宗凱 盛旋 呂俠影 程瀟 李云飛 孫娟娟 李克娟 余曉峰 姚劍

摘要?對(duì)26份水稻材料進(jìn)行抗病基因檢測(cè)，包括8個(gè)白葉枯病抗性基因（Xa1、 xa5、 Xa7、xa13、 Xa21、 Xa23、 Xa26、 Xa27）和2個(gè)稻飛虱病抗性基因（Bph14、 Bph15）。其中23份水稻材料中含有Xa1基因材料20份，含xa5基因材料20份，含Xa7基因材料23份，含xa13基因材料12份，含 Xa21基因材料9份，含 Xa23基因材料23份，其中抗性4份，感性19份，含Xa26基因材料23份，含Xa27基因材料21份，其中抗性5份，感性16份。另有3份材料進(jìn)行稻飛虱病抗性基因Bph14、Bph15檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明這3份材料均含有Bph14、Bph15基因。選取13個(gè)已報(bào)道的基因標(biāo)記或連鎖標(biāo)記檢測(cè)26份雜交稻材料，初步確定了其抗白葉枯病和抗稻飛虱病等位基因分布和利用情況，為水稻基礎(chǔ)材料的篩選、親本材料的選擇及育種應(yīng)用提供了良好的參考。

關(guān)鍵詞?水稻品系;抗性基因;白葉枯病;鑒定

中圖分類號(hào)?S435.11?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A?文章編號(hào)?0517-6611（2021）01-0088-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.01.023

Abstract?Twenty-six rice varieties were tested for disease resistance genes， including eight bacterial blight resistance genes （Xa1， xa5， Xa7， xa13， Xa21， Xa23， Xa26， Xa27） and two rice planthopper disease resistance genes （Bph14， Bph15）. Among them， 23 rice materials contained 20 Xa1 genetic materials， 20 xa5 genetic materials， 23 Xa7 genetic materials， 12 xa13 genetic materials， 9 Xa21 genetic materials， 23 Xa23 genetic materials， including 4 resistance， 19 susceptibility， 23 Xa26 genetic materials and 21 Xa27 genetic materials， including 5 resistance and 16 susceptibility. Three other materials were tested for Bph14 and Bph15 genes of rice planthopper disease resistance. The results showed that all the three materials contained Bph14 and Bph15 genes. The distribution and utilization of alleles for resistance to bacterial blight and rice planthopper disease in 26 hybrid rice materials were preliminarily determined by screening 13 reported gene markers or linkage markers， which provided a good reference for screening basic rice materials， selection of parent materials and breeding application.

Key words?Rice strains;Resistance gene;Bacterial blight;Identification

水稻是我國重要的主糧之一，而白葉枯病和稻飛虱病是水稻生產(chǎn)中重要的，也是常見的病蟲害[1-2]，針對(duì)這2種病蟲害的抗性基因定位和克隆一直備受關(guān)注。目前已有超過26個(gè)白葉枯病抗性基因和20個(gè)褐稻飛虱病抗性基因被定位，其中7個(gè)白葉枯病抗性基因和1個(gè)褐稻飛虱病抗性基因已經(jīng)被克隆，與此同時(shí)，與這些抗性基因緊密連鎖或者共分離的分子標(biāo)記被開發(fā)出來，利用這些已鑒定的分子標(biāo)記可以快速準(zhǔn)確地篩選和鑒定出水稻材料中所含的抗性基因類型，輔助水稻育種親本材料的篩選，顯著加速育種過程。該研究篩選8個(gè)白葉枯病抗性基因（Xa1、xa5、Xa7、xa13、Xa21、Xa23、Xa26、Xa27）和2個(gè)稻飛虱病抗性基因（Bph14、Bph15）的分子標(biāo)記，對(duì)26份雜交稻親本材料所含抗性基因以及其等位基因分布情況進(jìn)行鑒定和分析，以期為水稻后續(xù)育種提供參考。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

水稻材料由安徽袁氏農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，共計(jì)26個(gè)水稻品系種子（美1、孟R、9311、578、513、小提供灰21、OM6162、繁殖1、繁殖2、馬粘、玉香、AD2168、NGGYEN、巴馬、華素、泰早、孟紅、鎮(zhèn)稻18、豐兩優(yōu)秀1號(hào)、豐兩優(yōu)秀6號(hào)、豐兩優(yōu)秀4號(hào)、鎮(zhèn)稻19、普通野生稻、W644、S234、234）。

1.2?儀器與設(shè)備

PCR儀，美國ABI公司;DNA/RNA分析系統(tǒng)，德國QIAGEN公司。

1.3?方法

鑒定白葉枯抗性基因Xa1、xa5、Xa7、xa13、Xa21、Xa23、Xa26、Xa27這8個(gè)基因所用分子標(biāo)記來自文獻(xiàn)[3，5]（表1）。鑒定2個(gè)稻飛虱病抗性基因Bph14、Bph15所用分子標(biāo)記來自文獻(xiàn)[6-7]（表2）。種子DNA提取采用磁珠全自動(dòng)核酸提取儀。

2?結(jié)果與分析

2.1?23份水稻材料白葉枯病抗性基因檢測(cè)結(jié)果

Xa1是已克隆的NBS-LRR類白葉枯病抗性基因，在NCBI中基因ID為AB002266.1，采用Xa1-F和Xa1-R這對(duì)連鎖標(biāo)記對(duì)23個(gè)水稻品系進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖1（A）。除9號(hào)、10號(hào)、13號(hào)未檢測(cè)到抗性基因外，其他均檢出Xa1抗性基因。其中1號(hào)擴(kuò)出2條目的帶，一條與抗性等位基因目的帶在相同位置，另一條則比抗性等位基因目的帶大約100 bp。11號(hào)、12號(hào)、19～21號(hào)、23號(hào)均存在2條目的帶，推測(cè)除檢出與抗性對(duì)照等位基因的目的帶外還存在另一等位基因。

xa5位于5號(hào)染色體，cDNA全長906 bp，包含3個(gè)外顯子，編碼一個(gè)由106個(gè)氨基酸組成的蛋白產(chǎn)物，xa5是一個(gè)隱性抗病基因，其基因結(jié)構(gòu)與其他典型抗病基因的結(jié)構(gòu)都不一樣。xa5序列在抗病和感病品種中有2個(gè)堿基的差異（GTC→GAG），導(dǎo)致第39位氨基酸的改變[纈氨酸（V）變成谷氨酸（E）]。xa5所用的分子標(biāo)記檢出除2～4號(hào)未擴(kuò)出，其他均擴(kuò)出，見圖1（B）。經(jīng)測(cè)序1號(hào)、5～23號(hào)在第39位編碼的是纈氨酸（V），為抗性品系。

1～23份水稻材料均擴(kuò)出抗性基因Xa7，見圖1（C），11～12號(hào)樣品產(chǎn)物條帶較淡，5～7號(hào)擴(kuò)增產(chǎn)物大小與其他不一致，對(duì)5～7號(hào)樣品擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)5號(hào)和7號(hào)樣品產(chǎn)物測(cè)序比對(duì)后基因序列基本一致，6號(hào)在2個(gè)位置與5號(hào)、7號(hào)存在差異，在接近5端6號(hào)多1個(gè)G，在接近3端6號(hào)與5號(hào)、7號(hào)存在微略差異：“CCCCGTCCGGCATCTA” →“GCCCGCCCGGCAT”。

xa13是1個(gè)隱性抗白葉枯病基因，cDNA 全長1 516 bp，包含5個(gè)外顯子，編碼1個(gè)由307個(gè)氨基酸組成、含有跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白產(chǎn)物。所采用的分子標(biāo)記能通過擴(kuò)增目的帶片段長度區(qū)分抗與感系品種，經(jīng)檢測(cè)6號(hào)、9～16號(hào)、19～20號(hào)均為感系品種。其他樣品未擴(kuò)出目的基因，見圖1（D）。

Xa21編碼產(chǎn)物是1個(gè)由1 025個(gè)氨基酸組成的類受體蛋白激酶，采用Xa21-F和Xa21-R分子標(biāo)記擴(kuò)增Xa21抗性基因產(chǎn)物長度為1 399 bp，感性基因擴(kuò)增產(chǎn)物長度為1 274 bp，經(jīng)基因測(cè)序判斷，樣品1號(hào)、3號(hào)、5～6號(hào)、8～9號(hào)、13號(hào)、17號(hào)、22號(hào)均檢出感性等位基因，見圖1（E）。

Xa23基因來自普通野生稻的抗白葉枯病基因，具有廣譜抗性。Xa23-P23F 和Xa23-P23R這對(duì)分子標(biāo)記擴(kuò)增抗性基因片段為474 bp，感性基因?yàn)?00 bp，通過電泳結(jié)果可以判斷8號(hào)、14號(hào)、22～23號(hào)檢出抗性基因，其他樣品含感性基因，見圖1（F）。

Xa26基因所用分子標(biāo)記對(duì)23個(gè)品系水稻進(jìn)行檢測(cè)均擴(kuò)出目的帶，見圖1（G），部分品系存在多條目的帶，部分條帶存在深淺差異，挑取部分樣品進(jìn)行測(cè)序（1～6號(hào)、9～10號(hào)、18號(hào)、22號(hào)），經(jīng)比對(duì)測(cè)序序列同源性在95%以上。

Xa27cDNA 全長2 361 bp，僅含有1個(gè)外顯子，編碼1個(gè)由113個(gè)氨基酸組成的亞基，Xa27的編碼序列在感病品種IR24 和抗病品種IRBB27 中完全一樣，只是啟動(dòng)子區(qū)有2處差別，與IRBB27 相比，IR24 中的Xa27啟動(dòng)子在ATG 上游1.4 kb 左右多出一段10 bp 的序列，另外在TA 框前多出25 bp 的序列，Xa27所用分子標(biāo)記正好設(shè)計(jì)在這個(gè)位置，可以通過擴(kuò)增片段差異區(qū)別抗、感性基因，1號(hào)、6號(hào)、14號(hào)、17～18號(hào)檢出抗性等位基因，3～5號(hào)、7～13號(hào)、15～16號(hào)、19～21號(hào)、23號(hào)檢出感性等位基因，見圖1（H）。

2.2?3份水稻材料稻飛虱抗性基因檢測(cè)結(jié)果

W644、S234、234這3份樣品經(jīng)Bph14和Bph15這5對(duì)分子標(biāo)記檢測(cè)，均擴(kuò)出目標(biāo)抗性基因（圖2），W644與S234、234在Bph15-F和Bph15-R這對(duì)分子標(biāo)記擴(kuò)增下存在多態(tài)性。

從表3可以看出，23份水稻材料中含Xa1和xa5抗性基因的各有20份，占比87.0%;含有Xa7和Xa26基因的均為23份，占比100%;含xa13基因12份，占比52.2%，均為感性基因;含Xa21基因9份，占比39.1%，均為感性基因;含有Xa23抗性基因4份，感性基因19份，分別占比17.4%和82.6%;含有Xa27抗性基因5份，感性基因16份，分別占比21.7%和69.6%。另外3份水稻均含有抗稻飛虱Bph14和Bph15基因。

從表3還可以看出，大部分水稻材料均含有2個(gè)以上的白葉枯病抗性基因，其中美1、小提供灰21、繁殖1、巴馬、孟紅、鎮(zhèn)稻18、鎮(zhèn)稻19、普通野生稻等含有5個(gè)以上白葉枯病抗性基因（Xa1、xa5、Xa7、Xa23、Xa26和Xa27），513、OM6162、玉香、AD2168、華素、泰早、豐兩優(yōu)秀1號(hào)、豐兩優(yōu)秀6號(hào)、豐兩優(yōu)秀4號(hào)等含有4個(gè)白葉枯病抗性基因，孟R、9311、578、繁殖2、馬粘、NGGYEN含有3個(gè)白葉枯病抗性基因。

3?結(jié)論

分子標(biāo)記是一種非常方便、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確有效的篩選抗病基因的方法，對(duì)于現(xiàn)代育種意義重大[8-9]，它可以縮短育種周期，篩選育種親本和后代，給水稻育種提供明確的育種方向和指導(dǎo)。該研究選取多個(gè)白葉枯病抗性基因和稻飛虱抗性基因特異性分子標(biāo)記，對(duì)26份水稻材料中含有抗性基因類型進(jìn)行檢測(cè)，為后續(xù)水稻常規(guī)育種中親本選擇、育種組合配置以及不同抗性基因聚合等奠定了基礎(chǔ)[10-11]。

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