梅瑾 王敏 王昊 何茶英 連結(jié)靜 傅婷婷 胡文勝

先天性耳聾是人類(lèi)發(fā)病率較高的出生缺陷之一，尤其是在新生兒中多發(fā)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示該疾病在新生兒中的發(fā)病率為0.1%，其中一半的患兒與遺傳缺陷有關(guān)[1]。目前已知的耳聾相關(guān)并且已經(jīng)作為臨床篩查目標(biāo)的基因有GJB2、SCL26A4、GJB3、線粒體12SrRNA[2-3]。2012年北京市政府開(kāi)展新生兒耳聾基因篩查民生項(xiàng)目，隨后成都、長(zhǎng)治、南通、鄭州等城市也開(kāi)展了新生兒遺傳性耳聾基因篩查工作[4-8]，促進(jìn)了先天性耳聾的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預(yù)等防治工作。然而，杭州地區(qū)新生兒耳聾基因篩查項(xiàng)目開(kāi)展較遲，有關(guān)耳聾基因的突變率等基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及相關(guān)研究報(bào)道較少。為此，本研究采集2018 年6 月至2019 年12 月在杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院出生的5 279 例新生兒足底血，提取DNA 并應(yīng)用微陣列芯片雜交法檢測(cè)4 個(gè)耳聾基因15 個(gè)位點(diǎn)，分析基因突變攜帶率和突變類(lèi)型，結(jié)合新生兒聽(tīng)力篩查結(jié)果，比較兩者相關(guān)性，對(duì)聽(tīng)力篩查未通過(guò)的耳聾基因突變者進(jìn)行耳聾全基因測(cè)序診斷確定基因型，隨訪其聽(tīng)力發(fā)育和干預(yù)情況，以評(píng)估聽(tīng)力-耳聾基因聯(lián)合篩查在先天性耳聾早期診斷與干預(yù)中的作用。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2018 年6 月至2019 年12 月本院出生的新生兒5 279 例，男嬰2 797 例，女?huà)? 482 例；出生孕周37～41（39.03±0.97）周；體重2 500～4 100（3 300±50）g；新生兒父母均來(lái)自杭州轄區(qū)的11 個(gè)區(qū)、縣（市）。排除重度窒息、重度黃疸、明顯先天缺陷及出生后轉(zhuǎn)新生兒病房治療的患兒。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò)，所有患兒監(jiān)護(hù)人均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 新生兒足底血采集 由兒保科專(zhuān)業(yè)人員在新生兒出生72 h 內(nèi)，在監(jiān)護(hù)人知情同意并簽字下，按照《新生兒疾病篩查技術(shù)規(guī)范（2010 版）》和采血常規(guī)的要求，采集新生兒足底血，使用專(zhuān)用采血濾紙片制成2 個(gè)直徑≥8 mm 的血斑，充分滲透，自然晾干，獨(dú)立裝袋，送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行耳聾基因檢測(cè)。

1.2.2 常見(jiàn)耳聾基因突變篩查 采用打孔器得到3 mm直徑的干血斑，使用十五項(xiàng)遺傳性耳聾相關(guān)基因檢測(cè)試劑盒（成都博奧晶芯生物科技有限公司，國(guó)械注準(zhǔn)20173401343）進(jìn)行檢測(cè)。按試劑盒說(shuō)明要求，使用核酸提取試劑盒提取新生兒干血斑中的DNA，與空白樣本、陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照一起進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增完成后，使用微陣列芯片雜交法對(duì)標(biāo)本進(jìn)行4 個(gè)基因15 個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)[GJB2（c.35delG、c.235delC、c.176del16、c.299delAT），GJB3（c.538C＞T），SLC26A4（c.2168A＞G、c.919-2A＞G、c.1174A＞T、c.1226G＞A、c.1229C＞T、c.1975G＞C、c.2027T＞A、c.IVS15+5G＞A）和線粒體12SrRNA（m.1494C＞T、m.1555A＞G）]。對(duì)基因芯片篩查中出現(xiàn)突變位點(diǎn)的樣本使用Sanger 測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證[3]。采血后2 周內(nèi)報(bào)告結(jié)果。篩查結(jié)果分為未突變、雜合突變、純合突變、復(fù)合雜合突變以及復(fù)合突變[9]。未突變?yōu)闄z測(cè)結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)與耳聾相關(guān)的基因突變或基因型，雜合突變?yōu)橥换蚶锇l(fā)現(xiàn)一種突變型，純合突變?yōu)橥换蚶锇l(fā)現(xiàn)兩種一樣的突變型，復(fù)合雜合突變?yōu)橥换蚶锇l(fā)現(xiàn)兩種不同突變型，復(fù)合突變?yōu)椴煌蚶锔饔幸环N突變型。對(duì)于線粒體12SrRNA 上同時(shí)出現(xiàn)的兩種突變，定義為線粒體異質(zhì)突變；線粒體12SrRNA 上僅一種突變，定義為線粒體均質(zhì)突變。

1.2.3 聽(tīng)力篩查 由兒?？茖?zhuān)業(yè)人員采用“兩階段篩查法”，即初篩和復(fù)篩，將結(jié)果錄入醫(yī)院產(chǎn)時(shí)信息系統(tǒng)，本研究數(shù)據(jù)從產(chǎn)時(shí)信息系統(tǒng)中提取。嚴(yán)格按照國(guó)家衛(wèi)健委新生兒聽(tīng)力篩查規(guī)范要求進(jìn)行，初次診斷性聽(tīng)力評(píng)估在3 個(gè)月內(nèi)完成。初篩是在新生兒出生后滿(mǎn)48～72 h 使用畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射法（DPOAE）（德國(guó)麥科聽(tīng)力儀器公司，MAICO Diagnostic GmbH ERO-SCAN 型）進(jìn)行聽(tīng)力測(cè)試，如果新生兒?jiǎn)味螂p耳沒(méi)有通過(guò)測(cè)試，則記錄為“未通過(guò)”。初篩未通過(guò)者產(chǎn)后42 d 至兒童保健門(mén)診應(yīng)用自動(dòng)判別聽(tīng)性腦干誘發(fā)電位檢查法（AABR）（德國(guó)麥科聽(tīng)力儀器公司，型號(hào)：MAICO Diagnostic GmbH MB11 型）復(fù)篩，若初篩和復(fù)篩兩次均未通過(guò)測(cè)試，列為耳聾高危人群。結(jié)合耳聾基因篩查與診斷情況，3 個(gè)月內(nèi)轉(zhuǎn)聽(tīng)力診斷部門(mén)綜合評(píng)估聽(tīng)覺(jué)能力，包括聽(tīng)性腦干反應(yīng)（ABR）、聲導(dǎo)抗檢查及外耳道檢查等。

1.2.4 耳聾基因診斷與父母基因篩查驗(yàn)證 耳聾基因篩查結(jié)果由產(chǎn)前診斷中心辦公室專(zhuān)人管理，對(duì)新生兒耳聾基因突變攜帶者，電話通知其家長(zhǎng)到本院遺傳咨詢(xún)門(mén)診接受遺傳咨詢(xún)和健康教育，在知情同意的情況下，對(duì)耳聾基因突變新生兒父母行耳聾基因篩查驗(yàn)證，評(píng)估遺傳因素的作用，對(duì)GJB2 和SLC26A4 耳聾基因突變者行基因測(cè)序診斷以確定基因型。

1.2.5 隨訪內(nèi)容 產(chǎn)前診斷中心辦公室專(zhuān)人隨訪耳聾基因突變和聽(tīng)力篩查未通過(guò)新生兒出生3 個(gè)月后聽(tīng)力診斷性檢查情況以及耳聾者的個(gè)性化干預(yù)措施落實(shí)情況（配戴助聽(tīng)器或安裝人工耳蝸）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耳聾基因突變情況 5 279 例耳聾基因突變篩查新生兒中，未突變4 999 例，突變280 例，其中雜合突變277 例，純合和復(fù)合雜合突變3 例，突變率為5.30%（280/5 279）。4 個(gè)耳聾基因中，GJB2 突變率最高，為3.05%（161/5 279），其中純合和復(fù)合雜合突變3 例，突變率為0.06%（3/5 279），雜合突變158 例，突變率為2.99%（158/5 279）；其余由高到低分別為SLC26A4 雜合突變84 例，突變率為1.59%（84/5 279）；GJB3 雜合突變18 例，突變率為0.34%（18/5 279）；線粒體12SrRNA 均質(zhì)突變14 例，突變率為0.27%（14/5 279）；雙基因雜合突變3 例，突變率為0.06%（3/5 297）。GJB2 基因突變中c.235delC 位點(diǎn)突變最多，達(dá)131 例，突變率為2.48%（131/5297）；SLC26A4基因中c.919-2A＞G 位點(diǎn)突變最多，為59 例，突變率為1.12%，見(jiàn)表1。

2.2 耳聾基因突變者基因診斷及父母驗(yàn)證情況 280例耳聾基因突變的新生兒父母均接受遺傳咨詢(xún)和健康教育，其中150 例新生兒父母依從性較好，在知情同意下，選擇了耳聾基因突變篩查驗(yàn)證，結(jié)果135 例新生兒突變來(lái)源于無(wú)表型的父母一方，占90.0%。對(duì)2 例GJB2基因c.235delC 純合突變和1 例GJB2 基因c.235delC/c.299delAT 復(fù)合雜合突變新生兒進(jìn)行GJB2 基因測(cè)序診斷，結(jié)果與篩查一致，見(jiàn)表1。另有19 例GJB2 和SLC26A4耳聾基因雜合突變新生兒進(jìn)行基因測(cè)序診斷，發(fā)現(xiàn)其中4 例為GJB2 基因c.235delC/c.109G＞A 位點(diǎn)復(fù)合雜合突變，父母經(jīng)驗(yàn)證為相應(yīng)位點(diǎn)突變的攜帶者。

表1 280 例新生兒4 個(gè)常見(jiàn)耳聾基因突變篩查、基因診斷及父母驗(yàn)證情況

2.3 耳聾基因篩查與聽(tīng)力篩查比較 5 279 例耳聾基因突變篩查新生兒中，耳聾基因未突變者聽(tīng)力篩查未通過(guò)率為0.05%（25/4 999），低于耳聾基因突變攜帶者的1.79%（5/280），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表2。

表2 5 279 例新生兒耳聾基因篩查與聽(tīng)力篩查比較（例）

2.4 耳聾基因突變者聽(tīng)力診斷和干預(yù)隨訪情況 隨訪耳聾基因雜合突變新生兒277 例，其中2 例聽(tīng)力篩查未通過(guò)，經(jīng)GJB2 全基因測(cè)序，1 例為GJB2 基因c.235delC位點(diǎn)雜合突變，聽(tīng)力診斷正常；另1 例為GJB2 基因c.235delC/c.109G＞A 位點(diǎn)復(fù)合雜合突變，出生3 個(gè)月經(jīng)聽(tīng)力診斷性檢查，確診中度耳聾，準(zhǔn)備安裝人工耳蝸；還對(duì)3 例聽(tīng)力篩查通過(guò)而基因測(cè)序診斷為GJB2 基因c.235delC/c.109G＞A 位點(diǎn)復(fù)合雜合突變新生兒進(jìn)行隨訪，出生3 個(gè)月聽(tīng)力均診斷正常。隨訪GJB2 基因純合/復(fù)合雜合突變新生兒3 例，聽(tīng)力篩查雙耳均未通過(guò)，基因測(cè)序基因型與篩查一致；其中GJB2 基因c.235delC純合突變2 例，出生2 個(gè)月確診為重度耳聾，出生6 個(gè)月準(zhǔn)備安裝人工耳蝸；GJB2 基因c.235delC/c.299delAT復(fù)合雜合突變1 例，出生2 個(gè)月確診為中度耳聾，準(zhǔn)備配戴助聽(tīng)器。另對(duì)14 例線粒體12SrRNA 突變攜帶者父母發(fā)放生活和用藥指導(dǎo)卡片，對(duì)18 例GJB3 基因突變攜帶者和3 例雙基因雜合突變者囑其父母注意聽(tīng)力發(fā)育及生活指導(dǎo)。

3 討論

聽(tīng)力障礙會(huì)直接影響患兒的語(yǔ)言發(fā)育，如果未早期發(fā)現(xiàn)，最終由聾致啞，給患兒的生長(zhǎng)發(fā)育及社會(huì)生活帶來(lái)非常嚴(yán)重的影響，為此，應(yīng)盡早發(fā)現(xiàn)和干預(yù)患兒，避免其因錯(cuò)過(guò)最佳治療期而成為永久性聾兒，這一直是臨床工作者關(guān)注的重點(diǎn)。我國(guó)20 多年前就開(kāi)展了新生兒耳聲發(fā)射結(jié)合聽(tīng)性腦干聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位測(cè)試（金標(biāo)準(zhǔn)）[10]聽(tīng)力篩查工作，該檢測(cè)無(wú)創(chuàng)，假陽(yáng)性率低，為發(fā)現(xiàn)新生聾兒起到了巨大的作用。但并不是所有的聽(tīng)力損傷都會(huì)在出生不久便發(fā)生，遲發(fā)性、漸進(jìn)性甚至藥物性耳聾都無(wú)法用該法查出。隨著對(duì)耳聾基因的深入研究，已表明我國(guó)大部分先天性遺傳性耳聾由為數(shù)不多的幾個(gè)基因突變引起[11]，耳聾基因檢測(cè)已經(jīng)成為防控遺傳性聾兒的重要措施[12-13]，在一定程度上彌補(bǔ)了聽(tīng)力篩查的不足[2]。

本研究在5 279 例新生兒中檢出基因突變280 例，突變率為5.30%，與Zhang 等[14]報(bào)道的天津地區(qū)耳聾基因突變攜帶率為5.52%接近，比Chen 等[15]對(duì)我國(guó)18 篇新生兒耳聾基因篩查的文獻(xiàn)進(jìn)行Meta 分析，發(fā)現(xiàn)新生兒耳聾基因陽(yáng)性檢出率為4.7%略高，也高于阮宇等[16]4.51%和王川等[17]4.38%的報(bào)道，原因可能是我國(guó)不同地區(qū)新生兒耳聾基因篩查方式存在差異，耳聾基因突變陽(yáng)性檢出率不盡相同。本研究篩查4 個(gè)基因15 個(gè)位點(diǎn)，而阮宇等[16]篩查的是4 個(gè)基因9 個(gè)位點(diǎn)，由于篩查突變位點(diǎn)的增加，耳聾基因突變陽(yáng)性檢出率有所增高。本研究4 個(gè)基因中，GJB2 基因突變最高，純合和復(fù)合雜合突變率為0.06%，雜合突變率為2.99%；其次為SLC26A4 雜合突變，突變率為1.59%。GJB2 基因中，c.235delC 突變最多，達(dá)131 例，突變率為2.48%；SLC26A4 基因中c.919-2A＞G 突變最多，為59 例，突變率為1.12%，與阮宇等[16]報(bào)道一致，表明了杭州地區(qū)耳聾基因突變攜帶率和常見(jiàn)突變類(lèi)型與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)研究報(bào)道基本一致。

本研究280 例耳聾基因突變中，150 例新生兒父母進(jìn)行了耳聾基因突變篩查驗(yàn)證，結(jié)果135 例新生兒突變來(lái)源于無(wú)表型的父母一方，占90.0%。還對(duì)22 例攜帶GJB2 和SLC26A4 基因突變的新生兒進(jìn)行基因測(cè)序診斷，確定GJB2 基因c.235delC 純合突變2 例，GJB2 基因c.235delC/c.299delAT 復(fù)合雜合突變1 例，與篩查結(jié)果一致，同時(shí)發(fā)現(xiàn)4 例為GJB2 基因c.235delC/c.109G＞A 位點(diǎn)復(fù)合雜合突變，父母經(jīng)驗(yàn)證分別為相應(yīng)位點(diǎn)突變的攜帶者。說(shuō)明新生兒耳聾基因突變大部分是遺傳父母，少部分才是基因突變所致。提示在孕前、孕期進(jìn)行夫妻耳聾基因篩查可以有效檢出胎兒的耳聾基因攜帶狀況，如果夫妻雙方均為同一基因攜帶者，根據(jù)耳聾的主要遺傳方式——常染色體隱性遺傳，即有1/4 可能出生聾兒，可進(jìn)行婚育指導(dǎo)和產(chǎn)前診斷，以減少耳聾的出生。

從耳聾基因突變狀態(tài)與聽(tīng)力篩查結(jié)果比較中發(fā)現(xiàn)，耳聾基因未突變，聽(tīng)力初篩與復(fù)篩未通過(guò)率為0.05%，低于耳聾基因突變新生兒的1.79%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與王川等[17]報(bào)道一致。說(shuō)明新生兒耳聾基因突變攜帶與聽(tīng)力篩查不通過(guò)兩者有相關(guān)性，所以通過(guò)聽(tīng)力-耳聾基因聯(lián)合篩查，以確定先天性耳聾的高危人群，并對(duì)高危人群盡早聽(tīng)力診斷加以確診，有利于早期采取干預(yù)，避免由聾致啞。

按照新生兒聽(tīng)力篩查規(guī)范要求，常規(guī)聽(tīng)力篩查未通過(guò)，初次診斷性聽(tīng)力評(píng)估在3 個(gè)月左右完成，最后確診耳聾還要延后，但結(jié)合耳聾基因篩查結(jié)果，可以在出生2 個(gè)月就進(jìn)入到聽(tīng)力診斷的階段，盡早發(fā)現(xiàn)和干預(yù)患兒。本研究還對(duì)聽(tīng)力篩查通過(guò)而基因測(cè)序診斷為GJB2基因c.235delC/c.109G＞A 位點(diǎn)復(fù)合雜合突變的新生兒進(jìn)行隨訪，出生3 個(gè)月聽(tīng)力均診斷正常，由于GJB2 基因c.109G＞A 位點(diǎn)突變外顯不全，對(duì)于GJB2 基因c.235delC/c.109G＞A 位點(diǎn)復(fù)合雜合突變，是否表現(xiàn)聽(tīng)力障礙，目前各個(gè)研究者認(rèn)識(shí)不一致，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道，即使出生后聽(tīng)力篩查與診斷正常，但仍需要長(zhǎng)期隨訪聽(tīng)力發(fā)育，一旦發(fā)現(xiàn)聽(tīng)力異常需及時(shí)干預(yù)。本研究對(duì)14 例攜帶線粒體12SrRNA 基因突變的新生兒進(jìn)行藥物性耳聾高危用藥指導(dǎo)，避免用藥致聾；對(duì)18 例GJB3基因突變攜帶者和3 例雙基因雜合突變者囑其父母注意聽(tīng)力發(fā)育及生活指導(dǎo)。

綜上所述，本研究通過(guò)聽(tīng)力-耳聾基因聯(lián)合篩查與診斷，在出生3 個(gè)月確診中重度耳聾4 例，對(duì)不同的耳聾基因突變者進(jìn)行個(gè)性化干預(yù)，達(dá)到了早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預(yù)的目的。本研究為杭州地區(qū)開(kāi)展新生兒聽(tīng)力-耳聾基因聯(lián)合篩查提供了理論依據(jù)及基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對(duì)提高杭州地區(qū)出生人口健康素質(zhì)具有積極的意義。