胡業(yè)曉 朱仁武 張煜程 陳旭晨 趙茂森

Na+/H+交換蛋白-1（Na+/H+exchanger 1，NHE-1）是調節(jié)細胞內pH 的重要跨膜蛋白，它以胞內一個H+，胞外一個Na+進行等分子比例的跨膜交換，排出細胞內H+，從而維持細胞內pH 的穩(wěn)定，同時調節(jié)細胞內滲透壓和細胞體積[1]?？张菪唾|子ATP 酶（vacuolar H+-ATPase，V-ATPase）廣泛分布于真核細胞的囊泡膜和細胞膜上，依賴ATP 逆濃度梯度將H+泵出細胞外或泵入細胞器囊泡腔內[2]。兩者共同維持細胞內pH 的穩(wěn)定。細胞內pH 穩(wěn)定是維持細胞正常功能的前提，當細胞內開始出現(xiàn)酸化時，隨著酸化程度的不斷加深，正常細胞會出現(xiàn)凋亡和壞死。近年來研究表明，NHE-1 蛋白和VATPase 在腫瘤細胞中的活性表達水平明顯增高，與腫瘤的發(fā)生密切相關[3-6]。本研究分析NHE-1 蛋白和VATPase 在胃癌和癌前病變組織中的表達差異，探討兩者在胃癌組織中不同程度的表達與臨床病理特征的關系、兩者在胃癌組織中表達的相關性及對胃癌患者預后生存時間的臨床意義。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2014 年1 月至2019 年12 月在溫州市中西醫(yī)結合醫(yī)院行胃鏡檢查時采取的胃黏膜組織標本及行胃癌手術采取的胃癌組織標本共320 例，其中原發(fā)性胃癌標本152 例，正常胃黏膜標本55 例，癌前病變組織113 例（慢性萎縮性胃炎42 例、腸上皮化生30 例、異型增生41 例）。胃鏡標本取自胃竇部及胃內病變部位，胃癌標本取自手術切除后的胃癌組織，均經(jīng)過HE染色病理檢查證實。納入標準：（1）符合胃癌及癌前病變的診斷標準，且經(jīng)臨床表現(xiàn)、影像學檢查及胃鏡、手術后病理證實為胃癌及癌前病變；（2）均行胃癌手術及胃鏡治療；（3）年齡≤80 歲且能耐受手術治療；（4）可以獲得長期隨訪。排除標準：（1）臨床資料不完整或不能完成隨訪者；（2）合并有其他重要臟器疾病或不能耐受手術者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批通過，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 NHE-1 蛋白及V-ATPase 表達水平檢測 采用免疫組化SP 染色法。制作4 μm 厚石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。3%H2O2孵育以消除內源性過氧化物酶活性。10%正常山羊血清封閉，加入一抗（1∶250 抗NHE-1 抗體、1∶250 抗V-ATPase 抗體）4 ℃過夜。第二天滴加生物素標記的二抗（抗NHE-1 蛋白抗體、抗V-ATPase 抗體），滴加辣根酶標記的鏈霉卵白素，DAB 顯色。自來水充分沖洗，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明和樹膠封片，顯微鏡下觀察NHE-1 蛋白和V-ATPase 表達的特點和陽性定位?？筃HE-1 蛋白抗體及抗V-ATPase 抗體試劑盒均購自美國圣克魯斯生物技術公司。

1.3 觀察指標 陽性細胞表現(xiàn)為黃色至棕褐色顆粒，NHE-1 蛋白及V-ATPase 主要表達于細胞膜上和細胞質中。在光學顯微鏡下，每張切片隨機觀察5 個高倍視野（×400），每個視野計數(shù)200 個細胞進行評分和記錄。陽性細胞百分比：無陽性細胞為0 分，＜10%為1 分，10%～50%為2 分，51%～100%為3 分。染色強度：無顯色為0 分，黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。兩者表達的總評分為染色強度和陽性細胞百分比之和：0～2 分為陰性，3～4 分為弱陽性，5～6 分為強陽性[7]。在預后分析中，將NHE-1 蛋白和V-ATPase 均為0～2 分記為NHE-1 蛋白和V-ATPase 均不表達組，NHE-1 蛋白為3～6 分且V-ATPase 為0～2 分記為NHE-1 蛋白表達組，V-ATPase 為3～6 分且NHE-1 蛋白為0～2 分記為V-ATPase 表達組，兩者均為3～6 分記為NHE-1 蛋白和V-ATPase 均表達組。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料多組間比較采用χ2檢驗，兩兩比較采用χ2分割法（P＜0.0125）。等級資料多組間比較采用Kruskal-Wallis H 檢驗，兩兩比較采用Mann-Whitney U 檢驗（Bonferroni 校正，3 組間兩兩比較P＜0.0167，4 組間兩兩比較P＜0.0125）。采用Spearman 等級相關分析NHE-1 蛋白表達和V-ATPase 表達的相關性。預后分析采用Kaplan-Meier 生存曲線。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胃癌及癌前病變組織中NHE-1 蛋白及V-ATPase的表達 NHE-1 蛋白及V-ATPase 在正常胃黏膜組織中均無表達，但在胃癌組織及癌前病變組織中均有不同程度的表達。胃癌組織及癌前病變組織中NHE-1 蛋白及V-ATPase 的陽性表達率比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中NHE-1 蛋白及V-ATPase 的陽性表達率均高于慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生和異型增生等癌前病變組織，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.0125），見表1。

表1 胃癌及癌前病變組織中NHE-1 蛋白及V-ATPase 的表達[例（%）]

2.2 胃癌組織中NHE-1 蛋白及V-ATPase 表達與臨床病理特征的關系 胃癌組織中NHE-1 蛋白及VATPase 的表達與性別、年齡、腫瘤大小、分化程度均無關（均P ＞0.05），但與浸潤深度、淋巴結轉移、TNM 分期均有關（均P＜0.05）。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，浸潤深度T2、T3、T4時NHE-1 蛋白及V-ATPase 的表達與T1比較，差異均有統(tǒng)計意義（均P＜0.0125）；淋巴結轉移N1、N2、N3時NHE-1 蛋白及V-ATPase 的表達與N0比較，差異均有統(tǒng)計意義（均P＜0.0125）；TNM 分期Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期NHE-1 蛋白及V-ATPase 的表達與Ⅰ期比較，差異均有統(tǒng)計意義（均P＜0.0125），見表2。

2.3 胃癌組織中NHE-1 蛋白表達和V-ATPase 表達的相關性分析 Spearman 等級相關分析顯示，胃癌組織中NHE-1 蛋白表達和V-ATPase 表達呈正相關（r=0.299，P＜0.05），見表3。

表2 胃癌組織中NHE-1 蛋白及V-ATPase 表達與臨床病理特征的關系（例）

表3 胃癌組織中NHE-1 蛋白表達和V-ATPase 表達的相關性（例）

2.4 NHE-1 蛋白表達和V-ATPase 表達與預后的相關性分析 NHE-1 蛋白表達陰性、弱陽性和強陽性組中位生存時間分別為48（95%CI：42.643～53.357）、39（95%CI：29.344～48.656）和28（95%CI：20.949～35.051）個月，3 組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.0167），見圖1（插頁）。V-ATPase表達陰性、弱陽性和強陽性組中位生存時間分別為50（95%CI：45.920～54.080）、32（95%CI：26.410～37.590）和27（95%CI：22.696～31.304）個月，3 組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.0167），見圖2（插頁）。NHE-1 蛋白和V-ATPase 均表達組（70 例）、NHE-1 蛋白表達組（9 例）、V-ATPase 表達組（45 例）和NHE-1 蛋白和V-ATPase 均不表達組（28 例）中位生存時間分別為31（95%CI：25.784～36.216）、44（95%CI：40.120～47.880）、42（95%CI：39.140～44.860）和48（95%CI：46.790～49.210）個月，4 組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，NHE-1 蛋白和V-ATPase均表達組分別與NHE-1 蛋白表達組、V-ATPase 表達組、NHE-1 蛋白和V-ATPase 均不表達組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.0125），V-ATPase 表達組與NHE-1蛋白和V-ATPase 均不表達組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.0125），見圖3（插頁）。

圖1 Na+/H+交換蛋白-1（NHE-1）蛋白表達的胃癌患者預后生存曲線

圖2 空泡型質子ATP 酶（V-ATPase）表達的胃癌患者預后生存曲線

圖3 Na+/H+交換蛋白-1（NHE-1）蛋白和空泡型質子ATP 酶（V-ATPase）表達的胃癌患者預后生存曲線

3 討論

相對于正常細胞而言，胃癌細胞代謝旺盛，供血、供氧量相對不足，容易造成細胞缺氧的環(huán)境，缺氧環(huán)境加速細胞對葡萄糖的酵解，使細胞內產(chǎn)生大量的乳酸和H+[8]，為了維持細胞內pH 的穩(wěn)定，胃癌細胞會開放更多高效的排酸通道，促使細胞內H+排出，因此就會過度的表達NHE-1 蛋白及V-ATPase，而大量H+排出使細胞外pH 降低，最終導致細胞酸性微環(huán)境形成[9]。其次Na+-H+交換依賴于ATP 酶供能，這一耗能過程又會反饋地刺激胃癌細胞對糖的攝取和對糖酵解的依賴，從而使胃癌細胞進行更多的Na+-H+交換，形成惡性循環(huán)，導致更多的正常細胞發(fā)生凋亡和壞死，最終進一步加速癌癥細胞的形成[10]。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中NHE-1 蛋白和V-ATPase 陽性表達率均高于癌前病變及正常胃黏膜組織，且胃癌組織中NHE-1 蛋白表達和V-ATPase 表達呈正相關。NHE-1 蛋白的表達會促進V-ATPase 表達，兩者協(xié)同發(fā)揮作用來維持細胞內pH 穩(wěn)定，因此也造成細胞酸性微環(huán)境形成，加速胃癌細胞的產(chǎn)生。

胃癌細胞可以通過上調NHE-1 蛋白和V-ATPase的表達，將癌細胞糖酵解產(chǎn)生的大量H+泵出細胞外，維持癌細胞的生存并形成腫瘤酸性微環(huán)境，酸性微環(huán)境形成會促使癌細胞基因表型的改變以獲得更強勁的生命力，還有利于腫瘤血管的生成以及癌細胞外基質的重建，導致癌細胞的浸潤和轉移[11]。研究表明，NHE-1蛋白和V-ATPase 在多種腫瘤細胞中都存在過表達，且與腫瘤細胞的增殖生長、浸潤轉移和凋亡都有著密切的聯(lián)系[11-13]。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中NHE-1 蛋白及VATPase 表達情況與浸潤深度、淋巴結轉移、TNM 分期均有關，表明NHE-1 蛋白及V-ATPase 的表達越強則胃癌組織的生長越活躍、淋巴結的轉移程度越廣泛、TNM 分期越晚。

胃癌細胞上NHE-1 蛋白和V-ATPase 的過表達不僅有助于胃癌細胞的生長和轉移，也會對化療和放療產(chǎn)生抵抗[14]。研究表明NHE-1 蛋白和V-ATPase 的過表達更容易使胃癌細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性[15-17]。細胞內pH 的穩(wěn)定對化療藥物發(fā)揮細胞毒反應起到重大作用，因為細胞酸中毒是細胞凋亡的起始點，同時對耐藥性的產(chǎn)生也具有作用，耐藥的胃癌細胞內化療藥物濃度會明顯降低[16]，使化療效果下降，從而縮短生存時間。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中不同程度NHE-1 蛋白和V-ATPase 的表達其生存時間存在明顯差異，表達程度越高胃癌生存時間越短。通過將NHE-1 和V-ATPase 同時表達跟單一表達及同時不表達之間的生存時間進行比較，發(fā)現(xiàn)同時表達的生存時間明顯縮短，說明酸性微環(huán)境的形成與胃癌預后存在相關性。

綜上所述，本研究通過Spearman 等級相關分析顯示胃癌組織中NHE-1 蛋白表達和V-ATPase 表達呈正相關，且兩者表達與胃癌的浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期和預后生存時間均有關。提示NHE-1 蛋白和VATPase 異常表達可能在胃癌發(fā)生、侵襲、轉移的過程中起正向調控作用，兩者有望成為預防、治療和評估胃癌預后的新的生物學標志物。