李長明 邵榮學(xué) 鄧小梅 趙士杰 王拓 全仁夫

急性脊髓損傷（acute spinal cord injury，ASCI）是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，發(fā)病率和致殘率均較高，常導(dǎo)致受損平面以下運動和感覺功能障礙[1]。ASCI 的主要損傷機制包括軸突的失連、神經(jīng)細(xì)胞的凋亡與壞死等。目前尚無有效的方法治療ASCI。近年來，組織工程學(xué)的興起為ASCI 的治療提供了新方向，并取得了不少進展[2-3]，其基本思路是生物支架+種子細(xì)胞原位移植于受損脊髓處，提供細(xì)胞再生的微環(huán)境及通路，以期重塑傳導(dǎo)束及促進軸突再生。本研究通過對尿液細(xì)胞（urine cell，UC）進行重編程建立誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs），并定向分化為神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs），再將3D 打印支架載iPSCs 分化的NSCs 移植至受損脊髓，探討3D 打印支架載UC 來源重編程iPSCs 分化的NSCs 對ASCI大鼠的療效。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和標(biāo)本 SPF 級8 周齡雄性SD 大鼠42只，體重（200±10）g；SPF 級5 周齡雄性SD 小鼠14 只，體重（21±3）g；均購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2019-0004。均分籠飼養(yǎng)于屏障環(huán)境內(nèi)，室溫20～25 ℃，12 h 光照/12 h 黑暗交替的環(huán)境，自由攝食攝水。操作均嚴(yán)格遵守《實驗動物管理條例》的相關(guān)規(guī)定。采集1 例23 歲健康成年男性的尿液作為實驗標(biāo)本，經(jīng)杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過，患者簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器 聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）（aladdin P133293）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）（ab53554）、微管蛋白（β-tubulin Ⅲ）（ab52623）、生長相關(guān)蛋白43（GAP-43）（ab75810）、巢蛋白（Nestin）（OM264981）、FBS（F8687）均購于美國Sigma 公司；神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）（bs-10445R）購于中國Bioss 公司；原代神經(jīng)元細(xì)胞基礎(chǔ)轉(zhuǎn)染（Amaxa Basic Nucleofector）試劑盒（VPI-1003）購于德國Lonza 公司；ALP 檢測試劑盒（KL-ALP-Ra）購于上海康朗生物科技有限公司；硫酸肝素（QC30767）購于美國GlpBio 公司；牛血清白蛋白（BSA）購于中國AMRESCO 公司；熒光顯微鏡（CKX53）購于日本Olympus 公司；冰凍切片機（CMll00）購于德國Leica 公司；高速冷凍離心機（HC-3018R）購于安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；生物信號采集處理系統(tǒng)（medlab-1）購于南京卡爾文生物科技有限公司；3D 打印機購于杭州捷諾飛生物科技有限公司；冷場發(fā)射高分辨掃描電鏡（S-4300）購于日本Hitachi 公司；可控性皮質(zhì)損傷撞擊儀（mode 6.3）購于美國Custom Design 公司；手術(shù)器械購于江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司。

1.3 UC 來源iPSCs 的分離及鑒定 UC 分離及構(gòu)建iPSCs 參照Zhou 等[4]的方法。采集1 例23 歲健康成年男性尿液200 ml，進行細(xì)胞培養(yǎng)，按1∶2～1∶3 傳代，取第3 代UC 進行轉(zhuǎn)染，電轉(zhuǎn)染使用原代神經(jīng)元細(xì)胞基礎(chǔ)轉(zhuǎn)染試劑盒，培養(yǎng)6～10 d，待iPSCs 克隆出現(xiàn)（細(xì)胞出現(xiàn)聚集、核質(zhì)比增大等變化），用玻璃針收集iPSCs 克隆并按1∶3～1∶5 進行傳代。挑取克隆前1 d 接種飼養(yǎng)層細(xì)胞，在顯微鏡下，選取狀態(tài)好的單克隆細(xì)胞用ALP 檢測試劑盒進行ALP 活性檢測（ALP 染色）。并將1×106個iPSCs 注入5 周齡雄性SD 小鼠背部皮下，HE 染色驗證畸胎瘤的形成。iPSCs 使用4%多聚甲醛室溫下固定15 min，0.25%（V/V）聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）/PBS 透膜10 min，室溫下4%（W/V）BSA 封閉1 h。隨后4 ℃下一抗孵育過夜，室溫下二抗孵育30 min，以4'6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核。使用的一抗為抗OCT4（1∶350，兔多克?。⒖筃ANOG（1∶1 000，兔單克隆）、抗TRA-1-81（1∶100，小鼠單克隆）、抗TRA-1-60（1∶100，小鼠單克?。６篂樯窖蚩雇肁lexa Fluor 488或568、山羊抗鼠Alexa Fluor 647。以DAPI 進行細(xì)胞核染色，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.4 iPSCs 向NSCs 的分化及鑒定 將消化下來的iPSCs 集落移至培養(yǎng)皿中，差速貼壁30 min，去除分化細(xì)胞及飼養(yǎng)層細(xì)胞，收集懸浮細(xì)胞集落，用擬胚體（EBs）培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)移至細(xì)菌培養(yǎng)皿中懸浮培養(yǎng)，隔天換液；懸浮培養(yǎng)4 d 形成成熟的EBs；應(yīng)用維甲酸+無血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)，在EBs 培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)4 d，換成無血清培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)。篩選培養(yǎng)得到的神經(jīng)球樣克隆命名為iPSCs-NSCs。取誘導(dǎo)分化好的iPSCs-NSCs 置于含10%FBS 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基先用0.1%明膠包被，采用免疫熒光檢測β-tubulin Ⅲ和GFAP 表達(dá)。在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的培養(yǎng)皿用4%多聚甲醛固定15 min，在培養(yǎng)皿內(nèi)滴加5%BSA，37 ℃封閉30 min，移液槍吸掉封閉液，培養(yǎng)皿內(nèi)滴加一抗Nestin（1∶200），4 ℃孵育過夜，PBS 沖洗，移液槍吸干培養(yǎng)皿內(nèi)多余液體后滴加熒光二抗FITC（1∶100），37 ℃孵育45 min，PBS沖洗，滴加DAPI 避光孵育5 min 進行細(xì)胞核染色。PBS沖洗多余的DAPI，50%甘油封閉培養(yǎng)皿，熒光顯微鏡下觀察iPSCs-NSCs 特異性標(biāo)志物Nestin 的表達(dá)。

1.5 3D 打印硫酸肝素-膠原蛋白支架 采用3D 打印技術(shù)聯(lián)合真空冷凍干燥法。?、裥湍z原蛋白100 mg、Ⅱ型膠原蛋白10 mg 和硫酸肝素1 mg，加入PLGA 200 mg，充分混勻，增稠劑提高漿料的黏稠性與穩(wěn)定性。打開氮氣，將配制好的漿料置于物料桶內(nèi)，設(shè)置好分壓。選擇打印針頭并進行物料出料校準(zhǔn)。設(shè)置與調(diào)節(jié)打印參數(shù)，包括出料溫度、平臺溫度等。三維支架成型，室溫下放置4 h 以上，45 與60 ℃分別恒溫干燥箱中持續(xù)干燥12 h。電鏡下觀察支架形態(tài)。

1.6 支架細(xì)胞預(yù)處理 將3D 支架截成約2～3 mm 的小段，置于干細(xì)胞培養(yǎng)基中浸泡48 h 后，在無菌操作臺中風(fēng)干，滅菌備用。將iPSCs-NSCs 細(xì)胞培養(yǎng)至第7 天時，消化計數(shù)，將1×106個細(xì)胞濃縮為0.2 ml，滴于預(yù)處理過的支架上，置于培養(yǎng)箱中2 h 后用于實驗。

1.7 實驗動物分組 42 只8 周齡雄性SD 大鼠按照隨機數(shù)字表法分為模型組、支架模型組和iPSCs-NSCs 組3 組，每組14 只。

1.8 ASCI 模型建立 采用改良Allens 法通過可控性皮質(zhì)損傷撞擊儀（mode 6.3）構(gòu)建ASCI 模型。常規(guī)護理1 周后進行實驗。大鼠麻醉后去除椎板，3 組均切除2～3 mm 長損傷處脊髓，給予不同干預(yù)措施。模型組于損傷處滴入DMEM 培養(yǎng)液0.2 ml，支架模型組于損傷處植入載DMEM 培養(yǎng)液的2～3 mm 支架，iPSCs-NSCs 組于損傷處植入載iPSCs-NSCs 的2～3 mm 支架。

1.9 觀察指標(biāo)

1.9.1 開放領(lǐng)域運動測試（basson beattle bresnahan,BBB）評分 干預(yù)1、2、4、6、8 周后，采用BBB 評分評價3 組大鼠關(guān)節(jié)協(xié)調(diào)功能，總分為21 分，分?jǐn)?shù)越高，關(guān)節(jié)協(xié)調(diào)情況越好。

1.9.2 Tarlov 和Rivlin 評分 干預(yù)8 周后，采用Tarlov和Rivlin 評分評價3 組大鼠后肢運動功能，Tarlov 評分總分5 分，Rivlin 評分總分66 分，分?jǐn)?shù)越高，后肢運動功能越好。

1.9.3 神經(jīng)電生理檢測 干預(yù)8 周后，采用生物信號采集處理系統(tǒng)（medlab-1）用電極針進行測定，給予直流方波電脈沖刺激，直至可刺激觀察到后肢輕微抽搐為止，強度為7.5 V，波寬為0.2 ms，頻率為3 Hz，疊加達(dá)到50 次。計算機疊加處理測試結(jié)果，記錄運動、感覺誘發(fā)電位潛伏期長短和振幅的變化，觀察神經(jīng)電生理學(xué)情況。

1.9.4 病理檢查 干預(yù)8 周后，10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉后開胸，自左心室插管至主動脈，然后剪開右心耳，先灌注PBS 150 ml，再用含4%中性多聚甲醛的0.9%氯化鈉溶液250 ml 進行心臟灌注、固定。沿原手術(shù)正中切口，再次逐層暴露受損節(jié)段脊髓組織，切取原損傷區(qū)域胸段脊髓，石蠟包埋，連續(xù)5 μm 切片。HE 染色，光鏡下觀察3 組大鼠脊髓組織病理學(xué)改變情況。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊時，兩兩比較采用LSD-t 檢驗；方差不齊時，兩兩比較采用Tamhane's T2 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UC 來源iPSCs 構(gòu)建 從尿液樣本分離培養(yǎng)UC，結(jié)果顯示第3 代UC 呈現(xiàn)纖維樣或上皮樣，狀態(tài)良好（圖1a，見插頁）。ALP 染色顯示，UC 來源iPSCs 克隆呈陽性（圖1b，見插頁）。畸胎瘤試驗中，形成的畸胎瘤具有3 個胚層特征：軟骨（中胚層）、腸上皮（內(nèi)胚層）、神經(jīng)上皮（外胚層）（圖2）。表明UC 來源的iPSCs 在體內(nèi)具有向3 個胚層分化的能力，進一步驗證UC 來源iPSCs 的全能性。

圖1 尿液細(xì)胞（UC）及誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSCs）ALP 染色結(jié)果所見[（a：尿液中分離得到的第3 代UC，×25；b：UC 來源的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSCs）ALP 染色呈陽性，×100）]

圖2 畸胎瘤組織切片HE 染色所見[a：腸上皮（內(nèi)胚層）；b：軟骨（中胚層）；c：神經(jīng)上皮（外胚層）；HE 染色，×200]

2.2 UC 來源iPSCs 的鑒定 免疫熒光檢測顯示，UC來源iPSCs 表達(dá)全能性蛋白OCT4、NANOG、TRA-1-81、TRA-1-60（圖3，見插頁），說明UC 來源iPSCs 呈全能性狀態(tài)。

2.3 iPSCs-NSCs 鑒定 免疫熒光顯示iPSCs-NSCs 中Nestin 目的蛋白呈現(xiàn)為綠色熒光，細(xì)胞核經(jīng)DAPI 染色呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，結(jié)合上述細(xì)胞形態(tài)分析可以鑒定出細(xì)胞為iPSCs-NSCs（圖4a，見插頁）。免疫熒光顯示βtubulin Ⅲ目的蛋白呈現(xiàn)為紅色熒光，細(xì)胞核經(jīng)DAPI 染色呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，細(xì)胞大量表達(dá)，分化能力良好（圖4b，見插頁）。免疫熒光顯示GFAP 目的蛋白呈現(xiàn)為紅色熒光，細(xì)胞核經(jīng)DAPI 染色呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，細(xì)胞向周圍延伸，分化能力良好（圖4c，見插頁）。

圖3 誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSCs）表達(dá)全能性蛋白免疫熒光標(biāo)記結(jié)果（a：全能性蛋白OCT4 表達(dá)；b：全能性蛋白NANOG 表達(dá)；c：全能性蛋白TRA-1-81 表達(dá)；d：全能性蛋白TRA-1-60 表達(dá)；×200）

圖4 誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSCs）-神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）中免疫熒光鑒定結(jié)果[a：iPSCs-NSCs 特征性標(biāo)志物巢蛋白（Nestin）表達(dá)；b：iPSCs-NSCs 中微管蛋白（β-tubulin Ⅲ）表達(dá)；c：iPSCs-NSCs 中膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）表達(dá)；×100]

2.4 3D 打印支架 3D 打印技術(shù)聯(lián)合真空冷凍干燥法制造的3D 打印支架具有完美的內(nèi)部三維立體多孔結(jié)構(gòu)，掃描電鏡顯示支架橫截面呈疏松的多孔狀，孔徑大小在50 μm 左右（圖5）。

2.5 3 組大鼠BBB 評分比較 干預(yù)2、4、6、8 周后，iPSCs-NSCs 組大鼠BBB 評分均高于模型組和支架模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；而模型組和支架模型組大鼠BBB 評分比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＞0.05），見表1。

圖5 3D 打印支架（a：3D 打印的支架；b-c：掃描電鏡顯示支架橫截面呈疏松的多孔狀，b×50，c×200）

表1 3 組大鼠BBB 評分比較（分）

2.6 3 組大鼠Tarlov 和Rivlin 評分比較 干預(yù)8 周后，iPSCs-NSCs 組大鼠Tarlov 和Rivlin 評分均高于模型組和支架模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；而模型組和支架模型組大鼠Tarlov 和Rivlin 評分比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＞0.05），見表2。

表2 3 組大鼠Tarlov 和Rivlin 評分比較（分）

2.7 3 組大鼠神經(jīng)電生理檢測結(jié)果比較 干預(yù)8 周后，iPSCs-NSCs 組大鼠運動和感覺誘發(fā)電位潛伏期均短于模型組和支架模型組，運動和感覺誘發(fā)電位振幅均大于模型組和支架模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；而模型組和支架模型組大鼠運動和感覺誘發(fā)電位潛伏期、振幅比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＞0.05），見表3。

表3 3 組大鼠神經(jīng)電生理檢測結(jié)果比較

2.8 3 組大鼠脊髓組織病理學(xué)改變比較 干預(yù)8 周后，HE 染色顯示模型組大鼠脊髓組織受損，組織水腫明顯，細(xì)胞稀疏（圖6a）；支架模型組大鼠脊髓組織受損程度輕于模型組，組織水腫，細(xì)胞稀疏（圖6b）；iPSCs-NSCs 組大鼠脊髓組織生長良好，細(xì)胞致密，空泡減小，組織水腫消失（圖6c）。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，ASCI 大鼠經(jīng)UC 來源重編程iPSCs-NSCs 聯(lián)合3D 支架移植治療后，BBB 評分、Tarlov 和Rivlin 評分均明顯升高，提示UC 來源重編程iPSCs-NSCs 聯(lián)合3D 打印支架移植可明顯改善大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。ASCI 后造成上下行神經(jīng)傳導(dǎo)束中斷及微環(huán)境受損是ASCI 后截癱的根源。因此，如何促進上下行神經(jīng)傳導(dǎo)束連接及微環(huán)境的修復(fù)是治療ASCI 的重點。近年來組織工程技術(shù)為ASCI 的治療提供了新的思路：良好的生物相容性及合理的支架設(shè)計可以為受損軸突提供橋梁，種子細(xì)胞依附于橋梁上并增殖，為促進脊髓神經(jīng)功能的恢復(fù)提供了良好的基礎(chǔ)。本研究創(chuàng)新性地利用3D 打印支架將種子細(xì)胞修飾后移植于受損脊髓處，結(jié)果表明3D 打印支架+iPSCs-NSCs 聯(lián)合能明顯促進大鼠運動、感覺功能的恢復(fù)和神經(jīng)元的恢復(fù)。

NSCs 是一種多能干細(xì)胞，有永久的增殖能力及分化多向性，是理想的種子細(xì)胞。NSCs 可分化成星型膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，具有神經(jīng)營養(yǎng)、免疫調(diào)節(jié)和修復(fù)的作用，能促進感覺和認(rèn)知功能恢復(fù)，在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的前景較好[5]。但既往研究中，NSCs多來源于人類胎兒組織或者胚胎干細(xì)胞[6-7]，受到倫理學(xué)限制難以在臨床中廣泛應(yīng)用。隨著iPSCs 的出現(xiàn)，研究者們發(fā)現(xiàn)iPSCs 可以作為NSCs 的來源，并且在動物實驗中發(fā)現(xiàn)iPSCs-NSCs 同樣可以改善ASCI 后運動功能障礙，iPSCs-NSCs 移植到大鼠脊髓受損區(qū)域后，在該區(qū)域大部分分化成神經(jīng)元，但是這項技術(shù)仍然受制于iPSCs 本身提取效率的低下[8]。雖然目前iPSCs 可以從多種細(xì)胞[9-12]中通過重編程獲得，但是大部分方法取樣是損傷性的，導(dǎo)致收集樣本較困難。Zhou 等[4]報道人UC可被誘導(dǎo)為iPSCs，具有無創(chuàng)、費用低的優(yōu)點。這些細(xì)胞大部分保留正常的功能且容易獲得，是進行體外研究的理想細(xì)胞來源。因此本研究收集UC 作為細(xì)胞來源，誘導(dǎo)iPSCs，并進行畸胎瘤檢測及全能性蛋白免疫熒光檢測，證實了UC 來源iPSCs 具有與胚胎干細(xì)胞相似的全能性。本體外實驗中，NSCs 的特征性標(biāo)志物Nestin表達(dá)，證實了iPSCs 向NSCs 的成功分化。GFAP 和βtubulin 分化良好，說明本實驗成功將UC 重編程為iPSCs，并誘導(dǎo)UC 來源iPSCs 分化為NSCs。

圖6 干預(yù)8 周后各組大鼠HE 染色結(jié)果所見[a：模型組；b：支架模型組；c：誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSCs）-神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）組；HE 染色，×100]

生物支架在治療中應(yīng)確保種子細(xì)胞保留在脊髓損傷部位，調(diào)節(jié)微環(huán)境及填充病變腔并誘導(dǎo)其定向生長[13]。傳統(tǒng)支架多采用高溫?zé)坪湍Ｐ妥⑺?，精度難以掌控，且不能隨意改變支架的孔隙。近年來3D 打印技術(shù)可以通過設(shè)置不同參數(shù)打印不同規(guī)格的支架，且具有成型迅速、個性化需求及規(guī)模量產(chǎn)等優(yōu)點[14-15]。3D 打印支架為中空多孔的結(jié)構(gòu)，為上下行傳導(dǎo)束的重建和軸突生長提供通道并除去物理隔離，對改善受損組織物理微環(huán)境有著積極的作用；本研究打印的支架孔隙約為50 μm，不僅可以提供細(xì)胞的依附場所，還可以提供細(xì)胞增殖的空間。既往研究證實生物支架+種子細(xì)胞具有較好的相容性，能促進大鼠運動及感覺的恢復(fù)[16-17]。本實驗中iPSCs-NSCs 能在支架孔中黏附、存活以及生長，表明生物支架為iPSCs-NSCs 提供了較好的微環(huán)境，促進了神經(jīng)纖維的再生，因此支架和iPSCs-NSCs 具有較好的相容性，與上述研究結(jié)果基本一致。

綜上所述，UC 來源iPSCs-NSCs 聯(lián)合3D 打印支架能促進大鼠運動及感覺功能恢復(fù)，但目前僅處于基礎(chǔ)實驗階段，應(yīng)用于臨床還需更多、更大的樣本參與。UC來源iPSCs-NSCs 和3D 打印支架的聯(lián)合應(yīng)用為臨床治療ACSI 提供了更為簡便的方法，且更容易通過倫理學(xué)審查。