周 力，馬博妍，高占紅，姚有莉，王志有，桂林生

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016）

羔羊具備生長發(fā)育快和可塑性強(qiáng)等特點(diǎn)[1]。但由于羔羊的生理機(jī)能尚未發(fā)育完全，日常飼喂管理稍有疏忽不僅會影響羔羊的生長發(fā)育和體質(zhì)，造成死亡率增加，還會影響成年期的體型結(jié)構(gòu)和生產(chǎn)性能。尤其是在青藏高原地區(qū)，該地區(qū)平均海拔4 000 m，嚴(yán)酷的自然環(huán)境和氣候條件導(dǎo)致牧草生長期較短，枯草期長達(dá)7個月之久[2]，故高寒以及母羊營養(yǎng)攝入?yún)T乏是造成藏羔羊死亡率高、出欄率低的主要因素。因此，通過營養(yǎng)調(diào)控減少幼畜死亡率，提高生產(chǎn)性能是高原畜牧業(yè)研究熱點(diǎn)之一。

瘤胃微生物能夠?qū)⒎雌c動物攝入的高纖維日糧進(jìn)行發(fā)酵和分解，形成揮發(fā)性脂肪酸為宿主吸收[3]，同時可以將植物性蛋白質(zhì)和非蛋白氮轉(zhuǎn)化為微生物蛋白[4]，甚至宿主所需的B族和K族維生素也主要來源于微生物的合成[5]，可見瘤胃微生物與反芻動物的生長發(fā)育和免疫功能密切關(guān)聯(lián)。前期研究證實(shí)，幼齡羔羊瘤胃微生物菌群發(fā)育受諸多因素影響，如遺傳[6]、日糧[7]、年齡[8]及外界環(huán)境[9-10]。早期瘤胃微生物區(qū)系尚未完全建立，易受日糧類型及組成變化的影響，進(jìn)而直接決定宿主的機(jī)體代謝、免疫等機(jī)能[11]。因此，結(jié)合青藏高原特有的生態(tài)環(huán)境，在保證瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的基礎(chǔ)上，對藏羔羊進(jìn)行科學(xué)補(bǔ)飼以滿足其生長發(fā)育需求具有一定的實(shí)際生產(chǎn)意義。

基于此，本研究擬通過16 S rDNA高通量測序技術(shù)，在微生物角度上闡述精料補(bǔ)飼對藏羔羊生長發(fā)育、瘤胃菌群組成的影響，為促進(jìn)其生產(chǎn)力提供理論依據(jù)和技術(shù)途徑。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

選擇年齡相近的健康斷奶藏羔羊200只（斷奶日齡為 60 d），隨機(jī)分為試驗組（T）和對照組（CK），每組100只。試驗時間為2019年3月—6月。養(yǎng)殖地點(diǎn)位于青海省海南州同德縣河北鄉(xiāng)黃河村。

1.2 試驗設(shè)計

母羊同期發(fā)情，集中配種，集中產(chǎn)羔，藏羔羊60 d斷奶，斷奶后持續(xù)育肥。對照組藏羔羊全程放牧飼喂，試驗組藏羔羊在放牧基礎(chǔ)上，第1周歸牧后每天每只藏羔羊初始補(bǔ)飼0.2 kg/d精料補(bǔ)充料，此后每周增加50 g精料補(bǔ)充料，每隔一周調(diào)整一次日糧，試驗期為120 d。對照組歸牧進(jìn)入圈舍后不進(jìn)行補(bǔ)飼。所有試驗羊放牧草場條件一致，自由飲水，歸牧?xí)r間為每天19:30。根據(jù)藏羊當(dāng)?shù)仫曫B(yǎng)的實(shí)際情況以及參照我國《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 816—2004）進(jìn)行日糧的配制，其日糧組成和營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗日糧組成和營養(yǎng)水平（干物質(zhì)）Table 1 Ingredients and chemical composition of the experimental diets（DM）%

1.3 樣品采集

試驗結(jié)束后，從試驗組和對照組中隨機(jī)選擇5只藏羔羊頸靜脈放血屠宰后，采集瘤胃內(nèi)容物于無菌離心管中，3 500 r/min離心15 min，取上清液混勻后通過4層紗布過濾，置于-80℃?zhèn)溆谩Ｍ瑫r，試驗期內(nèi)，每月測定所有藏羔羊體重、體高、體長及胸圍等生長發(fā)育指標(biāo)。

1.4 16s rDNA PCR擴(kuò)增

1.5 數(shù)據(jù)分析

SPSS 15.0統(tǒng)計軟件中采用t檢驗比較2組數(shù)據(jù)的顯著性差異，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 精料補(bǔ)飼對藏羔羊生長發(fā)育的影響

由表2可知，在試驗第30天與第60天羔羊的體重，試驗組顯著高于對照組（P＜0.05），而在試驗第90天、第120天羔羊的體重和整個試驗全期平均日增重，試驗組極顯著高于對照組（P＜0.01）。

表2 精料補(bǔ)飼對藏羔羊增重的影響Table 2 Effect of concentrate supplementation on weight gain of Tibetan lambs

由圖1可知，精料補(bǔ)飼在試驗期第60天時能顯著提高藏羔羊體斜長和胸圍（P＜0.05），另外在第120天能顯著提高藏羔羊的體斜長（P＜0.05）。

圖1 精料補(bǔ)飼對藏羔羊體尺指標(biāo)的影響Figure 1 Effect of supplementary feeding with concentrate on body size index of Tibetan lamb

2.2 測序結(jié)果

10份藏羔羊瘤胃液樣本中總共獲得原始序列825 481條，其中有效序列818 295條，序列度蓋度為99.13%。Shannon稀釋曲線在數(shù)據(jù)量為5000以上時呈現(xiàn)平緩趨勢，表明測序深度及數(shù)據(jù)量趨于飽和（圖2-A）。相似度大于97%的有效序列聚類為3366個OTU，其中2 192個OTU為2組藏羔羊共有，576個OTU為對照組獨(dú)有，598個OTU為試驗組獨(dú)有（圖2-B）。

圖2 樣品稀釋曲線（A）和OUT韋恩圖（B）Figure 2 Rarefaction curve of sample(A)and OTUs Venn diagram(B)

2.3 瘤胃細(xì)菌相對豐度

由表3可知，在門水平下，擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）以及疣微菌門（Verrucomicrobia）相對豐度較高，分別占細(xì)菌總量的56.68%，17.80%以及12.81%，為優(yōu)勢菌門。通過對比排名前10菌門的差異發(fā)現(xiàn)，2組藏羔羊瘤胃細(xì)菌的3個優(yōu)勢菌門差異并不顯著（P＞0.05）。

表3 門水平下瘤胃細(xì)菌相對含量Table 3 Relative bacterial content at Phylum level

由表4可知，在屬水平上，普雷沃菌屬_1（Prevotella_1）、理研菌科 RC9腸道群（Rikenellaceae_RC9_gut_group）、普雷沃氏菌科 _UCG-001（Prevotellaceae_UCG-001）、普雷沃氏菌科 _UCG-003（Prevotellaceae_UCG-003）和瘤胃球菌科_UCG-014（Ruminococcaceae_UCG-014）為藏羊瘤胃微生物優(yōu)勢菌屬，比例分別為21.77%，10.45%，3.88%，2.37%和2.06%。通過對比2組的優(yōu)勢菌屬發(fā)現(xiàn)，對照組的瘤胃球菌科_UCG-014的豐度顯著高于試驗組（P＜0.05）。

表4 屬水平上瘤胃細(xì)菌相對含量Table 4 Relative bacterial content at genus level

2.4 瘤胃微生物Alpha多樣性

應(yīng)用t檢驗法對Alpha多樣性中Chao1、Ace、Shannon和Simpson等指數(shù)進(jìn)行分析，表5結(jié)果顯示，對照組的Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)顯著高于試驗組（P＜0.05）。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)方面，2組之間差異不顯著（P＞0.05）。

表5 瘤胃細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)Table 5 Alpha diversity indexes of rumen bacteria

2.5 瘤胃細(xì)菌Beta多樣性

基于Unifrac算法在 OTU水平上對瘤胃細(xì)菌進(jìn)行 Principal co-ordinates analysis（PCoA），圖 3-A結(jié)果顯示，2組藏羊聚類明顯，說明精料補(bǔ)飼對藏羔羊瘤胃細(xì)菌區(qū)系存在具有顯著的影響。此外，對2組藏羔羊樣本進(jìn)行Nonmetric Multidimensional Scaling（NMDS）分析，結(jié)果進(jìn)一步佐證了2組藏羔羊瘤胃細(xì)菌區(qū)系差異明顯（圖3-B）。

圖3 Beta多樣性分析Figure 3 Analysis of Beta diversity

2.6 功能預(yù)測

利用Tax4Fun軟件進(jìn)行KEGG Pathway的功能性注釋，結(jié)果如圖4所示，2組藏羔羊瘤胃微生物主要富集于碳水化合物代謝（carbohydrate metabolism）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（signal transduction）、氨基酸代謝（amino acid metabolism）、核苷酸代謝（nucleotide metabolism）、輔因子和維生素代謝（metabolism of cofactors and vitamins）、能量代謝（energy metabolism）、翻譯（translation）等功能通路。

3 討論與結(jié)論

3.1 精料補(bǔ)飼對藏羔羊生長發(fā)育的影響

青藏高原惡劣的氣候環(huán)境導(dǎo)致枯草期長達(dá)7個月，而剛斷奶的羔羊營養(yǎng)攝入需求最為旺盛，因此科學(xué)補(bǔ)飼是維持羔羊生長發(fā)育必不可少的生產(chǎn)環(huán)節(jié)[12]。殷雨洋等[13]研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)飼顆粒飼料能夠促進(jìn)斷奶羔羊的體重和干物質(zhì)采食量、改善羊肉品質(zhì)，同時增加湖羊養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。此外，通過對比自然放牧與放牧補(bǔ)飼的2組雜交羊發(fā)現(xiàn)，精料補(bǔ)飼能夠顯著促進(jìn)羔羊生長發(fā)育速度，同時提高胴體重、屠宰率以及凈肉率等屠宰性能[14]。本研究中，放牧基礎(chǔ)上補(bǔ)飼精料補(bǔ)充料，不僅能夠提高藏羔羊的體重，還能顯著增加其體高和胸圍等生長發(fā)育指標(biāo)，這與上述研究結(jié)果基本一致。推測可能存在2方面原因，首先幼齡反芻動物早期補(bǔ)充精料補(bǔ)充料能夠改變其肌肉中能量代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平，有助于提升成肌細(xì)胞的增殖潛力以及肌肉增長速度[15]。其次，補(bǔ)飼精料補(bǔ)充料為瘤胃微生物提供更為充足的碳源和氮源，維持瘤胃的正常功能，保證宿主對營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收效率[16]。

3.2 精料補(bǔ)飼對藏羔羊瘤胃細(xì)菌菌落豐度的影響

本試驗通過多樣性分析發(fā)現(xiàn)對照組的Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)顯著高于試驗組，說明對照組藏羔羊瘤胃細(xì)菌較處理組豐富。Li R.H.等[17]發(fā)現(xiàn)，高精料補(bǔ)充料日糧能夠顯著提高荷斯坦奶牛瘤胃OTUs數(shù)量，同時降低細(xì)菌α多樣性中Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)[18]。此外，荷斯坦母牛日糧中精料比例與瘤胃中總揮發(fā)性脂肪酸（total volatile fatty acids，TVFA）、NH3-N含量以及細(xì)菌Chao1指數(shù)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系[19]。這與本研究結(jié)果基本相似，盡管日糧中精料補(bǔ)充料能夠為瘤胃微生物提供更多的蛋白以及碳水化合物，維持其生長量需求[20]。但是，伴隨著精料補(bǔ)充料的增加，非結(jié)構(gòu)碳水化合物同樣會隨著增加，導(dǎo)致瘤胃產(chǎn)生乳酸和揮發(fā)性脂肪酸的大量生成，一定程度上降低了pH值，抑制瘤胃中酸敏感菌落的活性[21]。

圖4 KEGG注釋分布圖Figure 4 Distribution graph of KEGG annotation

3.3 精料補(bǔ)飼對藏羔羊瘤胃微生物菌落結(jié)構(gòu)的影響

反芻動物與瘤胃微生物之間為共生關(guān)系，宿主為瘤胃微生物的生長發(fā)育提供合適的內(nèi)環(huán)境以及營養(yǎng)物質(zhì)，而微生物則將高纖維飼料發(fā)酵分解為諸多營養(yǎng)物質(zhì)，為宿主吸收利用[22]。基于16 SrDNA高通量測序技術(shù)，本研究結(jié)果揭示，藏羔羊瘤胃微生物優(yōu)勢菌群分別是擬桿菌門和厚壁菌門，其相對豐度分別為56.68%和17.80%。結(jié)果與Liu K.Z.等[23]在山羊瘤胃微生物的研究結(jié)果一致。研究證實(shí)，細(xì)菌源瘤胃纖維素酶主要來源于瘤胃球菌，能夠吸附并降解飼料中植物細(xì)胞壁，有效提升高纖維含量飼料的利用率[24]。以荷斯坦奶牛為研究目標(biāo)，Wang L.J.等[25]證實(shí)，日糧中精料補(bǔ)充料能夠顯著降低瘤胃細(xì)菌中瘤胃球菌科_UCG-014的相對豐度，與本研究結(jié)果一致。我們推測粗纖維構(gòu)成的日糧能夠為瘤胃球菌提供更多且更有效的結(jié)合基質(zhì)。這可能與瘤胃球菌能夠產(chǎn)生淀粉酶和纖維素酶等降解酶，用于破壞粗纖維細(xì)胞壁，更好地實(shí)現(xiàn)對碳水化合物分解發(fā)酵有關(guān)。

綜上，精料補(bǔ)充料補(bǔ)飼能夠顯著提高藏羔羊的平均日增重，此外，盡管精料補(bǔ)充料補(bǔ)飼會造成藏羔羊瘤胃細(xì)菌的豐富度的降低，但對瘤胃優(yōu)勢菌群門水平的相對豐度并無顯著影響，這說明適量補(bǔ)飼精料補(bǔ)充料在不影響羔羊瘤胃微生物區(qū)系的基礎(chǔ)上，能更好地發(fā)揮其生產(chǎn)性能。