李镠祎 曹奔奔 張婷 王晨 楊紅健 戴五敏 蔡昀方

乳腺癌是全球范圍內(nèi)女性最常見的惡性腫瘤，其死亡率居于女性惡性腫瘤的第二位[1]。近年來，隨著生活方式、飲食習慣等多因素的改變，全球乳腺癌的發(fā)生率和死亡率都呈現(xiàn)上升趨勢，在過去的40 年中，東亞女性的發(fā)病率更是迅速增加[2-3]。惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展常涉及基因突變、基因表達異常、染色體畸變等遺傳學改變。瓣狀核酸內(nèi)切酶1（flap endonuclease 1,FEN1）基因是BRCA2 合成致死（BRCA2 synthetic lethality,B2SL）基因的一種，編碼一種結構特異性內(nèi)切酶，參與岡崎片段成熟、DNA 重組、細胞凋亡DNA 片段化和長片段堿基切除修復等過程，在維持基因組穩(wěn)定性和完整性方面發(fā)揮著重要作用[4-5]。FEN1 基因的功能缺陷（以體細胞突變和多態(tài)性形式出現(xiàn)）近來已被證明可導致自身免疫疾病、慢性炎癥以及促進癌癥的發(fā)生、發(fā)展。研究證明，F(xiàn)EN1 表達水平在前列腺癌、卵巢癌、肺癌等多種惡性腫瘤中增高，其中乳腺癌和子宮癌的表達水平增高更為明顯，此外，F(xiàn)EN1 對于癌細胞的快速增殖至關重要，F(xiàn)EN1 基因的變異可降低女性患乳腺癌的風險，將FEN1 基因作為一個靶向治療的靶點可以阻止乳腺癌進展[6-8]。本研究主要通過檢索Oncomine、基因表達譜動態(tài)分析（gene expression profiling interactive analysis,GEPIA）、人類蛋白質(zhì)圖譜（human protein atlas,HPA）、腫瘤單細胞（CancerSEA）數(shù)據(jù)庫和Kaplan-Meier Plotter 在線工具分析FEN1 基因在乳腺癌中的表達及其與臨床病理分期、細胞功能狀態(tài)、預后的相關性，為進一步探討FEN1 基因在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 從Oncomine 數(shù)據(jù)庫提取數(shù)據(jù) Oncomine 數(shù)據(jù)庫（https://www.oncomine.org/）是目前世界上最大的腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)庫及數(shù)據(jù)整合提取的平臺，其中一項重要功能就是進行腫瘤組織和正常組織的基因差異表達分析[9-10]。研究者可根據(jù)自己的需要設定數(shù)據(jù)挖掘的條件，本研究的檢索條件如下：（1）Gene：FEN1；（2）Analysis Type:Cancer vs Normal Analysis；（3）數(shù)據(jù)集篩選標準P 值＜0.0001，fold change 2，gene rank=Top 10%。

1.2 從GEPIA 數(shù)據(jù)庫提取數(shù)據(jù) GEPIA 數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancer-pku.cn/）是在腫瘤基因圖譜（the cancer genome atlas,TCGA）與基因型-組織表達（the genotypetissue expression,GTEx）這兩大轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫基礎上建立的可視化癌癥大數(shù)據(jù)分析平臺[10-11]。檢索條件如下：（1）“Expression DIY”框中點擊“Boxplot”；（2）Gene：FEN1；（3）Cancer name：BRCA；比較乳腺癌組織和正常乳腺組織的表達量。另一方面：（1）“Expression DIY”框中點擊“Stage plot”；（2）Gene：FEN1；（3）Cancer name：BRCA；比較不同分期的乳腺癌FEN1 表達量。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

1.3 從HPA 數(shù)據(jù)庫提取數(shù)據(jù) HPA 數(shù)據(jù)庫（https://www.proteinatlas.org/）是一個基于免疫組化的大型蛋白質(zhì)表達譜數(shù)據(jù)庫，包含24 000 種蛋白質(zhì)在腫瘤組織、正常組織和細胞中的分布信息，通過免疫組化技術分析比較正常組織和腫瘤組織中蛋白的表達水平[12]。在HPA 數(shù)據(jù)庫“Tissue Atlas”和“Pathology Atlas”中輸入FEN1，分別選擇“Breast”和“Breast cancer”，生成免疫組化圖，可視化乳腺癌組織和正常乳腺組織中FEN1基因編碼蛋白的表達水平。

1.4 Kaplan-Meier Plotter 在線分析 Kaplan-Meier Plotter 在線分析工具（http://www.kmplot.com/）是一種包括基因表達數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)的在線分析工具[13]。利用Kaplan-Meier Plotter 在線分析工具對乳腺癌患者總生存率（overall survival，OS）進行分析，設置條件：（1）Cancer type：Breast cancer；（2）Gene：FEN1；（3）Survival：OS。log-rank 檢驗P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

1.5 從CancerSEA 數(shù)據(jù)庫提取數(shù)據(jù) CancerSEA 數(shù)據(jù)庫（http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/）是一個單細胞測序數(shù)據(jù)庫，它總共包含來自25 種癌癥的41 900個癌細胞，可全面探索癌細胞在單細胞水平上的功能狀態(tài)[14]。檢索條件如下：（1）Gene：FEN1；（2）Cancer Types:Breast cancer。

1.6 統(tǒng)計學處理 乳腺癌組織與正常乳腺組織中FEN1 基因表達比較采用兩獨立樣本t 檢驗；不同臨床病理分期乳腺癌患者FEN1 基因表達水平比較采用單因素方差分析；FEN1 基因表達與患者預后的關系采用Kaplan-Meier 生存曲線，兩組生存率比較采用logrank 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 FEN1 基因在不同類型腫瘤中的表達 按照預設篩選條件進行檢索，Oncomine 數(shù)據(jù)庫中共收集384 項關于FEN1 基因在不同類型腫瘤組織與正常組織中表達的比較研究結果。其中FEN1 基因表達差異有統(tǒng)計學意義的研究結果共61 項，F(xiàn)EN1 基因呈高表達的研究有58 項，呈低表達的研究只有3 項。另外，證明乳腺癌組織中FEN1 基因表達升高的研究有8 項，研究數(shù)量僅次于肺癌居第二（圖1，見插頁）。

圖1 瓣狀核酸內(nèi)切酶1（FEN1）基因在Oncomine 數(shù)據(jù)庫中所有腫瘤類型中的表達情況（紅色表示上調(diào)，藍色表示下調(diào)，顏色越深表示顯著性越高）

2.2 FEN1 基因在乳腺癌中的表達情況 經(jīng)過篩選，GEPIA 數(shù)據(jù)庫中，乳腺癌組織中FEN1 基因的轉(zhuǎn)錄水平與正常乳腺組織相比明顯增加（P＜0.05），見圖2a。此外，通過檢索HPA 數(shù)據(jù)庫，獲得了乳腺癌組織和正常乳腺組織中FEN1 的免疫組化染色圖像（圖2b），免疫組化結果顯示乳腺癌組織中FEN1 基因的表達水平明顯高于正常乳腺組織。

圖2 瓣狀核酸內(nèi)切酶1（FEN1）基因在乳腺癌中的表達情況[（a：基因表達譜動態(tài)分析（GEPIA）數(shù)據(jù)庫中FEN1 基因在乳腺癌與正常乳腺組織中的表達差異；b：人類蛋白質(zhì)圖譜（HPA）數(shù)據(jù)庫中FEN1 基因在乳腺癌與正常乳腺組織中的免疫組化分析；免疫組化染色，×200]

2.3 FEN1 基因的表達水平與乳腺癌臨床病理分期的關系 在GEPIA 數(shù)據(jù)庫中分析FEN1 基因表達水平與乳腺癌臨床病理分期的關系，發(fā)現(xiàn)不同臨床病理分期乳腺癌患者FEN1 基因表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義（F=2.68，P＜0.05），見圖3。

圖3 基因表達譜動態(tài)分析（GEPIA）數(shù)據(jù)庫中瓣狀核酸內(nèi)切酶1（FEN1）基因在乳腺癌不同臨床病理分期中的表達情況

2.4 FEN1 基因表達水平與乳腺癌患者預后的關系Kaplan-Meier Plotter 在線工具分析顯示:乳腺癌患者FEN1 基因不同表達水平與預后具有相關性。從總體來看，F(xiàn)EN1 基因高表達組患者OS 低于低表達組（P＜0.05）（圖4a）。亞組分析：（1）淋巴結：淋巴結轉(zhuǎn)移陰性患者FEN1 基因低表達組OS 高于高表達組（P＜0.05），但淋巴結轉(zhuǎn)移陽性患者低表達組和高表達組OS 比較差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）（圖4b-c）；（2）免疫組化：免疫組化結果分別為雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性、ER 陰性、孕激素受體（progesterone receptor，PR）陽性、PR 陰性、人類表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陽性和Her2陰性的患者，ER 陽性和HER2 陰性患者FEN1 基因低表達組OS 高于高表達組（均P＜0.05）（圖4d、4i），而ER 陰性、PR 陽性、PR 陰性、HER2 陽性患者低表達組和高表達組OS 比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P ＞0.05）（圖4e-h）；（3）分子分型：Luminal A 型、Luminal B 型患者FEN1 基因低表達組OS 高于高表達組（均P＜0.05）（圖5a-b），HER2 過表達型和基底細胞（Basal-like）型患者中FEN1 基因低表達組和高表達組間OS 比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P ＞0.05）（圖5c-d）。

2.5 FEN1 基因在單個細胞里的功能 CancerSEA 數(shù)據(jù)庫的功能相關分析表明，在單個乳腺癌細胞中FEN1基因表達與多種細胞功能狀態(tài)相關，其中與細胞凋亡、細胞周期、分化、DNA 損傷、DNA 修復、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、轉(zhuǎn)移、細胞增殖和侵襲均呈正相關（均P＜0.05），與血管生成、組織缺氧、炎癥、細胞沉默和干細胞性均呈負相關（均P＜0.05）（圖6）。進一步對FEN1 基因與乳腺癌細胞功能狀態(tài)的相關性進行分析，Braune 等[15]和Jordan 等[16]兩項研究均顯示FEN1 基因的表達與細胞凋亡、細胞周期、DNA 損傷、DNA 修復、EMT、癌細胞侵犯、細胞增殖呈正相關，其中r 值較高的有細胞周期、DNA 損傷、DNA 修復，分別為0.70/0.65、0.51/0.65、0.69/0.69（圖7，見插頁）。

圖4 Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫中瓣狀核酸內(nèi)切酶1（FEN1）基因表達水平與不同乳腺癌人群預后的關系[a：淋巴結轉(zhuǎn)移陰性人群；b：淋巴結轉(zhuǎn)移陽性人群；c：雌激素受體（ER）陽性人群；d：ER 陰性人群；e：孕激素受體（PR）陽性人群；f：PR 陰性人群；g：人類表皮生長因子受體-2（HER2）陽性人群；h：HER2 陰性人群]

圖5 Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫中瓣狀核酸內(nèi)切酶1（FEN1）基因表達水平與不同分型的乳腺癌預后之間的關系[a：Luminal A 型；b：Luminal B 型；c：人類表皮生長因子受體-2（HER2）型；d：基底細胞（Basal-like）型]

圖6 腫瘤單細胞（CancerSEA）數(shù)據(jù)庫中瓣狀核酸內(nèi)切酶1（FEN1）基因表達與不同惡性腫瘤細胞功能狀態(tài)的相關性

圖7 腫瘤單細胞（CancerSEA）數(shù)據(jù)庫中乳腺癌細胞瓣狀核酸內(nèi)切酶1（FEN1）基因表達與癌細胞功能狀態(tài)的相關性

3 討論

隨著治療方式的不斷改進，乳腺癌患者的預后得到了極大的改善，然而由于生活方式、飲食習慣等多方面的改變，乳腺癌的發(fā)病率仍呈明顯上升趨勢，是全球女性最常見的惡性腫瘤，嚴重威脅女性的身心健康[17]。乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是一個復雜的過程，基因表達的異常在這一過程中起著重要作用，但是其具體機制目前仍未得到明確闡述。因此進一步探索乳腺癌具體的發(fā)生、發(fā)展機制，挖掘有效的基因靶點對乳腺癌的診斷治療及預后評估具有重要的臨床意義。

FEN1 基因是重要的的抑癌基因，其編碼的FEN1是一種結構特異性核酸酶，參與了長片段堿基切除修復和DNA 復制過程中岡崎片段的成熟，此外FEN1 在DNA 修復、DNA 復制和其他多種DNA 代謝途徑中發(fā)揮作用，被認為是維持基因穩(wěn)定和DNA 復制的關鍵酶[18]。He 等[7]研究證明FEN1 基因不僅在乳腺癌中過表達，并且對于乳腺癌細胞的快速增殖至關重要。當乳腺癌細胞中的FEN1 基因被抑制時，可導致DNA 復制的延遲和未修復的DNA 中間體的積累，從而導致DNA 雙鏈的斷裂和細胞凋亡[19]。抑制FEN1 的活性，或許可以抑制癌細胞的生長。臨床上使用的大多數(shù)化療藥物通過誘導DNA 損傷引起細胞凋亡，然而由于DNA 修復蛋白在癌細胞中的過表達而導致的高效率DNA 修復顯著降低了藥物功效，癌細胞DNA 修復能力的提高可導致耐藥性的產(chǎn)生[20-21]?；贔EN1 具有的DNA 修復功能，抑制FEN1 基因或許可以增加癌細胞對化療藥物的敏感性。鑒于FEN1 的DNA 復制和DNA 修復功能，將FEN1 基因作為治療靶點或許可以成為乳腺癌治療的有效策略。

本研究通過檢索Oncomine 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)EN1 基因在多種腫瘤組織中表達增高，如肺癌、乳腺癌和結直腸癌等。此外，通過檢索GEPIA 數(shù)據(jù)庫，驗證了乳腺癌組織中FEN1 基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于正常乳腺組織。通過檢索HPA 數(shù)據(jù)庫，生成FEN1 免疫組化圖，可視化了乳腺癌組織和正常乳腺組織中FEN1 基因編碼蛋白的表達差異，驗證了GEPIA 數(shù)據(jù)庫的結論。通過進一步檢索GEPIA 數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)不同臨床病理分期乳腺癌患者FEN1 基因表達水平差異有統(tǒng)計學意義，因此，F(xiàn)EN1基因的表達水平，或許會隨著疾病的進展發(fā)生變化，這有待進一步研究。此外，通過Kaplan-Meier Plotter 在線分析顯示FEN1 基因高表達組患者OS 低于低表達組，進一步亞組分析顯示：淋巴結轉(zhuǎn)移陰性、ER 陽性、HER2 陰性、Luminal A 型和Luminal B 型FEN1 基因低表達組患者OS 高于高表達組，而淋巴結轉(zhuǎn)移陽性、ER 陰性、PR 陽性、PR 陰性、HER2 陽性、HER2 過表達型和基底細胞型患者FEN1 基因高表達組與低表達組比較差異均無統(tǒng)計學意義，有待進一步擴大樣本量進行分析。FEN1 基因在生物細胞的DNA 代謝中扮演重要角色，參與DNA 復制和損傷修復過程，還能通過不同的調(diào)控機制促進腫瘤的發(fā)展及耐藥[22]，因此本研究通過CancerSEA 數(shù)據(jù)庫分析FEN1 基因在單個細胞里的功能。分析表明在單個乳腺癌細胞中FEN1基因表達與多種細胞功能狀態(tài)相關，其中與細胞凋亡、細胞周期、分化、DNA 損傷、DNA 修復、EMT、轉(zhuǎn)移、細胞增殖和侵襲均呈正相關，此外，CancerSEA 數(shù)據(jù)庫涵蓋的兩項研究均證明FEN1 基因的表達與細胞周期、DNA 損傷、DNA 修復均呈較高的正相關性。

綜上所述，本研究通過生物信息學分析FEN1 基因在乳腺癌中高表達，與患者預后相關，并且與乳腺癌細胞的細胞周期、DNA 損傷和DNA 修復等細胞功能具有較高的相關性，F(xiàn)EN1 基因或許可以作為潛在的評估乳腺癌患者預后的標志物和治療靶標，為臨床乳腺癌的治療及基因靶向藥物的研制提供重要理論依據(jù)，對乳腺癌的預后具有重要的臨床意義。