張媛媛,孟鎮(zhèn)*,仇凱*,東思源,武竹英,郭新光,鐘其頂

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015)2(全國食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心，北京，100015)

隨著食品供應(yīng)鏈的全球化和復(fù)雜化，市場競爭日益激烈，食品欺詐問題日漸突出，其中肉制品摻假現(xiàn)象層出不窮。一些不法商販在利益驅(qū)使下，為了獲得不法利潤，利用摻假等惡劣手段，將低價(jià)格肉類摻雜到高價(jià)肉中，以假亂真、以次充好擾亂市場秩序，侵犯消費(fèi)者權(quán)益，甚至涉及到宗教信仰問題。這些現(xiàn)象在國內(nèi)外常有發(fā)生[1-6]。肉類罐頭食品因其品種繁多、口味較好、便攜、儲(chǔ)存時(shí)間長等特點(diǎn)而深受廣大消費(fèi)者的喜愛，但由于經(jīng)過了斬拌、調(diào)味、高溫加工等處理[7-9]，普通消費(fèi)者難以通過感官分辨摻假肉，執(zhí)法部門在取證過程中同樣缺乏簡便有效的鑒別手段。目前我國對于生鮮肉類食品及一般熱加工肉類食品的檢測方法及標(biāo)準(zhǔn)趨于完善，但對于罐頭食品這種深度熱加工食品的動(dòng)物源成分鑒別研究很少，因此建立一種快速、準(zhǔn)確鑒定肉類罐頭食品中動(dòng)物源性成分的方法非常有必要[10-11]。

目前，常見的肉制品摻假鑒別方法主要有蛋白質(zhì)鑒別酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、等電聚焦(isoelectric focusing,IEF)、高效液相色譜(HPLC)和核酸檢測法[12-17]。不同物種間核酸極強(qiáng)的特異性，使得核酸檢測方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)。種屬特異性PCR技術(shù)則是應(yīng)用核酸在不同物種間具有極強(qiáng)的特異性這一特點(diǎn)，根據(jù)擴(kuò)增的目的基因設(shè)計(jì)高特異性引物，擴(kuò)增出物種特有的目的片段，此技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于生鮮肉及加工肉制品[18-21]的動(dòng)物源性成分摻假的鑒別。

本研究在國內(nèi)首次以肉類罐頭食品為研究對象，建立了適用于長時(shí)間高溫加工食品中主要的5種動(dòng)物源成分鑒別方法。針對肉類罐頭食品經(jīng)過長時(shí)間高溫加工導(dǎo)致DNA片段化嚴(yán)重的實(shí)際情況，從線粒體DNA入手，根據(jù)不同物種之間線粒體DNA的差異，從數(shù)據(jù)庫中篩選出豬、牛、羊、雞、鴨5種常用肉類的特異性擴(kuò)增引物，建立一種快速、準(zhǔn)確的鑒別肉類罐頭及其他經(jīng)過長時(shí)間高溫處理的食品中動(dòng)物源成分的方法，并對我國市售肉類罐頭產(chǎn)品進(jìn)行了檢測，初步調(diào)查了我國肉類罐頭產(chǎn)品的動(dòng)物源真實(shí)性情況，為其在動(dòng)物源性食品真實(shí)性鑒別的標(biāo)準(zhǔn)化中的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

新鮮豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉，北京市超市和農(nóng)貿(mào)市場;20個(gè)不同種類、不同加工工藝和不同源性成分的罐頭樣品，市售樣品。

1.2 試劑

dNTP、10×PCR緩沖液、TaqDNA聚合酶、100 bp ladder DNA marker等, 北京全式金生物技術(shù)有限公司；異硫氰酸胍法裂解液[5 mol/L GuSCN、0.05 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)、體積分?jǐn)?shù)1.3% Triton-X 100，0.02 mol/L EDTA(pH 8.0)]、V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1、TE緩沖液(0.01 mol/L Tris、0.001 mol/L EDTA，pH 8.0)、異丙醇、無水乙醇，上海生物工程有限公司。

1.3 主要儀器

冷凍離心機(jī),美國Sigma公司；Tgradient PCR擴(kuò)增儀,德國Biometra公司；DYY-8C型高壓電泳儀,北京六一儀器廠；CV-1000型凝膠成像系統(tǒng),法國VIBER LOURMAT公司；pHSJ-4A型實(shí)驗(yàn)pH計(jì),上海科學(xué)儀器有限公司；TMS1500恒溫混勻儀,北京萊普特科學(xué)儀器有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 引物

根據(jù)文獻(xiàn)篩選豬、牛、羊、雞、鴨線粒體DNA種屬特異性引物，交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，各引物終濃度均為10 mol/L，引物序列見表1。

表1 種屬特異性引物Table 1 Species-specific primers

1.4.2 高溫加工肉類模擬樣品的制備

為確保檢測方法對深加工食品檢測的可行性，將鮮豬肉、鮮牛肉、鮮羊肉、鮮雞肉、鮮鴨肉分別在滅菌鍋中121 ℃高溫處理30 min，模擬肉類高溫加工過程。

1.4.3 DNA模板的提取

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)室對于肉類罐頭食品中總DNA提取方法的研究，DNA模板選用異硫氰酸胍法進(jìn)行提取[26]。

1.4.4 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)采用25 μL體系：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，20 pmol/μL引物各1 μL，模板DNA 1 μL，TaqDNA 聚合酶 0.3 μL(1.5 U)，MgSO4(50 mmol/L)1 μL，雙蒸水補(bǔ)足體積。擴(kuò)增條件為：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.5 引物特異性試驗(yàn)

分別以高溫加工的豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉5種高溫加工肉類樣品總DNA為擴(kuò)增模板，使用種屬特異性引物對上述各種DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，同時(shí)設(shè)立以H2O為模板的空白對照，評價(jià)方法的特異性。

1.4.6 靈敏性試驗(yàn)

為了驗(yàn)證該方法的靈敏性，分別將高溫加工的各種動(dòng)物樣品用高溫加工的雞肉進(jìn)行混合稀釋，分別制備出豬、牛、羊、雞、鴨肉成分占5%、2.5%、1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的樣品。將上述樣品充分混勻，提取DNA，進(jìn)行動(dòng)物源性成分靈敏性檢測。

1.4.7 市售罐頭樣品檢測

將20個(gè)市售肉類罐頭樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將檢測合格的PCR純化產(chǎn)物送往上海生工生物科技有限公司進(jìn)行測序，然后通過Chromas軟件對其峰值圖進(jìn)行查看。

1.4.8 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用美國國家生物技術(shù)信息中心(US National Center for Biotechnology Information, NCBI)的BLAST程序，把樣品的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中所收錄的基因片段進(jìn)行比對，從而保證PCR擴(kuò)增的正確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性試驗(yàn)結(jié)果

分別使用5種動(dòng)物源性成分特異性引物對，以制備的豬、牛、羊、雞、鴨5種高溫加工肉類樣品總DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。5種動(dòng)物源性成分豬、牛、羊、雞、鴨出現(xiàn)相符的目標(biāo)條帶，而其他動(dòng)物基因組DNA及空白對照均無條帶出現(xiàn)，也無非特異性條帶，說明此方法具有較好的特異性。

a-豬引物的特異性;b-牛引物的特異性;c-羊引物的特異性;d-雞引物的特異性;e-鴨引物的特異性M-marker；1-豬肉(121 ℃ 30 min)；2-牛肉(121 ℃ 30 min)；3-羊肉(121 ℃ 30 min)；4-雞肉(121 ℃ 30 min)；5-鴨肉(121 ℃ 30 min)；6-空白對照圖1 特異性試驗(yàn)瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Specific electrophoresis agarose gel electrophoresis

2.2 引物靈敏性試驗(yàn)結(jié)果

分別以豬、牛、羊、雞、鴨肉占比為5%、2.5%、1%的樣品提取的總DNA為擴(kuò)增模板，使用種屬特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2所示。不同成分含量為1%的樣品對應(yīng)泳道仍有明顯條帶，對豬、牛、羊、鴨源性成分的檢測靈敏度可達(dá)1%，對雞源性成分的檢測靈敏度為2.5%。說明5種動(dòng)物源性成分檢測靈敏度可達(dá)到1%。在實(shí)際市場中，1%廉價(jià)肉的摻雜對于商販來說毫無利潤，因此檢測限足夠低，完全滿足檢測要求。

a-豬源性成分;b-牛源性成分;c-羊源性成分;d-雞源性成分;e-鴨源性成分M-marker；1-5%肉模擬罐頭；2-2.5%肉模擬罐頭；3-1%肉模擬罐頭；4-空白對照(雙蒸水)圖2 靈敏性試驗(yàn)瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agar gel electrophoresis of sensitivity test

2.3 市售罐頭樣品檢測結(jié)果

以市售的罐頭試樣為檢測對象，使用種屬特異性引物對其DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示。所有樣品均擴(kuò)增出特異性條帶，且條帶清晰整齊，亮度較大，空白對照為陰性。將上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對，比對結(jié)果見表2。通過對20個(gè)市售肉類罐頭樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)除15#和16#豬肝午餐肉罐頭和午餐肉罐頭外，所有樣品檢測結(jié)果均與標(biāo)簽標(biāo)注相一致，6.6% 的樣品標(biāo)簽標(biāo)注成分與檢測結(jié)果不符。15#和16#除檢測出標(biāo)簽標(biāo)注成分外，還檢測出雞源性成分，使用其他方法對其進(jìn)行檢測，均檢測出雞源性成分，考慮可能是由于生產(chǎn)過程中的污染或食品中添加雞精等導(dǎo)致。本方法適用于肉類罐頭中豬、牛、羊、雞、鴨5種動(dòng)物源性成分的檢測，且結(jié)果準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

a-豬源性成分的檢測;b-牛源性成分的檢測;c-羊源性成分的檢測;d-雞源性成分的檢測e-鴨源性成分的檢測M-marker；1-陽性對照；2-空白對照；3-紅燒豬肉罐頭；4-清蒸豬肉罐頭；5-午餐肉罐頭(清淡味)；6-干崩羊肉罐頭；7-咸牛肉罐頭；8-五香肉丁罐頭；9-火腿豬肉罐頭；10-午餐肉；11-午餐肉罐頭；12-回鍋肉罐頭；13-紅燒豬肉罐頭；14-火鍋午餐肉罐頭；15-普云午；16-高金午餐肉；17-豬肝午餐肉罐頭；18-午餐肉罐頭；19-精品紅燒豬肉罐頭；20-粉蒸肉罐頭；21-火腿午餐肉罐頭；22-云腿大片罐頭圖3 市售肉類罐頭樣品瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of canned meat samples

表2 肉類罐頭樣品中動(dòng)物源性成分檢測結(jié)果Table 2 Test results of animal derived components in canned meat samples

續(xù)表2

3 結(jié)論

本研究根據(jù)不同物種之間線粒體DNA的差異，從數(shù)據(jù)庫中篩選出豬、牛、羊、雞、鴨5種常用肉類的特異性擴(kuò)增引物，建立了種屬特異性PCR鑒別肉類罐頭中豬、牛、羊、雞、鴨成分的方法。結(jié)果表明，該方法使用的5種引物種屬特異性良好，對豬、牛、羊、鴨源性成分的檢測靈敏度可達(dá)1%，對雞源性成分的檢測靈敏度為2.5%，完全滿足實(shí)際市場摻入量1%的要求，并成功應(yīng)用于市售肉類罐頭樣品的摻假檢測。該方法操作簡便，檢測成本低，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，適用于高溫高壓加工的肉類罐頭樣品的摻假鑒別，可以作為肉類罐頭市場監(jiān)督和檢驗(yàn)鑒別的可行性辦法，為實(shí)現(xiàn)深加工肉類產(chǎn)品消費(fèi)市場健康發(fā)展，維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益提供了科學(xué)的依據(jù)。