周燕 金華良 王利民 葉健 厲蓓 蔡萃

哮喘患者伴有抑郁相當(dāng)普遍，在華東地區(qū)尤為常見，已造成巨大的社會(huì)負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)損失，因此成為備受關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。研究提示抑郁是發(fā)生哮喘的風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志物，且抑郁患者哮喘的發(fā)病率明顯增加[1]；同樣，哮喘患者發(fā)生抑郁的風(fēng)險(xiǎn)較普通人群明顯升高[2]。長期抑郁可使哮喘控制測(cè)試（asthma control test,ACT）評(píng)分明顯降低，氣道炎癥加重，使哮喘治療的依從性受到嚴(yán)重影響[2]，導(dǎo)致哮喘急性發(fā)作的頻率明顯增加，生活質(zhì)量明顯下降[3-4]。然而抑郁引起哮喘癥狀加重的機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚未闡明。氣道炎癥是哮喘關(guān)鍵的發(fā)病機(jī)制，而氣道高反應(yīng)性則是哮喘的重要特征，因此本研究通過制備哮喘伴抑郁動(dòng)物模型，探討抑郁對(duì)哮喘動(dòng)物氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性的作用。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 卵蛋白（規(guī)格：V 級(jí)-50 g，批號(hào)：1001911682）、乙酰甲膽堿（規(guī)格：1 g，批號(hào)：PHR1943-1G）購于美國Sigma 公司；地塞米松（1 ml∶5 mg，批號(hào)：200210）購于廣州白云山天心制藥股份有限公司；免疫佐劑（imject alum，規(guī)格：50 ml，批號(hào)：77161）購于美國Thermo Fisher 公司；小鼠ELISA 試劑盒：IL-4（規(guī)格：96 T，批號(hào)：A204H90554），IL-5（規(guī)格：96 T，批號(hào)：A205H90135）及IL-13（規(guī)格：96 T，批號(hào)：A21390732）均購于美國ebioscience（San Diego）公司；IgE 小鼠ELISA試劑盒（規(guī)格：96 T，批號(hào)：0574155）購于美國Cayman 公司；小鼠無約束全身體積描記系統(tǒng)（型號(hào)：NAM）購于美國Buxco 公司；霧化器（型號(hào)：PARI Boy Sx 085G3005）購于德國百瑞公司；小動(dòng)物行為學(xué)視頻記錄與分析系統(tǒng)（型號(hào)：SMART V3.0）購于西班牙Panlab 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康6 周齡雄性Balb/c 小鼠40只，體重16～20 g，由上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、單純哮喘組、哮喘伴抑郁組和地塞米松組4 組，每組10 只。正常組采用0.9%氯化鈉溶液霧化吸入；單純哮喘組采用卵蛋白致敏與激發(fā)制備單純哮喘模型；哮喘伴抑郁組和地塞米松組則在哮喘模型基礎(chǔ)上給予4 周未預(yù)知的慢性應(yīng)激刺激；地塞米松組從給予慢性應(yīng)急刺激開始起采用地塞米松0.5 mg/kg，1 次/d，干預(yù)4 周，其余各組采用0.9%氯化鈉溶液。

1.3 模型制備

1.3.1 單純哮喘模型 實(shí)驗(yàn)第0 天在小鼠腹膜腔內(nèi)注射致敏液（含卵蛋白40 μg、佐劑凝膠imject alum 0.05 ml、0.9%氯化鈉溶液約0.15 ml）0.1 ml，同時(shí)給予致敏液皮下注射0.1 ml，第7 天重復(fù)致敏，第14 天起予每日上午以1%卵蛋白霧化吸入激發(fā)哮喘5 周。

1.3.2 哮喘伴抑郁模型 第21 天起在單純哮喘模型基礎(chǔ)上制作抑郁模型，給予未預(yù)知的慢性應(yīng)激刺激，包括6 ℃冰水游泳5 min，44 ℃熱烘5 min，夾尾1 min，潮濕墊料飼養(yǎng)（每100 g 玉米芯加200 ml 水）8 h、禁食水15 h，通宵照明12 h，束縛在狹小的管子1 h，鼠籠傾斜30° 3 h 等刺激，刺激隨機(jī)安排4 周。第21 天起每日上午以1%卵蛋白霧化吸入激發(fā)哮喘0.5 h，連續(xù)4 周以維持哮喘癥狀。

1.4 曠場(chǎng)試驗(yàn)分析小鼠行為學(xué)變化 為鑒定抑郁模型是否成功建立，采用SMART V3.0 行為學(xué)視頻記錄與分析系統(tǒng)對(duì)小鼠抑郁狀態(tài)，自發(fā)活動(dòng)，探索行為進(jìn)行定量評(píng)價(jià)。試驗(yàn)開始前小鼠先適應(yīng)環(huán)境2 h，將小鼠放入曠場(chǎng)裝置中央，并打開攝像系統(tǒng)，采用SMART V3.0 行為學(xué)視頻記錄與分析系統(tǒng)分析小鼠中央活動(dòng)時(shí)間（即潛伏期）、中央活動(dòng)距離/總的活動(dòng)距離比等參數(shù)。

1.5 強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)分析小鼠抑郁水平 對(duì)各組小鼠進(jìn)行強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)，將小鼠置于水深l5 cm，直徑約10 cm，水溫25 °C 的玻璃容器內(nèi)，讓其強(qiáng)迫游泳6 min，采用SMART V3.0 行為學(xué)視頻記錄與分析系統(tǒng)分析第3～6 min 內(nèi)小鼠漂浮不動(dòng)的時(shí)間（強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間）（即小鼠一開始在水中拼命游泳、攀爬容器內(nèi)壁試圖逃跑，到一定時(shí)間后放棄掙扎，僅有微小的肢體運(yùn)動(dòng)以維持頭部露出水面呼吸，呈漂浮狀態(tài)）。

1.6 氣道高反應(yīng)檢測(cè) 采用無創(chuàng)肺功能儀。造模結(jié)束后，將自然狀態(tài)下的小鼠置入體描箱中，先測(cè)定基礎(chǔ)增強(qiáng)呼氣間歇（enhanced pause，Penh）值，以反映氣道高反應(yīng)程度。隨后用乙酰甲膽堿激發(fā)，濃度由低到高依次為0、6.25、12.5、25 和50 g/L，每次霧化吸入2 min，記錄3 min，記錄不同濃度乙酰甲膽堿激發(fā)的Penh 值。Penh計(jì)算公式：呼氣峰壓力（PEP）/吸氣峰壓力（PIP）×呼氣間歇（Pause），其中Pause=[呼氣相時(shí)間（Te）-呼氣相松弛時(shí)間（Tr）]/Tr。

1.7 血清IgE 水平測(cè)定 測(cè)定肺功能后，給予小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，予以心臟采血，3 000 r/min離心10 min 后，分離血清，采用ELISA 法測(cè)定血清IgE水平。

1.8 肺泡灌洗液細(xì)胞因子檢測(cè) 使用注射器吸取1 ml PBS 從導(dǎo)管緩慢注入灌洗雙肺，可見小鼠肺部逐漸膨脹，顏色由紅色變成粉白色，待液體完全進(jìn)入肺內(nèi)，輕壓肺部，以保證充分灌洗，5 s 后回抽液體，反復(fù)2 次，回收率為60%～80%。將液體3 000 r/min 離心10 min，取上清液，采用ELISA 法測(cè)定肺泡灌洗液IL-4、IL-5、IL-13 水平。

1.9 肺組織HE 染色 取右肺上葉，10%中性甲醛固定，脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片，厚4 μm，行HE 染色，光鏡下觀察小鼠支氣管黏膜下和周圍肺組織炎性細(xì)胞浸潤。參照文獻(xiàn)[5]，對(duì)氣道炎癥程度進(jìn)行評(píng)分：0 分：沒有炎癥細(xì)胞；1 分：少量炎癥細(xì)胞；2 分：炎癥細(xì)胞形成環(huán)狀，層厚1 個(gè)細(xì)胞；3 分：炎癥細(xì)胞形成環(huán)狀，層厚2～4個(gè)細(xì)胞；4 分：炎癥細(xì)胞形成環(huán)狀，層厚4～5 個(gè)細(xì)胞；5分：炎癥細(xì)胞形成環(huán)狀，層厚＞5 個(gè)細(xì)胞。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，方差齊性時(shí)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t 檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)，多組間比較采用Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)，兩兩比較采用Mann-Whiteney U 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠行為學(xué)變化比較 與正常組及單純哮喘組比較，哮喘伴抑郁組和地塞米松組小鼠中央活動(dòng)時(shí)間和中央運(yùn)動(dòng)距離/總的活動(dòng)距離比均明顯減少（均P＜0.01）；而哮喘伴抑郁組和地塞米松組小鼠中央活動(dòng)時(shí)間和中央運(yùn)動(dòng)距離/總的活動(dòng)距離比比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

表1 各組小鼠行為學(xué)變化比較

2.2 各組小鼠強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間比較 正常組、單純哮喘組、哮喘伴抑郁組和地塞米松組小鼠強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間分別為（38.2±7.7）、（82.7±25.1）、（156.9±17.4）和（103.4±20.1）s，各組小鼠強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組及單純哮喘組比較，哮喘伴抑郁組和地塞米松組小鼠強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間均延長（均P＜0.05）；而哮喘伴抑郁組和地塞米松組小鼠強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 各組小鼠不同濃度乙酰甲膽堿激發(fā)時(shí)Penh 值比較 不同濃度（6.25、12.5、25 g/L）乙酰甲膽堿激發(fā)下，與正常組、單純哮喘組和地塞米松組比較，哮喘伴抑郁組小鼠Penh 值均明顯升高（均P＜0.01），見圖1。

圖1 各組小鼠不同濃度乙酰甲膽堿激發(fā)時(shí)增強(qiáng)呼氣間歇（Penh）值比較（與哮喘伴抑郁組比較，**P＜0.01）

2.4 各組小鼠肺泡灌洗液細(xì)胞因子及血清IgE 水平比較 與正常組比較，哮喘伴抑郁組小鼠肺泡灌洗液IL-4、IL-5、IL-13 水平及血清IgE 水平均升高（均P＜0.01）。與單純哮喘組比較，哮喘伴抑郁組小鼠肺泡灌洗液IL-5 水平升高（P＜0.05），但兩組小鼠肺泡灌洗液IL-4、IL-13 水平及血清IgE 水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。與哮喘伴抑郁組比較，地塞米松組小鼠肺泡灌洗液IL-4、IL-5、IL-13 水平及血清IgE 水平均下降（均P＜0.05），見表2。

表2 各組小鼠肺泡灌洗液細(xì)胞因子及血清IgE 水平比較

2.5 各組小鼠肺組織氣道炎癥評(píng)分比較 正常組小鼠肺組織切片支氣管管腔光滑，氣道及肺泡見少量炎性細(xì)胞浸潤；單純哮喘組小鼠氣道壁明顯增厚，可見炎性細(xì)胞浸潤在血管周圍及支氣管周圍；哮喘伴抑郁組小鼠氣道周圍炎性細(xì)胞浸潤最為顯著，管腔狹窄，部分可見黏液栓子；地塞米松組小鼠氣道壁炎性細(xì)胞浸潤程度明顯減輕，見圖2。正常組、單純哮喘組、哮喘伴抑郁組和地塞米松組小鼠肺組織氣道炎癥評(píng)分分別為（0.93±0.16）、（2.47±0.09）、（3.39±0.11）和（1.13±0.13）分。與正常組及單純哮喘組比較，哮喘伴抑郁組小鼠肺組織小鼠氣道炎癥評(píng)分升高（均P＜0.05）；與哮喘伴抑郁組比較，地塞米松組氣道炎癥評(píng)分明顯降低（P＜0.01）。

圖2 各組小鼠肺組織病理HE 染色所見（a：正常組；b：單純哮喘組；c：哮喘伴抑郁組；d：地塞米松組；HE 染色，×100）

3 討論

哮喘患者較普通人群更易患抑郁，且兩者存在相互作用[6]。最近一項(xiàng)研究顯示中國約有4 500 萬哮喘患者，然而其存在的抑郁等精神疾病通常被臨床醫(yī)師所忽視[7]。抑郁可顯著加重哮喘患者的臨床癥狀，但相關(guān)機(jī)制目前尚未闡釋清楚。慢性氣道炎癥是哮喘的關(guān)鍵機(jī)制，而氣道高反應(yīng)性是哮喘的一個(gè)重要特征。因此，本研究通過構(gòu)建哮喘伴抑郁模型，探討抑郁對(duì)哮喘氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘伴抑郁小鼠在曠場(chǎng)試驗(yàn)中央活動(dòng)時(shí)間及中央活動(dòng)距離/總的活動(dòng)距離比均減少，同時(shí)強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間延長，表明本研究抑郁模型制備成功。與單純哮喘組比較，哮喘伴抑郁組小鼠氣道反應(yīng)性明顯升高，肺泡灌洗液炎癥因子及肺組織病理氣道炎癥明顯升高，提示抑郁可顯著加重哮喘氣道炎癥與氣道高反應(yīng)性。

研究認(rèn)為抑郁是導(dǎo)致哮喘急性發(fā)作的重要誘因，同時(shí)抑郁與哮喘癥狀控制不佳，治療依從性下降，生活質(zhì)量降低顯著相關(guān)[1]。此外，抑郁可上調(diào)全身炎癥因子水平，從而導(dǎo)致哮喘癥狀顯著加重[8]。既往研究發(fā)現(xiàn)抑郁可導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素不敏感，這提示哮喘伴抑郁患者可能較單純哮喘存在更為明顯的氣道炎癥[9]。本研究發(fā)現(xiàn)哮喘伴抑郁組小鼠肺組織氣道炎癥評(píng)分以及肺泡灌洗液IL-5 水平較單純哮喘組明顯升高，證實(shí)抑郁可顯著加重哮喘氣道炎癥。地塞米松對(duì)抑郁的作用仍存在爭議，既往研究提示地塞米松可改善抗抑郁藥物敏感性，具備一定的抗抑郁作用[10]。但近年來研究發(fā)現(xiàn)長期給予地塞米松，可激活應(yīng)激相關(guān)基因，從而導(dǎo)致小鼠抑郁樣或焦慮樣癥狀[11]。但本研究并未發(fā)現(xiàn)地塞米松上調(diào)慢性應(yīng)激所致的抑郁水平。這可能與不同的實(shí)驗(yàn)造模方法、地塞米松的劑量以及所采用的的動(dòng)物種類有關(guān)。

氣道高反應(yīng)是哮喘的一個(gè)顯著特征，它是指氣道對(duì)多種刺激物的反應(yīng)性異常增高，表現(xiàn)為吸入各種刺激性物質(zhì)后，異常敏感的氣道較正常人更易出現(xiàn)支氣管平滑肌的收縮，黏液分泌及免疫炎性介質(zhì)釋放，從而表現(xiàn)為氣道阻力急速短暫或較長時(shí)間的上升，以及肺通氣功能下降的一種特質(zhì)[12]。哮喘氣道炎癥與氣道高反應(yīng)性密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者吸入IL-5 后，痰嗜酸性粒細(xì)胞顯著升高，氣道高反應(yīng)顯著增加[13]。本研究發(fā)現(xiàn)哮喘伴抑郁組小鼠較單純哮喘組氣道高反應(yīng)性明顯升高，而哮喘伴抑郁組小鼠肺泡灌洗液IL-5 及氣道炎癥均較單純哮喘組明顯升高，這提示氣道高反應(yīng)增加與氣道炎癥水平上調(diào)呈正相關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過比較哮喘伴抑郁模型與單純哮喘模型，證實(shí)抑郁可顯著加重哮喘氣道炎癥與氣道高反應(yīng)。因此，哮喘患者出現(xiàn)癥狀控制不佳可能與抑郁相關(guān)，臨床醫(yī)師應(yīng)注意對(duì)哮喘患者進(jìn)行抑郁等合并癥評(píng)估。