正式試驗結(jié)束的最后一天清晨8點飼喂前前腔靜脈采集血液，每隔15 min采集一次，共采集8次。-4 ℃靜置 30 min，1 500×g離心 10 min，收集血清，-20℃保存?zhèn)錅y。

采血完成后將所有12頭牛全部進(jìn)行屠宰，采集下丘腦、垂體以及卵巢等組織樣品，分裝，-80℃凍存?zhèn)錅y。

1.6 指標(biāo)測定

1.6.1 卵泡的測定

通過超聲評估（Mindray DP-2200，中國深圳）所有可見卵巢卵泡進(jìn)行量化測定和分類。卵泡分類：小卵泡：2～5 mm；中卵泡：6～10 mm；大卵泡：大于 10 mm。具體操作步驟如下：將活牛保定好，待其平靜后清除直腸糞便，初步定位子宮和卵巢。將套有避孕套的探頭用手帶入直腸，達(dá)到卵巢位置后，緊貼直腸壁掃描卵巢。按卵巢上卵泡超聲暗區(qū)從小到大再到小確定為一個卵泡。在屏幕上出現(xiàn)典型的卵泡時凍結(jié)儲存圖像，并儲存到電腦上后期做數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析[11]。

1.6.2 激素LH和FSH的測定

采用競爭抑制酶聯(lián)免疫試劑盒（武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司）檢測血清中LH和FSH水平，均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6.3 基因表達(dá)測定

用TRIZOL提取牛下丘腦、垂體以及卵巢組織中的mRNA，超微量紫外可見分光光度計（Nanohotometer TM Peal，Implen，德國）測mRNA濃度，將 mRNA 濃度調(diào)整至 500～1 200 pg/μL。通過 PrimeScritPTM RT Reaent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得下丘腦、垂體以及卵巢細(xì)胞cDNA。參考NCBI數(shù)據(jù)庫中已公布普通牛（Bos taurus）的 Kiss1、GPR54、GnRHR、EGR1、CaMKII、ERK1/2、JNK、p38、LHβ、FSHβ 和 ERα 以及GAPDH序列，通過Premier 5.0軟件設(shè)計引物，具體引物信息見表2。應(yīng)用熒光定量PCR儀（Light Cycler 480，Roche Applied Science，德國）進(jìn)行 SYBR實時熒光定量檢測。熒光定量采用SYBR Premix Ex TaqTM II試劑盒。反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqTM II 7.5 μL，模板 1 μL，上、下游引物各 0.5 μL，ddH2O 5.5 μL；反應(yīng)條件：95 ℃，預(yù)變性 5 min；95 ℃變性 10 s；退火45 s，72℃延伸35 s，循環(huán)35次。每個樣本進(jìn)行3次重復(fù)，用2-△△Ct法對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。測定基因引物見表2。

表2 繁殖軸相關(guān)基因引物信息Table 2 Primers used for reproductive axis related genes RT-PCR

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SAS 9.3對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗后進(jìn)行 t檢驗，P＜0.05 表示差異顯著，0.05≤P＜0.10 表示有顯著差異的趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-胡蘿卜素對肉牛母牛LH和FSH分泌的影響

LH分泌規(guī)律見圖1，β-胡蘿卜素組LH含量在15、60和 90 min時顯著高于對照組（P＜0.001）。由圖2可知，兩個處理采集的8個時間點血清樣品中FSH含量無顯著差異（P＞0.05）

圖1 飼糧添加β-胡蘿卜素對肉牛母牛LH分泌的影響Figure 1 Effects of β-carotene supplementation on LH secretion in beef heifer

圖2 飼糧添加β-胡蘿卜素對肉牛母牛FSH分泌的影響Figure 2 Effects of β-carotene supplementation on FSH secretion in beef heifer

2.2 β-胡蘿卜素對肉牛母牛卵泡發(fā)育的影響

飼糧添加β-胡蘿卜素對肉牛母牛卵泡發(fā)育的影響見表3，β-胡蘿卜素降低了小卵泡比例，提高了大、中卵泡比例（P＜0.001）。

表3 飼糧添加β-胡蘿卜素對肉牛母牛卵泡發(fā)育的影響Table 3 Effects of β-carotene supplementation on follicular development in beef heifer

2.3 β-胡蘿卜素對肉牛母牛繁殖軸相關(guān)基因表達(dá)的影響

對肉牛的下丘腦-垂體性腺軸相關(guān)基因進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖3。添加β-胡蘿卜素提高肉牛下丘腦中Kiss1（P＜0.001）、GPR54（P=0.032）、GnRHR（P＜0.001）、CAMKII（P＜0.001）、EGR1（P＜0.001）、ERK1/2（P＜0.001）基因表達(dá)量，對 JNK（P=0.711）和 p38MAPK（P=0.339）無顯著影響。

圖3 飼糧添加β-胡蘿卜素對肉牛母牛繁殖軸相關(guān)基因表達(dá)的影響Figure 3 Effects of β-carotene supplementation on reproductive axis related genes expression in beef heifer

2.4 β-胡蘿卜素對肉牛母牛垂體LHβ和FSHβ基因表達(dá)的影響

對肉牛的垂體中LHβ和FSHβ基因進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖4。添加β-胡蘿卜素提高肉牛下丘腦中LHβ 基因表達(dá)量（P＜0.001），對 FSHβ（P=0.322）無顯著影響。

圖4 飼糧添加β-胡蘿卜素對肉牛母牛垂體LHβ和FSHβ基因表達(dá)的影響Figure4 Effectsofβ-carotenesupplementationonpituitary LHβ and FSHβ submit genes expression in beef heifer

2.5 β-胡蘿卜素對肉牛母牛卵巢ERα基因表達(dá)的影響

對肉牛的卵巢中ERα基因進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖5。添加β-胡蘿卜素提高了肉牛卵巢中ERα基因表達(dá)量（P＜0.001）。

圖5 飼糧添加β-胡蘿卜素對肉牛母牛卵巢ERα基因表達(dá)的影響Figure 5 Effects of β-carotene supplementation on ERα gene expression in beef heifer

3 討論

動物機體繁殖功能由下丘腦-垂體-性腺軸控制。下丘腦中的Kiss1基因表達(dá)145個氨基酸殘基的kisspeptin，其活性形式與受體GPR54結(jié)合后調(diào)控GnRH神經(jīng)元釋放促性腺激素釋放激素[12]，進(jìn)而促進(jìn)垂體分泌LH、FSH等生殖激素，生殖激素與卵巢上的受體結(jié)合后啟動發(fā)情，促進(jìn)卵泡發(fā)育，提高卵泡質(zhì)量[13-14]。目前未見β-胡蘿卜素調(diào)控Kiss1和GPR54基因表達(dá)的報道。本試驗觀察到添加β-胡蘿卜素提高了GnRHR的表達(dá)。L.Flores等[15]研究表明，β-胡蘿卜素可促進(jìn)GnRH的表達(dá)和釋放，這與本試驗結(jié)果相一致。在垂體細(xì)胞中，GnRH通過蛋白激酶C和酪氨酸激酶在不同程度上能激活4個MAPK信號途徑[3]。報道表明，在垂體αT3-1細(xì)胞中，GnRH處理能提高JNK的表達(dá)，但是JNK的激活是短暫的，處理60 min后JNK表達(dá)量達(dá)到峰值，此后開始下降；GnRH處理p38MAPK在60 min達(dá)到峰值，表達(dá)只提高了2～3倍，隨后開始下降[16]。此外，ERK1/2也被激活，其表達(dá)提高了12倍。GnRH處理2 min后可以檢測到ERK磷酸化，在7 min達(dá)到峰值，并在60 min內(nèi)降至基礎(chǔ)水平[17]。本研究表明，Kiss1/GPR54激活后提高了ERK1/2表達(dá)，但是對JNK和p38MAPK無顯著影響。

有報道表明，在小鼠體垂體細(xì)胞中激活GPR54后可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)貯存的鈣離子的動員并激活ERK1/2[18]，小鼠垂體細(xì)胞（αT3-1）ERK2信號途徑受GnRH調(diào)控[19]。但是GnRH誘導(dǎo)的活化機制在不同細(xì)胞之間存在差異。在人乳突狀卵巢癌細(xì)胞（Caov-3）中，GnRHR通過結(jié)合鳥嘌呤核苷酸的G蛋白亞基（Gα）或解離的異源二聚體G蛋白（Gβγ）發(fā)出信號。在小鼠垂體瘤細(xì)胞（LβT2）細(xì)胞中，GnRH對JNK的激活不依賴于蛋白激酶C[20]。其二，GnRH脈沖模式也會影響ERK對GnRH的響應(yīng)，小鼠αT3-1細(xì)胞持續(xù)暴露于GnRH時對ERK的激活是短暫的（2 h），而脈沖式GnRH則長時間激活ERK（8 h）[21]。另有報道表明，JNK在αT3-1細(xì)胞中可以被GnRH激活，但是激活ERK和JNK的鈣離子來源不同，激活ERK的鈣離子來源于細(xì)胞外，而激活JNK的鈣離子來源于細(xì)胞內(nèi)，并且ERK對GnRH的響應(yīng)比JNK要快[16]。本試驗觀察到ERK被激活，表明β-胡蘿卜素可能是打開了細(xì)胞鈣離子通道，促進(jìn)了鈣離子向細(xì)胞內(nèi)流入。

GnRH的激活可提高細(xì)胞內(nèi)的游離鈣離子濃度，鈣離子可來源于細(xì)胞內(nèi)鈣離子儲藏，也可能通過鈣離子通道來自細(xì)胞外[22]。鈣離子濃度的升高可提高鈣調(diào)蛋白激酶II（CaMKII）表達(dá)，不管鈣離子升高的脈沖頻率是高還是低[23]。然而，快脈沖時促進(jìn)LHβ表達(dá)，慢脈沖時促進(jìn)FSHβ表達(dá)[24]。本試驗檢測到CaMKII表達(dá)升高，并且是LHβ表達(dá)升高。因此，β-胡蘿卜素可能是高頻率地提高了細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度。

早期生長反應(yīng)因子1（EGR1）是GnRH在LβT2模型中由性腺激素引起的表達(dá)最高的基因[25]，能與LHβ啟動子結(jié)合啟動轉(zhuǎn)錄[26]。GnRH通過激活EGR1而啟動LHβ表達(dá)。而誘導(dǎo)激活異源二聚體（FOS和JUN）激活蛋白1（AP1）轉(zhuǎn)錄因子則介導(dǎo) FSHβ表達(dá)。因此，本試驗觀察到的LHβ表達(dá)升高與EGR1升高有關(guān)。

LH和FSH是糖蛋白異二聚體，都是由一個共同的α亞基（Cgα或αGSU）和一個獨特的β亞基組成。α亞基基礎(chǔ)表達(dá)水平足夠高，受激素（GnRH）的影響較小[27]。FSH和LH合成與獨特的β-亞基的表達(dá)密切相關(guān)，主要在β亞基的轉(zhuǎn)錄水平上受到調(diào)節(jié)[28]。脈沖性GnRH分泌可促進(jìn)LHβ的轉(zhuǎn)錄[29]。但有報道表明，盡管山羊飼糧中添加β-胡蘿卜素可以促進(jìn)卵泡發(fā)育，但是該促進(jìn)與LH分泌無關(guān)[30]。由于LH分泌是脈沖式的，該不一致的報道可能由血清樣品的采集時間點不同所致。

雌激素受體ERα和ERβ介導(dǎo)不同的生理反應(yīng)。ERα占主導(dǎo)地位，敲除Erα的小鼠呈現(xiàn)生殖障礙[31]。本項目研究對象為母牛，只測定了ERα。結(jié)果顯示，β-胡蘿卜素的添加提高了ERα的表達(dá)。以前的報道表明，添加全反式視黃酸可以提高大鼠子宮ERα的親和力[32]，該結(jié)果與本研究一致。雌激素與受體結(jié)合進(jìn)一步促進(jìn)卵泡發(fā)育。

4 結(jié)論

飼糧額外添加β-胡蘿卜素1 200 mg/頭/天可以通過激活ERK1/2信號途徑，促進(jìn)LHβ轉(zhuǎn)錄和LH的分泌，進(jìn)而促進(jìn)卵泡發(fā)育，改善后備母牛繁殖性能。