吳曉娟，王曉嬋，張佳妮，沈佳麗，李 依，金曼芹，吳 偉

（中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 稻谷及副產(chǎn)物深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

米糠蛋白作為一種豐富而廉價(jià)的植物蛋白資源，因其過(guò)敏性低、氨基酸組成合理、生物效價(jià)高以及較好的生理活性，可作為功能因子應(yīng)用于食品和醫(yī)藥工業(yè)中[1-2]。米糠蛋白還具有良好的溶解性和乳化性，是一種潛在的天然食品乳化劑，可作為配料應(yīng)用于飲料、肉制品和焙烤制品中[2]。鑒于米糠蛋白良好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及其在食品開(kāi)發(fā)中的新興潛力，目前越來(lái)越多研究聚焦于采用新的提取方法或改性方法拓展其功能性質(zhì)及應(yīng)用領(lǐng)域[3]。米糠蛋白的功能性質(zhì)與其結(jié)構(gòu)特征密切相關(guān)，例如：米糠蛋白的持水性和持油性與蛋白質(zhì)表面電荷、極性氨基酸、表面疏水性等密切相關(guān)；乳化性和乳化穩(wěn)定性與蛋白分子柔性、分子質(zhì)量大小等密切相關(guān)；起泡性和起泡穩(wěn)定性不僅與表面電荷、極性氨基酸等相關(guān)，還受無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)變化影響[4-5]。pH值偏移是一種操作簡(jiǎn)單、成本低廉并且效果顯著的改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及改善蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的方法。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)暴露在極端pH值條件下時(shí)，其亞基結(jié)構(gòu)、表面疏水性、內(nèi)源色氨酸熒光強(qiáng)度等結(jié)構(gòu)特征會(huì)發(fā)生變化，使之處于變性與未變性之間的熔球態(tài)，處于熔球態(tài)的蛋白質(zhì)的部分功能性質(zhì)會(huì)發(fā)生一定程度的改善[6-8]。pH值偏移處理尤其是堿性偏移，可以顯著改善植物蛋白（大豆蛋白、豌豆蛋白等）的凝膠性和成膜性[8-9]。近年來(lái)，部分研究還側(cè)重于將不同的蛋白質(zhì)改性方法相結(jié)合，以期獲得更加精準(zhǔn)的蛋白質(zhì)功能性質(zhì)定向調(diào)控方法。例如，王健等[10]通過(guò)對(duì)大豆蛋白進(jìn)行pH值酸堿偏移結(jié)合熱處理，揭示了蛋白質(zhì)分子柔性在功能性質(zhì)中的作用。鑒于米糠蛋白在堿溶液中良好的溶解度以及較低的變性溫度（約70 ℃）[7]，本實(shí)驗(yàn)擬研究pH值堿性偏移（pH 11）結(jié)合溫和熱處理（50、60 ℃）對(duì)米糠蛋白結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響，以期獲得一種簡(jiǎn)便有效的米糠蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的調(diào)控方法，為合理開(kāi)發(fā)米糠蛋白提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂米糠 連云港瑾宏生物科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)分子蛋白（14～100 ku） 上海生物化學(xué)研究所；1-苯氨基萘-8-磺酸、5,5’-二硫代二硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tr i s）等試劑均為分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

IRTracer-100傅里葉變換紅外光譜儀、LC-20液相色譜儀 日本島津公司；F4600熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；Blue Star紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京萊伯泰科儀器股份公司；Nano ZS納米粒度分析儀 英國(guó)Malvern公司。

1.3 方法

1.3.1 米糠蛋白制備

參考吳偉等[11]方法，將100 g脫脂米糠與1 000 mL去離子水混合，用2 mol/L NaOH溶液將混合液調(diào)至pH 9.0，40 ℃、120 r/min水浴攪拌4 h，然后4 ℃、8 000 r/min離心20 min。取上清液用2 mol/L HCl溶液調(diào)至pH 4.0，靜置20 min，待出現(xiàn)明顯沉淀后4 ℃、8 000 r/min離心15 min。水洗沉淀并4 ℃、8 000 r/min離心15 min，重復(fù)2 次。隨后用去離子水分散蛋白沉淀，并用2 mol/L HCl溶液調(diào)至pH 7.0，冷凍干燥得到米糠蛋白。

1.3.2 米糠蛋白處理

參考Jiang Jiang[8]和耿蕊[12]等的方法對(duì)米糠蛋白進(jìn)行pH值堿性偏移結(jié)合熱處理。用去離子水將米糠蛋白配制成20 mg/mL的蛋白溶液（對(duì)照），用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)蛋白溶液至pH 11，將溫度分別設(shè)定為室溫（25 ℃）、50、60 ℃，水浴加熱蛋白溶液1、3、5 h。然后采用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)蛋白溶液至pH 7.0，保溫1 h后再調(diào)至pH 4.0，用去離子水洗滌沉淀3 次。最后用去離子水分散離心后的蛋白沉淀，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)至pH 7.0，冷凍干燥得到處理后的米糠蛋白樣品。

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜分析

參考Liu Yongle等[13]方法，取米糠蛋白樣品2 mg與200 mg KBr研磨成粉末，混合均勻，用壓片機(jī)壓片3～5 min，制成透明薄片，用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行掃描，波數(shù)范圍400～4 000 cm-1，掃描次數(shù)64，分辨率4 cm-1。

1.3.4 游離巰基和總巰基含量測(cè)定

將米糠蛋白樣品配制成質(zhì)量濃度20 mg/mL的待測(cè)蛋白溶液，溶液中蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測(cè)定。參考Huang Youru等[14]的方法，采用DTNB比色法測(cè)定米糠蛋白的游離巰基和總巰基含量。

1.3.5 分子質(zhì)量分布測(cè)定

將米糠蛋白樣品配制成10 mg/mL的蛋白溶液，過(guò)孔徑0.45 μm的醋酸纖維素膜，對(duì)濾液采用LC-20A高效液相色譜儀進(jìn)行分析。色譜條件：色譜柱：TSKgel SW G4000 SWXL；檢測(cè)器：Waters 996光電二極管陣列檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；柱溫25 ℃；流動(dòng)相：0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2，含0.05 mol/L NaCl）；流速1 mL/min。將蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品配制成10 mg/mL溶液，采用高效液相色譜儀在同樣條件下進(jìn)行分析，以保留時(shí)間為x軸，相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)為y軸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=-0.312 8x+8.517 1（R2=0.990 2），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計(jì)算得到不同保留時(shí)間米糠蛋白組分的相對(duì)分子質(zhì)量。

1.3.6 粒徑分布測(cè)定

將米糠蛋白樣品配制成1 mg/mL的蛋白溶液，在25 ℃條件下采用納米粒度分析儀測(cè)定米糠蛋白溶液的粒徑分布。

1.3.7 十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

參考吳偉等[11]的測(cè)定方法，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為12.5%的分離膠和4%的濃縮膠，含有0.05 mol/L Tris-0.384 mol/L甘氨酸、0.1% SDS（pH 8.3）的電極緩沖液。在燒杯中分別加入10% SDS、5 mLβ-巰基乙醇、10 mL甘油、20 mg溴酚藍(lán)、20 mL 0.05 mol/L pH 8.0 Tris-HCl緩沖液，最后加水至總體積100 mL，配制成樣品溶解液，再把米糠蛋白溶于樣品溶解液中配成1.5 mg/mL的電泳樣品。上樣量10 μL，起始電流10 mA，樣品進(jìn)入分離膠后增大到25 mA。

1.3.8 內(nèi)源熒光光譜分析

參考Wu Wei等[15]方法。將米糠蛋白樣品用去離子水稀釋成0.1 mg/mL的蛋白溶液，采用F-4600型熒光光譜儀在激發(fā)波長(zhǎng)280 nm下掃描300～500 nm之間的發(fā)射光譜（狹縫寬度2.5；靈敏度為1），以去離子水為空白。

1.3.9 表面疏水性測(cè)定

參考Wu Wei等[15]方法，將米糠蛋白樣品用去離子水配制成20 mg/mL的蛋白溶液，再將其稀釋為0.005～0.50 mg/mL之間5 個(gè)不同質(zhì)量濃度梯度的蛋白溶液。在試管中分別加入不同質(zhì)量濃度的蛋白溶液4 mL和8 mmol/L 1-苯氨基萘-8-磺酸溶液50 μL，激發(fā)波長(zhǎng)390 nm、發(fā)射波長(zhǎng)470 nm下測(cè)定熒光強(qiáng)度。以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，米糠蛋白表面疏水指數(shù)即曲線初始階段的斜率。

1.3.10 溶解性測(cè)定

將米糠蛋白樣品10 mg/mL分散于去離子水中，室溫條件磁力攪拌2 h后，8 000 r/min離心20 min，收集上清液，隨后采用微量凱氏定氮法測(cè)定上清液中可溶解氮含量，溶解性表示為可溶解氮與樣品中總氮的百分比。

1.3.11 持水性和持油性測(cè)定

參考Benelhadi等[16]方法，將1.0 g米糠蛋白與10 mL蒸餾水或精制大豆油充分混合，3 000 r/min離心20 min，將蒸餾水或大豆油排干30 min后測(cè)定樣品質(zhì)量，以每單位質(zhì)量米糠蛋白吸收水或油的質(zhì)量分別表示其持水性和持油性。

1.3.12 起泡性和泡沫穩(wěn)定性測(cè)定

參考Kamara等[17]方法，將200 mg米糠蛋白用0.05 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液配制成10 mg/mL的溶液，10 000 r/min均質(zhì)30 s，重復(fù)3 次，測(cè)量均質(zhì)后的體積V0，靜置30 min后測(cè)量泡沫體積V1。計(jì)算公式如下：

1.3.13 乳化性和乳化穩(wěn)定性測(cè)定

參 考M o l i n a 等[18]方 法，取1 2 m L 蛋 白 溶 液（1 mg/mL）和4 mL大豆油混合，在10 000 r/min均質(zhì)2 min，取100 μL米糠蛋白-大豆油乳狀液與5 mL 0.1% SDS用渦流振蕩器混合均勻，在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。計(jì)算公式如下：

式中：N為稀釋倍數(shù)；C為樣品溶解液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（g/mL）；φ為油相占比/%；A0和A30分別為乳液在第0和30分鐘時(shí)的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2010和Origin 7.5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果用s表示，重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值堿性偏移結(jié)合熱處理對(duì)米糠蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

傅里葉變換紅外光譜是分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的主要技術(shù)之一，特別是酰胺I帶（1 700～1 600 cm-1），是表征蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)最常用的特征頻率區(qū)域[19]。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化會(huì)影響其表面疏水性和柔性，進(jìn)而影響功能性質(zhì)[20]。參考Sun Weizheng等[21]的方法對(duì)pH 11偏移以及結(jié)合熱處理的米糠蛋白去卷積酰胺I帶吸收光譜進(jìn)行Gaussian擬合，得到11 個(gè)特征吸收峰（表1）。1 609 cm-1是由氨基酸側(cè)鏈（尤其是酪氨酸殘基等）產(chǎn)生的特征吸收峰[21]。1 610～1 628 cm-1的特征吸收峰通常被認(rèn)為是β-折疊平行排列產(chǎn)生的，而1 630～1 640 cm-1和1 675～1 695 cm-1的特征吸收峰則被認(rèn)為是β-折疊反平行排列產(chǎn)生的[22]。1 653 cm-1的強(qiáng)吸收峰是α-螺旋結(jié)構(gòu)的C＝O伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的[21,23]。1 671 cm-1的特征吸收峰可歸屬于β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，而1 646 cm-1和1 662 cm-1的特征吸收峰被認(rèn)為是無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的[24]。結(jié)果顯示，相比于未處理的米糠蛋白，pH 11偏移處理使得米糠蛋白β-折疊含量明顯降低，α-螺旋含量略微降低，無(wú)規(guī)卷曲、β-轉(zhuǎn)角和氨基酸側(cè)鏈結(jié)構(gòu)含量有所增加。pH值會(huì)改變蛋白表面帶電氨基酸、α-羰基和α-氨基末端質(zhì)子化狀態(tài)，影響蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，促使蛋白質(zhì)分子展開(kāi)，這可能是導(dǎo)致米糠蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)從有序向無(wú)序轉(zhuǎn)化的主要原因[25]。相比于pH值堿性偏移處理，pH值堿性偏移結(jié)合熱處理1 h的米糠蛋白β-折疊含量顯著升高（P＜0.05），無(wú)規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角的含量顯著降低（P＜0.05）；當(dāng)加熱時(shí)間延長(zhǎng)到3 h時(shí)，米糠蛋白β-折疊含量顯著降低（P＜0.05），無(wú)規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角的含量顯著升高（P＜0.05）；當(dāng)加熱時(shí)間延長(zhǎng)到5 h時(shí)，米糠蛋白β-折疊含量增加到44%左右，無(wú)規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角的含量又隨之下降。在蛋白質(zhì)處于極端堿性環(huán)境中，由于堿的作用使蛋白質(zhì)分子展開(kāi)，暴露出蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)，暴露出來(lái)的疏水基團(tuán)又因?yàn)橄嗷プ饔枚奂划?dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于加熱環(huán)境中時(shí)，溫度升高導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子展開(kāi)，然后通過(guò)疏水作用、氫鍵、二硫鍵等相互作用而聚集[26]。因而，pH 11偏移結(jié)合熱處理時(shí)，米糠蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)折疊-去折疊-復(fù)折疊的復(fù)雜變化過(guò)程。

表1 pH值堿性偏移結(jié)合熱處理對(duì)米糠蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Table 1 Effects of alkaline pH-shifting combined with heating treatment on the secondary structures of rice bran protein

2.2 pH值堿性偏移結(jié)合熱處理對(duì)米糠蛋白游離巰基和總巰基含量的影響

pH 11偏移以及結(jié)合熱處理的米糠蛋白巰基變化如表2所示，相比于未處理的米糠蛋白，單獨(dú)pH值堿性偏移以及結(jié)合熱處理的米糠蛋白總巰基和游離巰基含量均顯著下降（P＜0.05）。pH值偏移處理大豆蛋白的研究表明，隨著堿性pH值增加，巰基通過(guò)去質(zhì)子化而形成硫醇化合物，并且堿性環(huán)境會(huì)加速巰基氧化[27]，這可能也是造成米糠蛋白在堿性偏移條件下巰基含量下降的原因。單獨(dú)采用pH值堿性偏移處理時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，米糠蛋白游離巰基和總巰基含量都略微增加。通常巰基含量的增加主要有2 種原因：一是蛋白質(zhì)亞基解離，導(dǎo)致二硫鍵斷裂形成新的巰基；二是蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)展開(kāi)，暴露出新的巰基[10]。結(jié)合傅里葉變換紅外光譜中呈現(xiàn)的氨基酸側(cè)鏈和無(wú)序結(jié)構(gòu)含量略微增加等現(xiàn)象，推斷極端pH值條件下蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降導(dǎo)致部分側(cè)鏈結(jié)構(gòu)展開(kāi)重排是引起巰基含量增加的重要因素。從表2還發(fā)現(xiàn)，相比于單獨(dú)pH值偏移處理的米糠蛋白，結(jié)合熱處理的米糠蛋白游離巰基含量更低，并且隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，游離巰基含量進(jìn)一步下降。加熱條件下蛋白質(zhì)游離巰基更易被氧化形成分子間二硫鍵[28]。蛋白質(zhì)巰基氧化是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，巰基通常先被自由基攻擊生成亞磺酰自由基，隨后再與分子氧形成硫醇自由基，然后繼續(xù)氧化形成二硫鍵，這一階段是可逆氧化反應(yīng)，而不可逆氧化反應(yīng)則進(jìn)一步生成亞磺酸、磺酸等[29]。隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，米糠蛋白總巰基含量也呈略微下降的趨勢(shì)，由此可見(jiàn)，pH值堿性偏移結(jié)合熱處理米糠蛋白，不僅使游離巰基氧化形成分子間二硫鍵，還生成了一些不可逆的含硫化合物。

表2 pH值堿性偏移結(jié)合熱處理對(duì)米糠蛋白總巰基、游離巰基的影響Table 2 Effects of alkaline pH-shifting combined with heat treatment on total and free sulfhydryl group contents of rice bran protein

2.3 pH值堿性偏移結(jié)合熱處理對(duì)米糠蛋白分子質(zhì)量和粒徑分布的影響

圖1 pH值堿性偏移結(jié)合熱處理對(duì)米糠蛋白分子質(zhì)量分布的影響Fig.1 Effects of alkaline pH-shifting combined with heat treatment on molecular mass distribution of rice bran protein

如圖1所示，未處理的米糠蛋白主要有2 個(gè)特征吸收峰，對(duì)應(yīng)保留時(shí)間分別為6.04 min和11.93 min，峰面積百分比分別為13.57%和86.43%，前者主要是分子質(zhì)量大于1 000 kDa的蛋白質(zhì)聚集體等大分子物質(zhì)，后者主要是分子質(zhì)量在3～200 kDa的米糠蛋白及其亞基等小分子物質(zhì)[11]。采用pH 11偏移、pH 11偏移結(jié)合50 ℃和60 ℃處理均會(huì)在一定程度上促使米糠蛋白聚集體分解，當(dāng)處理時(shí)間1 h時(shí)，保留時(shí)間6.04 min的峰面積百分比分別為1.03%、4.65%和3.66%。Jiang Jiang等[30]關(guān)于pH值偏移處理大豆蛋白11S組分的研究也認(rèn)為，極端pH值條件下，酸性亞基和堿性亞基組成的復(fù)合物容易被解離。但隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，單獨(dú)堿性偏移處理以及結(jié)合熱處理的米糠蛋白中聚集體含量又會(huì)增加，當(dāng)處理時(shí)間5 h時(shí)，保留時(shí)間6.04 min的峰面積百分比分別為1.40%、11.05%和6.63%。由于天然的米糠蛋白本身極易受脂質(zhì)氧化酸敗產(chǎn)物氧化，而堿性環(huán)境和熱處理均會(huì)加速蛋白質(zhì)氧化，這可能是導(dǎo)致聚集體不斷增加的重要原因[29]。

相比于未處理的米糠蛋白，單獨(dú)采用堿性偏移處理的米糠蛋白粒徑分布曲線明顯向大尺寸方向移動(dòng)（圖2A），當(dāng)米糠蛋白置于pH 11的溶液中時(shí)，平均粒徑就從129.92 nm增加到190.45 nm（圖2B）。結(jié)合分子質(zhì)量分布結(jié)果分析，應(yīng)該是極端pH值環(huán)境下蛋白質(zhì)分子快速展開(kāi)導(dǎo)致粒徑增加。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，平均粒徑逐漸下降，當(dāng)處理時(shí)間為5 h時(shí)，平均粒徑降低到114.33 nm，一方面可能是酸性亞基-堿性亞基復(fù)合物的解離起了主導(dǎo)作用，另一方面展開(kāi)的蛋白質(zhì)分子可能通過(guò)疏水作用等再次聚集[26]。pH 11偏移結(jié)合熱處理的米糠蛋白平均粒徑呈現(xiàn)類(lèi)似的先增后減的變化趨勢(shì)，但處理5 h時(shí)，平均粒徑略大于單獨(dú)pH值偏移處理的樣品，這可能也是因?yàn)榧訜崽岣吡嗣卓返鞍字醒趸奂w的含量。

圖2 pH值堿性偏移結(jié)合熱處理對(duì)米糠蛋白粒徑分布的影響Fig.2 Effect of alkaline pH-shifting combined with heat treatment on particle size distribution of rice bran protein

2.4 pH值堿性偏移結(jié)合熱處理對(duì)米糠蛋白亞基結(jié)構(gòu)的影響

圖3 pH值堿性偏移結(jié)合熱處理的米糠蛋白電泳圖Fig.3 Electrophoresis pattern of rice bran protein treated with alkaline pH-shifting combined with heating

如圖3所示，未處理的米糠蛋白亞基主要分布在60～70，40～50、37～38 ku和低于25 ku （泳道0），其中37～38 ku是谷蛋白酸性亞基對(duì)應(yīng)的條帶[31]。當(dāng)將米糠蛋白置于pH 11的溶液時(shí)（泳道1），明顯看到37～38 ku條帶的顏色變深，這印證了前面分子質(zhì)量分布結(jié)果推測(cè)的蛋白質(zhì)聚集體中酸性亞基和堿性亞基復(fù)合物發(fā)生解離的現(xiàn)象。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，亞基結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的條帶又逐漸變淺。當(dāng)在50、60 ℃下分別加熱3、5 h時(shí)，分離膠頂部出現(xiàn)明顯的聚集體條帶（泳道6、7、9、10），這表明pH 11偏移結(jié)合熱處理導(dǎo)致米糠蛋白形成了一些非二硫共價(jià)鍵交聯(lián)的聚集體。結(jié)合前面巰基變化的結(jié)果分析，二硫鍵和非二硫共價(jià)鍵共同參與了這一過(guò)程中蛋白質(zhì)聚集體的形成。

2.5 pH值堿性偏移結(jié)合熱處理對(duì)米糠蛋白內(nèi)源熒光光譜的影響

圖4 pH值堿性偏移結(jié)合熱處理對(duì)米糠蛋白內(nèi)源熒光光譜的影響Fig.4 Effect of alkaline pH-shifting combined with heat treatment on intrinsic fluorescence spectrum of rice bran protein

如圖4所示，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，米糠蛋白最大熒光峰位均出現(xiàn)先紅移再藍(lán)移的變化趨勢(shì)。未處理的米糠蛋白最大熒光峰位為346.61 nm，單獨(dú)pH 11、pH 11偏移結(jié)合50 ℃和60 ℃處理的米糠蛋白最大熒光峰位均在處理時(shí)間1 h時(shí)達(dá)到最大值，分別為350.63、348.65 nm和348.04 nm。內(nèi)源熒光光譜中最大熒光峰位紅移表明蛋白質(zhì)中色氨酸殘基微環(huán)境極性增強(qiáng)[11]。王健等[10]對(duì)大豆分離蛋白采用pH 11偏移短時(shí)（15 min）處理，也發(fā)現(xiàn)最大熒光峰位發(fā)生紅移。pH值堿性偏移處理會(huì)誘導(dǎo)原先包裹在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水側(cè)鏈暴露到分子表面的極性環(huán)境中，使色氨基殘基微環(huán)境發(fā)生改變[27]。隨著堿性偏移處理時(shí)間延長(zhǎng)，米糠蛋白最大熒光峰位發(fā)生藍(lán)移，結(jié)合前面二級(jí)結(jié)構(gòu)變化結(jié)果進(jìn)行分析，推斷可能是暴露出來(lái)的疏水基團(tuán)又因?yàn)槭杷嗷プ饔枚奂?，使米糠蛋白中色氨酸殘基微環(huán)境非極性增強(qiáng)。結(jié)果還顯示，熱處理會(huì)抑制米糠蛋白最大熒光峰位紅移，結(jié)合分子質(zhì)量分布和亞基結(jié)構(gòu)變化結(jié)果推測(cè)，可能是熱處理誘導(dǎo)蛋白質(zhì)聚集造成的。

2.6 pH值堿性偏移結(jié)合熱處理對(duì)米糠蛋白表面疏水性的影響

pH值偏移處理大豆分離蛋白的研究證實(shí)，極端堿性條件下蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)容易展開(kāi)，致使表面疏水性顯著增加[27]。但不同于大豆分離蛋白表面疏水性的持續(xù)增加，pH 11偏移以及結(jié)合熱處理的米糠蛋白表面疏水性隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降的趨勢(shì)（圖5）。這可能是由于相比大豆分離蛋白，米糠蛋白中殘留的內(nèi)源脂質(zhì)氧化酸敗產(chǎn)物更容易與其疏水側(cè)鏈基團(tuán)反應(yīng)，導(dǎo)致表面疏水性下降[11]。從圖5還可以看出，pH值偏移結(jié)合熱處理的米糠蛋白表面疏水性顯著大于單獨(dú)pH值偏移處理（P＜0.05）。關(guān)于肌原纖維蛋白的研究也發(fā)現(xiàn)，熱處理會(huì)顯著增加蛋白質(zhì)的表面疏水性，并且熱處理導(dǎo)致的表面疏水性增加有利于蛋白質(zhì)無(wú)定形或纖維狀聚集體的形成[32-33]。隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，米糠蛋白通過(guò)疏水相互作用形成聚集體，又會(huì)導(dǎo)致表面疏水性下降。

圖5 pH值堿性偏移結(jié)合熱處理對(duì)米糠蛋白表面疏水性的影響Fig.5 Effect of alkaline pH-shifting combined with heat treatment on hydrophobicity of rice bran protein

2.7 pH值堿性偏移結(jié)合熱處理對(duì)米糠蛋白功能性質(zhì)的影響

表3 pH值堿性偏移結(jié)合熱處理對(duì)米糠蛋白功能性質(zhì)的影響Table 3 Effects of alkaline pH-shifting combined with heat treatment on functional properties of rice bran protein

通常，良好的溶解性有助于蛋白質(zhì)部分功能性質(zhì)的發(fā)揮，并且還會(huì)影響其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。pH值堿性偏移結(jié)合熱處理米糠蛋白的溶解性和功能性質(zhì)如表3所示。相比于未處理的米糠蛋白，pH值堿性偏移處理的米糠蛋白溶解性顯著（P＜0.05）增加。Jiang Jiang等[34]關(guān)于大豆蛋白的研究也發(fā)現(xiàn)，pH值堿性偏移處理的蛋白質(zhì)在pH 6～7范圍內(nèi)溶解度高于未經(jīng)處理。結(jié)合熱處理后，米糠蛋白的溶解性顯著（P＜0.05）低于單獨(dú)pH值堿性偏移處理的米糠蛋白，這可能歸因于加熱促使疏水基團(tuán)的暴露以及不溶性聚集體的產(chǎn)生[35]。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，單獨(dú)pH值堿性偏移以及結(jié)合熱處理的米糠蛋白溶解性均逐漸下降。相比于未處理的米糠蛋白，pH值堿性偏移處理0 h的米糠蛋白持水性、起泡性、泡沫穩(wěn)定性、乳化性和乳化穩(wěn)定性都顯著（P＜0.05）下降，僅持油性顯著（P＜0.05）提高。隨著pH值偏移處理時(shí)間的延長(zhǎng)，米糠蛋白持水性、起泡性、乳化性和乳化穩(wěn)定性有所回升。其中，乳化性回升效果最明顯，當(dāng)pH 11偏移處理5 h時(shí)，乳化性達(dá)到最大值60.28 m2/g，是未處理米糠蛋白的1.3 倍。隨著pH值偏移處理時(shí)間延長(zhǎng)，持油性和泡沫穩(wěn)定性則呈先上升后下降的趨勢(shì)，分別在處理時(shí)間3 h時(shí)達(dá)到最大值853.77%和44.40%。pH值堿性偏移結(jié)合熱處理可以改善米糠蛋白的持水性、泡沫穩(wěn)定性和乳化穩(wěn)定性。米糠蛋白的持水性、泡沫穩(wěn)定性和乳化穩(wěn)定性分別在pH 11+50 ℃+5 h、pH 11+60 ℃+1 h和pH 11+60 ℃+5 h達(dá)到最大值，分別為760.32%、84.70%和122.69 min，是未處理米糠蛋白的2.4、1.3、1.6 倍。熱處理（尤其是50 ℃條件下）可以在一定程度上緩解pH值偏移對(duì)米糠蛋白起泡性的負(fù)面影響，但難以使其回復(fù)到處理前的起泡能力。同時(shí)，pH值堿性偏移結(jié)合熱處理還會(huì)顯著降低單獨(dú)pH值偏移對(duì)米糠蛋白持油性和乳化性的改善作用。

3 結(jié) 論

米糠蛋白經(jīng)pH值堿性偏移結(jié)合熱處理后，其結(jié)構(gòu)特征發(fā)生了顯著變化。pH值堿性偏移促使米糠蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由有序向無(wú)序轉(zhuǎn)化，pH值堿性偏移結(jié)合熱處理使得米糠蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)折疊-去折疊-復(fù)折疊的復(fù)雜變化，并伴隨巰基氧化。結(jié)合分子質(zhì)量分布、粒徑分布和亞基結(jié)構(gòu)變化分析，pH值堿性偏移促使米糠蛋白展開(kāi)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，米糠蛋白重新聚集，熱處理會(huì)加劇這種聚集行為。內(nèi)源熒光光譜和表面疏水性的變化進(jìn)一步展現(xiàn)了米糠蛋白在pH值堿性偏移結(jié)合熱處理過(guò)程中空間結(jié)構(gòu)的復(fù)雜變化，并印證了這一過(guò)程中分子的展開(kāi)-聚集行為。單獨(dú)pH值堿性偏移處理會(huì)使得米糠蛋白的持水性、起泡性、泡沫穩(wěn)定性、乳化性和乳化穩(wěn)定性顯著下降，僅持油性有所改善。但pH值堿性偏移結(jié)合熱處理則可顯著改善米糠蛋白的持水性、起泡性、泡沫穩(wěn)定性和乳化穩(wěn)定性。pH值堿性偏移結(jié)合熱處理有望成為一種很好調(diào)控米糠蛋白功能性質(zhì)的方法。