沈和平 官俏兵 郝亞南 俞曉翔 王云 翟麗萍 韓晨陽

神經(jīng)細(xì)胞損傷是大腦結(jié)構(gòu)和功能改變的主要原因，而神經(jīng)細(xì)胞損傷最終可以造成認(rèn)知障礙，甚至發(fā)展為阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病[1-2]。在這類疾病中，炎癥因子的產(chǎn)生和釋放是引起神經(jīng)細(xì)胞損傷的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）誘導(dǎo)后大腦皮質(zhì)和海馬組織中炎癥因子的表達(dá)大量上調(diào)[3-4]，此外，LPS 還可以進(jìn)一步激活小膠質(zhì)細(xì)胞?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞炎癥的產(chǎn)生，還可以進(jìn)一步調(diào)節(jié)下游還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2（NADPH oxidase 2,NOX2）的表達(dá)[5-6]。NOX2 可以調(diào)控中樞病理性氧化應(yīng)激反應(yīng)，ROS 通過NOX2 進(jìn)一步促進(jìn)炎性小體NLRP1激活，而神經(jīng)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)主是NLRP1 介導(dǎo)的[7-8]。因此，ROS-NOX2-NLRP1 軸在神經(jīng)細(xì)胞炎癥反應(yīng)中有著重要的作用，也是炎癥反應(yīng)的重要靶點(diǎn)。在ROS 的研究中常用N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine,NAC）作為抑制劑。樟芝是一種多孔菌科真菌，也是一種食用/醫(yī)用兩用的真菌，其含有多種活性物質(zhì)。前期研究發(fā)現(xiàn)樟芝多糖（antrodia camphorata polysaccharide,ACP）對于帕金森病，尤其是神經(jīng)細(xì)胞有著良好的保護(hù)作用，其機(jī)制和炎癥的調(diào)控有關(guān)[9-10]。神經(jīng)細(xì)胞損傷是導(dǎo)致帕金森病的重要因素，所以進(jìn)一步揭示ACP 抑制神經(jīng)細(xì)胞炎癥損傷的機(jī)制對于深入了解ACP 的藥理作用有著重要的意義。本研究主要探討ACP 通過抑制ROSNOX2-NLRP1 信號減輕CNC 炎癥損傷的作用和機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和試劑 小鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞（cortical neuron cell,CNC）（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號：CPM143）及其完全培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號：CM-M143）；細(xì)胞活力CCK-8 檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：CA1210）；Annexin VFITC/PI 流式雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：CA1220）；ROS 檢測探針DCFH-DA（北京索萊寶科技有限公司，批號：D6470）；ELISA 檢測試劑盒IL-1β、IL-6、TNF-α（南京建成生物工程研究所，批號：H002、H007、H052）；LPS（美國Sigma 公司分裝）；NAC（中國MCE 公司，批號：HY-B0215）；ACP（實(shí)驗(yàn)室自備，純度95%以上）。

1.2 細(xì)胞分組及藥物干預(yù) CNC 用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至對數(shù)期，融合70%～80%左右，將細(xì)胞用胰蛋白酶消化后分組。在研究ACP 抗炎癥反應(yīng)作用的實(shí)驗(yàn)中，將CNC 細(xì)胞分為對照組、LPS 組、ACP 5 mg/L組、ACP 10 mg/L 組和ACP 20 mg/L 組。對照組為常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞，無LPS 和ACP 干預(yù)；LPS 組用0.1 mg/L LPS 誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)；ACP 各組分別使用終濃度為5、10、20 mg/L 的ACP 進(jìn)行預(yù)處理6 h 后，再用0.1 mg/L LPS 誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)。在研究ACP 通過抑制ROS 發(fā)揮作用的機(jī)制研究中，將CNC 分為LPS 組、NAC 組和NAC+ACP 組。LPS 組用0.1 mg/L LPS 誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)；NAC 組用10 mM NAC 預(yù)處理4 h 后，再用0.1 mg/L LPS 誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)；NAC+ACP 組同時用10 mM NAC 和20 mg/L ACP 預(yù)處理4 h 后，再用0.1 mg/L LPS誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

1.3 細(xì)胞活力檢測 采用CCK-8 法。將CNC 接種到96 孔板后，每組細(xì)胞設(shè)置3 個復(fù)孔（以下檢測相同），待藥物干預(yù)后，于0、3、6、12、24 h 進(jìn)行細(xì)胞活力檢測。將每孔培養(yǎng)基吸去后再加入100 μl 完全培養(yǎng)基，同時加入10 μl CCK-8 溶液，繼續(xù)孵育4 h，待細(xì)胞染色后，在450 nm 處檢測吸光度（OD）值，同時設(shè)置空白培養(yǎng)基為對照。細(xì)胞活力=（OD實(shí)驗(yàn)組-OD對照）/（OD初始-OD對照）×100%。

1.4 細(xì)胞凋亡水平檢測 采用Annexin V-FITC/PI 雙染后流式細(xì)胞術(shù)。將細(xì)胞接種到6 孔板中，干預(yù)12 h后，用0.25%胰蛋白酶消化，PBS 清洗后，2 000 r/min離心10 min，收集細(xì)胞后用預(yù)冷的PBS 重懸，再次2 000 r/min 離心10 min 后用Binding Buffer 進(jìn)行懸浮，加入5 μl Annexin V-FITC 染色，避光15 h 后，用5 μl PI 染色5 min，上機(jī)檢測。

1.5 細(xì)胞ROS 水平檢測 采用DCFH-DA 探針。將細(xì)胞接種到6 孔板中，藥物干預(yù)12 h 后棄去培養(yǎng)基。按照1∶1 000 的比例用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA 探針，每孔加入1 ml 的含DCFH-DA 探針的培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育30 min。棄去培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2 次。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞染色水平，同時檢測熒光光度值。

1.6 細(xì)胞NOX2、NLRP1 蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot 法。藥物干預(yù)12 h 后收集細(xì)胞，PBS 洗2次后加入1.0 ml 的RIPA 裂解液在冰上裂解30 min，10 000 g 轉(zhuǎn)速下離心15 min，取上清液進(jìn)行BCA 試劑盒的蛋白定量檢測。根據(jù)分子量不同分別配置8%～12% SDS-PAGE 凝膠，取蛋白液后用5×loading buffer補(bǔ)充體積至20 μl，煮沸8 min 后，80 V 電壓進(jìn)行電泳，之后轉(zhuǎn)換為120 V 電壓繼續(xù)電泳。將凝膠去除后進(jìn)行PVDF 膜的轉(zhuǎn)膜，采用300 mA 恒流轉(zhuǎn)膜0.5～2 h，PVDF 膜使用5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST 稀釋一抗，NOX2、NLRP1 的一抗稀釋比例分別為1∶500、1∶500、1∶600，一抗孵育后PVDF 膜用TBST 洗2 次后，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗孵育，二抗稀釋比例為1∶2 000。孵育完成后用化學(xué)發(fā)光法檢測，采用Image Pro-Plus 6.0 軟件進(jìn)行光密度的分析，以GAPDH 為內(nèi)參，結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白光密度值比值表示。

1.7 細(xì)胞IL-1β、IL-6 和TNF-α 表達(dá)水平檢測 根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定。CNC 分組培養(yǎng)，在ACP 干預(yù)12 h 后收集細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)基在2 000 r/min 離心15 min，除去細(xì)胞碎片和懸浮細(xì)胞，取上清液，參照ELISA 檢測試劑盒說明書檢測，利用測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞因子水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni 校正的t 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ACP 對于LPS 誘導(dǎo)下CNC 細(xì)胞活力的影響 0 h時5 組細(xì)胞活力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；而LPS 干預(yù)后，與對照組同一時間點(diǎn)比較，LPS 組細(xì)胞活力均明顯下調(diào)（均P＜0.05）；而ACP 干預(yù)后，與LPS 組同一時間點(diǎn)比較，ACP 10 mg/L 組和ACP 20 mg/L 組細(xì)胞活力均明顯上調(diào)（均P＜0.05）；且隨著ACP 濃度的升高，細(xì)胞活力明顯上調(diào)（P＜0.05），見圖1。

2.2 ACP 對于LPS 誘導(dǎo)下CNC 細(xì)胞凋亡的影響 對照組、LPS 組、ACP 5 mg/L 組、ACP 10 mg/L 組和ACP 20 mg/L 組細(xì)胞凋亡率分別為（6.43±0.65）%、（58.65±5.54）%、（38.76±4.55）%、（28.65±3.65）%和（18.65±3.11）%。LPS 干預(yù)后，與對照組比較，LPS 組細(xì)胞凋亡率明顯上調(diào)（P＜0.05）；而ACP 干預(yù)后，與LPS 組比較，ACP 5 mg/L 組、ACP 10 mg/L 組和ACP 20 mg/L 組細(xì)胞凋亡率均下調(diào)（均P＜0.05）；且隨著ACP 濃度的升高，細(xì)胞凋亡率明顯下調(diào)（P＜0.05），見圖2。

2.3 ACP 對于LPS 誘導(dǎo)下CNC 中ROS 產(chǎn)生及NOX2、NLRP1 蛋白表達(dá)的影響 對照組、LPS 組、ACP 5 mg/L組、ACP 10 mg/L 組和ACP 20 mg/L 組細(xì)胞中ROS 的熒光光度值分別為0.03±0.01、0.27±0.08、0.18±0.06、0.11±0.03、0.07±0.01。與LPS 組比較，ACP 5 mg/L 組、ACP 10 mg/L 組和ACP 20 mg/L 組細(xì)胞中ROS 的熒光光度值均降低（均P＜0.05）；且隨著ACP 濃度的升高，細(xì)胞中ROS 的熒光光度值明顯降低（P＜0.05），見圖3（插頁）。與對照組比較，LPS 組NOX2 和NLRP1 蛋白表達(dá)水平均升高（均P＜0.05）；經(jīng)ACP 干預(yù)后，與LPS 組比較，ACP 5 mg/L 組、ACP 10 mg/L 組和ACP 20 mg/L 組NOX2和NLRP1 蛋白表達(dá)水平均降低（均P＜0.05），見圖4。

圖1 樟芝多糖（ACP）對于脂多糖（LPS）誘導(dǎo)下皮層神經(jīng)細(xì)胞（CNC）細(xì)胞活力的影響（與對照組同一時間點(diǎn)比較，*P＜0.05；與LPS 組同一時間點(diǎn)比較，△P＜0.05）

圖2 樟芝多糖（ACP）對于脂多糖（LPS）誘導(dǎo)下皮層神經(jīng)細(xì)胞（CNC）細(xì)胞凋亡的影響

圖4 樟芝多糖（ACP）對于脂多糖（LPS）誘導(dǎo)下皮層神經(jīng)細(xì)胞（CNC）中NADPH 氧化酶2（NOX2）、NLRP1 蛋白表達(dá)的影響（a：各組細(xì)胞NOX2 和NLRP1 蛋白表達(dá)的電泳圖；b：各組細(xì)胞NOX2和NLRP1 蛋白表達(dá)水平比較，與對照組比較，*P＜0.05；與LPS 組比較，△P＜0.05）

圖3 樟芝多糖（ACP）對于脂多糖（LPS）誘導(dǎo)下皮層神經(jīng)細(xì)胞（CNC）中活性氧（ROS）的產(chǎn)生的影響

2.4 ACP 對于LPS 誘導(dǎo)下CNC IL-1β、IL-6 和TNF-α水平的影響 與對照組比較，LPS 組IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平均升高（均P＜0.05）；經(jīng)ACP 干預(yù)后，與LPS組比較，ACP 5 mg/L 組、ACP 10 mg/L 組和ACP 20 mg/L組IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平均降低（均P＜0.05）；且隨著ACP 濃度的升高，IL-1β、IL-6 和TNF-α 表達(dá)水平均下降（均P＜0.05），見圖5。

圖5 樟芝多糖（ACP）對于脂多糖（LPS）誘導(dǎo)下皮層神經(jīng)細(xì)胞（CNC）IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的影響（與對照組比較，*P＜0.05；與LPS 組比較，△P＜0.05）

2.5 NAC 抑制ROS 后，ACP 對于CNC 細(xì)胞凋亡的影響 LPS 組、NAC 組和NAC+ACP 組細(xì)胞凋亡率分別為（56.98±6.54）%、（28.54±4.23）%和（24.63±3.65）%。與LPS 組比較，NAC 組和NAC+ACP 組細(xì)胞凋亡率均下調(diào)（均P＜0.05）；而NAC 組和NAC+ACP 組細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見圖6。

2.6 NAC 抑制ROS 后，ACP 對于ROS 產(chǎn)生及NOX2、NLRP1 蛋白表達(dá)的影響 LPS 組、NAC 組和NAC+ACP組細(xì)胞中ROS 的熒光光度值分別為0.30±0.04、0.07±0.01、0.06±0.01。與LPS 組比較，NAC 組和NAC+ACP 組細(xì)胞中ROS 的熒光光度值均降低（均P＜0.05）；而NAC和NAC+ACP 組細(xì)胞中ROS 的熒光光度值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見圖7（插頁）。與LPS 組比較，NAC 組和NAC+ACP 組NOX2 和NLRP1 蛋白表達(dá)水平均降低（均P＜0.05）；而NAC 組和NAC+ACP 組NOX2 和NLRP1 蛋白表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05），見圖8。

2.7 NAC 抑制ROS 后，ACP 對于CNC IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的影響 與LPS 組比較，NAC 和NAC+ACP組IL-1β、IL-6 和TNF-α 表達(dá)水平均降低（均P＜0.05）；而NAC 組 和NAC+ACP 組IL-1β、IL-6 和TNF-α 表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05），見圖9。

圖6 N-乙酰半胱氨酸（NAC）抑制活性氧（ROS）后，樟芝多糖（ACP）對于皮層神經(jīng)細(xì)胞（CNC）細(xì)胞凋亡的影響（LPS 為脂多糖）

圖7 N-乙酰半胱氨酸（NAC）抑制活性氧（ROS）后，樟芝多糖（ACP）對于ROS 產(chǎn)生的影響（LPS 為脂多糖）

圖8 N-乙酰半胱氨酸（NAC）抑制活性氧（ROS）后，樟芝多糖（ACP）對于NADPH 氧化酶2（NOX2）、NLRP1 蛋白表達(dá)的影響[a：各組細(xì)胞NOX2 和NLRP1 蛋白表達(dá)的電泳圖；b：各組細(xì)胞NOX2 和NLRP1 蛋白表達(dá)水平比較，與脂多糖（LPS）組比較，*P＜0.05]

圖9 N-乙酰半胱氨酸（NAC）抑制活性氧（ROS）后，樟芝多糖（ACP）對于皮層神經(jīng)細(xì)胞（CNC）IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的影響[與脂多糖（LPS）組比較，*P＜0.05]

3 討論

神經(jīng)細(xì)胞損傷是多種類型神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要事件，在阿爾茨海默病、帕金森病、多發(fā)性硬化癥以及腦缺血疾病中，神經(jīng)細(xì)胞損傷都可以造成中樞不可逆轉(zhuǎn)的傷害，而在損傷的機(jī)制研究中，氧化應(yīng)激、線粒體功能損傷、慢性炎癥等都可以造成神經(jīng)細(xì)胞的損傷[11-12]。ROS 目前被認(rèn)為是氧化損傷的重要因素。ROS 是正常的代謝產(chǎn)物，其中包括超氧陰離子、羥基自由基以及氧自由基等。細(xì)胞的ROS 主要有外源性和內(nèi)源性兩種，內(nèi)源性ROS 主要由線粒體呼吸鏈NOX 系統(tǒng)產(chǎn)生[13]。線粒體作為ROS 的主要來源，可以產(chǎn)生大多數(shù)ROS。線粒體電子傳遞鏈主要由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸酶、琥珀酸氧化還原酶、細(xì)胞色素C 還原酶等構(gòu)成。NOX 是一種跨膜的酶復(fù)合物，其中NOX2 主要表達(dá)于吞噬細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞以及心機(jī)細(xì)胞[14-15]。在人的神經(jīng)組織，包括海馬區(qū)、脊髓、皮質(zhì)區(qū)等都有NOX2 的表達(dá)。NOX2 在正常生理環(huán)境下保持動態(tài)平衡，而接受外界信號后可以迅速產(chǎn)生ROS，造成細(xì)胞內(nèi)NOX2 濃度的升高，ROS增高主要可以介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[16-17]。ROS 主要可以通過酪氨酸磷酸化系統(tǒng)、轉(zhuǎn)錄因子家族、絲裂原活化蛋白激酶等刺激炎癥的產(chǎn)生。目前ROS 被認(rèn)為可以激活炎性小體的產(chǎn)生。NLRP1 是一種炎性小體，主要包括感受器NLRP1、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白以及效應(yīng)蛋白Caspase-1，3 種蛋白相互作用形成高分子的蛋白復(fù)合體，激活Caspase 加速，迅速進(jìn)行炎癥因子IL-1β、IL-6的切合，并釋放到細(xì)胞外。研究發(fā)現(xiàn)NLRP1 在神經(jīng)細(xì)胞損傷中發(fā)揮著重要的作用[18]。

ACP 是一種復(fù)合的多糖類化合物，課題組前期的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ACP 對于帕金森病等有著良好的治療效果，其作用和炎癥因子的調(diào)控有關(guān)[9-10]。而本研究主要以CNC 為對象，深入研究了ACP 的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS 誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞炎癥模型中，ROS-NOX2-NLRP1 軸是激活的，ROS 水平迅速上調(diào)，可以誘導(dǎo)下游NOX2 和NLRP1 激活，這是神經(jīng)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的主要信號軸。而ACP 干預(yù)后，可以抑制ROS 的產(chǎn)生，探針檢測結(jié)果也顯示，ROS 熒光光度值下調(diào)，而NOX2 和NLRP1 蛋白表達(dá)也下調(diào)。雖然ACP 的干預(yù)抑制了ROS-NOX2-NLRP1軸，可以使細(xì)胞活力上調(diào)，細(xì)胞凋亡水平和炎癥因子表達(dá)水平下調(diào)。但還需要進(jìn)一步研究ACP 的具體作用機(jī)制，所以筆者采用NAC 進(jìn)行處理。NAC 是一種ROS 的特異性抑制劑，可以抑制ROS 的產(chǎn)生。在此基礎(chǔ)上將NAC 和ACP 聯(lián)用，結(jié)果顯示NAC 可以抑制ROS 的產(chǎn)生，從而抑制NOX2 和NLRP1 的激活。但是NAC 和ACP聯(lián)用后，對比單一NAC 未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此，筆者推測ACP 主要抑制了ROS 的產(chǎn)生，從而抑制下游NOX2-NLRP1 軸，改善了神經(jīng)細(xì)胞的炎癥損傷。

綜上所述，ACP 可以通過抑制ROS 的表達(dá)抑制NOX2-NLRP1 激活，從而減輕CNC 的炎癥反應(yīng)。