甄亞欣 李愛民 趙明明 馮康 李子杰

摘要：本研究采用復(fù)方蛹蟲草粉水提取物，研究其對肺癌細(xì)胞A549、乳腺癌細(xì)胞MCF-7和慢性髓原白血病細(xì)胞K562的抑制作用。復(fù)方蛹蟲草粉水提取物對受試細(xì)胞處理24、48h后，采用CCK-8顯色法測定對腫瘤細(xì)胞的抑制率，并通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。結(jié)果表明，復(fù)方蛹蟲草粉水提取物對A549、MCF-7和K562細(xì)胞均有較強(qiáng)的抑制效果，處理48 h時(shí)效果最好，對A549、MCF-7、K562的抑制率分別達(dá)到了48.6%、13.4%和80.5%。細(xì)胞形態(tài)上表現(xiàn)為細(xì)胞膜均遭到破壞，內(nèi)容物泄露。

關(guān)鍵詞：復(fù)方蛹蟲草粉；抗腫瘤；細(xì)胞增殖

引言

蛹蟲草又稱北冬蟲夏草，國家衛(wèi)生健康委已經(jīng)將蛹蟲草加入藥食兩用的中藥名單，具有很高的藥用價(jià)值。蛹蟲草中生物活性物質(zhì)主要有蟲草素、蟲草多糖、蟲草多肽等，具有抗病毒、抗腫瘤、抗炎癥、免疫調(diào)節(jié)等生理活性，已經(jīng)逐漸應(yīng)用到保健、醫(yī)藥等領(lǐng)域。蟲草多糖能夠誘導(dǎo)T-淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)IL-2、IL-6的分泌，同時(shí)還可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用。另有研究證實(shí)，蟲草素能夠抑制肺癌細(xì)胞A549和肺癌細(xì)胞H358的生長，且抑制作用呈劑量依賴性。

目前已有一些蟲草制品、富硒制品被證實(shí)具有抗腫瘤的功效，但其療效尚有待進(jìn)一步提高。為了更好地開發(fā)利用蛹蟲草、松花粉、硒、裸藻等天然資源，本研究選用按照特定比例進(jìn)行復(fù)配的復(fù)方蛹蟲草粉，將其水提取物分別作用于人肺癌細(xì)胞A549、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人慢性髓原白血病細(xì)胞K562，研究其對如上三種腫瘤細(xì)胞生長的影響，并對其細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，為復(fù)方蛹蟲草粉類產(chǎn)品的資源開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

人肺癌細(xì)胞A549、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人慢性髓原白血病細(xì)胞K562均購自南京科佰生物科技有限公司。復(fù)方蛹蟲草粉由國珍健康科技（北京）有限公司提供。DMEM無血清細(xì)胞培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）、100×青鏈霉素混合液均購自Hyclone公司；胰蛋白酶購自Roche公司；DMSO購自Solarbio公司；CCK-8購自Donjindo公司；PBS（磷酸鹽緩沖液）購自BBI life science公司；二氧化碳培養(yǎng)箱購自Panasonic公司；倒置光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡均購自日本尼康公司；臺(tái)式冷凍離心機(jī)購自HITACHI公司；Stat Fax-2100型酶聯(lián)免疫檢測儀購自BIO-RAD公司；T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶購自Fisher公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋購自Thermo公司；YDS-20型液氮生物容器購自成都金鳳液氮容器有限公司；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2D型）購自NUAIRE公司。

1.2復(fù)方蛹蟲草粉水提取物的制備

稱取復(fù)方蛹蟲草粉0.5g，用50mL 60℃熱水浸提1.5h，重復(fù)兩次，合并提取液，0.45μm濾膜過濾，低溫濃縮至無水狀態(tài)，加入1mL去離子水復(fù)溶，真空干燥，稱重，配制提取物濃度為2mg/mL的溶液，再用0.22μm濾膜過濾。取1mL提取物，加入9mL培養(yǎng)液，得終濃度為200μg/mL。

1.3腫瘤細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)測定

選取對數(shù)生長期的A549、MCF-7和K562細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL接種于96孔板中，每孔100μL。待細(xì)胞培養(yǎng)12h后，加入復(fù)方蛹蟲草粉水提取物，每孔100μL，每個(gè)樣品設(shè)置6個(gè)平行，對照組加入等體積含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育24h、48h。培養(yǎng)結(jié)束后，小心吸出原培養(yǎng)液，每孔加入10μL CCK-8溶液，孵育1-4h后使用酶標(biāo)儀測定450 nm波長下的吸光值。按如下公式計(jì)算提取物對細(xì)胞的抑制率：

抑制率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-陰性組OD值）/（陰性組OD值-空白組OD值）×100%

1.4腫瘤細(xì)胞形態(tài)觀察

選取對數(shù)生長期的A549、MCF-7和K562細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL接種于12孔板中，每孔1mL。待細(xì)胞培養(yǎng)12h后，加入復(fù)方蛹蟲草粉水提取物，每孔1mL，對照組加入等體積的培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育48h。培養(yǎng)結(jié)束后，小心吸出原培養(yǎng)液，用PBS輕輕的沖洗細(xì)胞2次后，加入一定體積的臺(tái)盼藍(lán)染色后熒光顯微鏡觀察。對于K562懸浮細(xì)胞，直接吸取一定體積的培養(yǎng)液，1000rpm，離心5分鐘，用PBS沖洗一次，離心后加入一定體積的培養(yǎng)基輕輕吹打混勻，加入等體積的臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行染色，熒光顯微鏡觀察。

1.5數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Spss 24.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2. 結(jié)果

2.1復(fù)方蛹蟲草粉水提取物對人肺癌細(xì)胞A549生長的影響

復(fù)方蛹蟲草粉水提取物處理A549細(xì)胞24、48h后，表現(xiàn)出一定的抑制效果。處理24h后，與對照組相比，復(fù)方蛹蟲草粉水提取物顯著抑制了A549細(xì)胞的增殖（P<0.01），抑制率達(dá)到22.3%。處理48h后，與對照組相比，復(fù)方蛹蟲草粉水提取物顯著抑制了A549細(xì)胞的增殖（P<0.01），抑制率達(dá)到了48.6%。

2.2復(fù)方蛹蟲草粉水提取物對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7生長的影響

復(fù)方蛹蟲草粉水提取物處理MCF-7細(xì)胞24、48h后，表現(xiàn)出了一定的抑制效果。處理24h后，與對照組相比，復(fù)方蛹蟲草粉水提取物對MCF-7細(xì)胞的增殖無顯著影響（P>0.05）。處理48h后，與對照組相比，復(fù)方蛹蟲草粉水提取物顯著抑制了MCF-7細(xì)胞的增殖（P<0.01），抑制率達(dá)到13.4%。

2.3 復(fù)方蛹蟲草粉水提取物對慢性髓原白血病細(xì)胞K562生長的影響

復(fù)方蛹蟲草粉水提取物作用K562細(xì)胞24、48h后，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。處理24h后，復(fù)方蛹蟲草粉水提取物顯著抑制了K562細(xì)胞的增值（P<0.01），抑制率為66.0%。處理48 h后，復(fù)方蛹蟲草粉水提取物顯著抑制了K562細(xì)胞的增值（P<0.01），抑制率為80.5%。隨著處理時(shí)間的延長，抑制率不斷增加。

2.4復(fù)方蛹蟲草粉水提取物處理不同細(xì)胞后的形態(tài)觀察

復(fù)方蛹蟲草粉水提取物對A549細(xì)胞處理48h，染色后采用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。對照組細(xì)胞完好無損，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞間的間隔模糊不清，出現(xiàn)一些紅色的碎片即為細(xì)胞破碎后的殘?bào)w。

復(fù)方蛹蟲草粉水提取物對MCF-7細(xì)胞處理48h，染色后采用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。對照組細(xì)胞大多數(shù)完好無損，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞膜破裂，內(nèi)容物流出。

復(fù)方蛹蟲草粉水提取物對K562細(xì)胞處理48h，染色后采用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。對照組細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整無損，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞膜破裂，且無法辨別出細(xì)胞膜的形態(tài)。

3 討論

從體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，在一定的濃度下，復(fù)方蛹蟲草粉水提取物對A549、MCF-7和K562細(xì)胞均有一定的抑制作用，最佳抑制率分別為48.6%、13.4%和80.5%。當(dāng)作用時(shí)間為48h時(shí)，K562細(xì)胞對于復(fù)方蛹蟲草粉水提取物更加敏感。從熒光顯微鏡結(jié)果來看，復(fù)方蛹蟲草粉水提取物對A549的細(xì)胞膜損害作用較大，不僅能夠損害細(xì)胞膜，還能促進(jìn)細(xì)胞膜裂解。復(fù)方蛹蟲草粉水提取物對MCF-7的細(xì)胞膜具有一定的損害作用，但是毒作用較低，只是造成細(xì)胞膜破裂，內(nèi)容物流出。復(fù)方蛹蟲草粉水提取物對K562的細(xì)胞膜損害作用非常大，細(xì)胞膜幾乎完全裂解，促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞形態(tài)的結(jié)果與抑制率結(jié)果相一致。

通過比較復(fù)方蛹蟲草粉水提取物對A549、MCF-7和K562細(xì)胞的抑制情況，我們發(fā)現(xiàn)，雖然復(fù)方蛹蟲草粉水提取物能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，但對不同的腫瘤細(xì)胞其抑制效果并不相同，這表明復(fù)方蛹蟲草粉水提取物對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用具有特異性，可能對某些特定的腫瘤細(xì)胞具有較好的療效。一方面可能是由于細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)不同所造成的；另一方面可能是三種癌細(xì)胞的細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)控不同、干預(yù)不同階段的細(xì)胞周期所致。

另外，研究證實(shí)硒化蛹蟲草多糖的抗腫瘤活性與硒含量呈正相關(guān)，富硒蛹蟲草誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞凋亡呈濃度依賴性，蛹蟲草多糖對HepG2肝癌細(xì)胞的抑制率與濃度和作用時(shí)長呈正相關(guān)。本研究中只選用了一種濃度處理細(xì)胞，因此，還需要進(jìn)一步研究不同梯度的復(fù)方蛹蟲草粉水提取物對腫瘤細(xì)胞的抑制作用是否存在濃度依賴性，為復(fù)方蛹蟲草類產(chǎn)品的開發(fā)提供充分的理論依據(jù)。

作者簡介：

甄亞欣（1995-），女，漢族，河北石家莊人，碩士，研究方向：食品加工。