包怡,胡友明,朱林江,陸躍樂,陳小龍

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,浙江 杭州,310014)

食品用酶制劑是指從生物中提取且有催化活性的蛋白質(zhì),具有加速食品生產(chǎn)過程和改善食品品質(zhì)的作用[1-2]。近年來,隨著食品加工行業(yè)的發(fā)展,食品用酶制劑以其安全無毒、反應(yīng)條件溫和、具有專一性等優(yōu)點,常用于對食品加工過程進行工藝優(yōu)化,以改善食品風(fēng)味、色澤、營養(yǎng)品質(zhì),提高產(chǎn)率,延長貨架期等[2-7]。常用的食品酶制劑有淀粉酶、木瓜蛋白酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)、己糖氧化酶(hexose oxidase,HOX)等[4,8-9]。

近幾年,GOD和HOX因具有殺菌、脫氧、去除葡萄糖的作用逐漸得到了廣泛的研究和應(yīng)用,常用于啤酒、牛奶保鮮、蛋白脫糖、面粉改良、紡織品漂白,檢測血糖濃度和抑制病原微生物等[6,10-14]。HOX具有廣泛的底物特異性,在面包烘焙、乳制品酸化、動物飼料添加劑等方面都具有良好的應(yīng)用價值[15-18]。

HOX是從紅藻類物種中提取的一種能夠催化六碳糖氧化為相應(yīng)內(nèi)酯的酶,具有較寬底物譜。除葡萄糖外,HOX還可利用其他單糖和二糖進行除氧和酸化,如D-半乳糖,麥芽糖等,從而作為天然的抗氧化劑、防腐劑、保鮮劑和酸化劑用于食品。本文主要介紹了HOX的分離純化方法和酶學(xué)性質(zhì),并對生產(chǎn)方法和在食品方面的應(yīng)用進行了詳細介紹,以期為HOX的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供參考。

1 HOX的發(fā)現(xiàn)

1969年,IKAWA等[19]在新英格蘭海岸發(fā)現(xiàn)2種紅藻Chondruscrispus和Euthoracristata能夠抑制蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)的生長，進一步研究表明,該抑制行為是由于蛋白核小球藻生長環(huán)境中的葡萄糖被氧化而釋放出的H2O2所致，后經(jīng)過分離鑒定表明,這2種紅藻中存在的HOX催化了這一氧化反應(yīng)。后來,BEAN等[20]從Iridophycusflaccidum中也提取了HOX,兩者性質(zhì)較為相似，均可利用多種底物,包括D-葡萄糖、D-半乳糖、麥芽糖、乳糖和纖維二糖等。這種廣泛的底物特異性使HOX與GOD存在顯著差異,后者只能特異地催化D-葡萄糖的氧化[21]。

目前已被表征的HOX主要來源于紅藻類物種,包括C.crispus、I.flaccidum和E.cristata。另外,OGASAWARA等[22]從Ptilophorasubcostata中也分離到了HOX。

2 HOX的分離純化

目前,常用的HOX分離純化方法包括以下幾個步驟：粗酶液的濃縮、鹽析、脫鹽和層析。分離純化過程中通常會將幾種方法結(jié)合使用以獲得高純度的蛋白。

SULLIVAN等[23]采用鹽析、離子交換層析和凝膠過濾結(jié)合的方法首次從C.crispus中純化得到HOX。將經(jīng)過初步處理的HOX粗酶液用DEAE-纖維素色譜純化,通過含有NaCl的磷酸緩沖液洗脫后以水透析,隨后又采用葡聚糖凝膠G-200進一步純化。其中,采用了胃蛋白酶-胰蛋白酶處理DEAE-纖維素色譜純化后的酶,這一過程對于去除HOX中的藻紅蛋白至關(guān)重要,且酶活力并未因此受到影響,最終比酶活力為4 095 U/mg[23]。

采用上述離子交換層析和凝膠過濾結(jié)合的方法,雖然純化出的HOX純度較高,但操作繁瑣、耗時、收率低。SAVARY等[24]優(yōu)化了分離純化的方法,采用灌注層析法。多孔灌注色譜的介質(zhì)基于苯乙烯-二乙烯基苯共聚物,可實現(xiàn)較高的顆粒內(nèi)對流傳輸流量,在高流動相速度下分離蛋白質(zhì)而不降低分辨率和容量,具有流速快和分辨率高的優(yōu)點[25]。研究中首先采用Poros DEAE色譜,對粗酶液進行純化和濃縮,有效去除了殘留的藻膽蛋白和角叉菜膠。隨后將洗脫的酶液通過Poros HP2疏水相互作用色譜,并用35%的飽和硫酸銨洗脫。通過Poros HQ陰離子交換色譜分離到兩個HOX活性峰,其中第1個峰在200 mmol/L磷酸鈉時洗脫,包含約67%的回收活性。與SULLIVAN等[23]采用的DEAE-纖維素色譜相比,Poros HQ/H柱具有與之相當(dāng)?shù)臉悠费b載量,但流速相較前者可提高10倍。

BEAN等[20]嘗試通過有機溶劑沉淀法和無機鹽沉淀法提取I.flaccidum中的HOX。首先在經(jīng)過預(yù)處理的紅藻提取物中加入氯化鋇,使之與硫酸鹽形成硫酸鋇沉淀而析出。隨后在低溫條件下加入預(yù)冷的甲醇溶液使HOX沉淀析出。有機溶劑沉淀法的優(yōu)點在于沉淀不用脫鹽,操作較為方便[26]。但操作需要在低溫下進行以防止蛋白變性。經(jīng)甲醇沉淀的HOX顯示出較好的穩(wěn)定性,在-10 ℃條件下存放7個月后還能保留90%的活性。隨后,又采用了硫酸銨分級沉淀法進一步純化HOX。經(jīng)過以上兩步純化,最終HOX的比酶活力為1 060 U/mg。

3 HOX的酶學(xué)性質(zhì)

不同來源的HOX性質(zhì)有所不同,如表1所示。I.flaccidum來源的HOX顯示出不包含黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)的特性,最適反應(yīng)溫度為30 ℃,最適pH為5.0,大于7.5時逐漸失活[20]。但C.crispus來源的HOX性質(zhì)還存在爭論,例如是否含有FAD、Cu等[20,22-24,27-33]。

表1 HOX的性質(zhì)Table 1 Properties of hexose oxidase

C.crispus來源的HOX受到二乙基二硫代氨基甲酸鈉強烈抑制,在10-4mol/L的濃度下就能使其失活。另外,氰化物、羥胺、疊氮化物、乙酸鹽和丙酮酸也能抑制其活性[32]。對于來自I.flaccidum的HOX,氯化汞、醋酸鉛、硝酸銀在10-3mol/L的濃度下就能完全抑制其活性。苯甲酸鈉、醋酸鈉也有微弱的抑制作用[20]。

HOX能夠在氧氣存在的條件下將D-葡萄糖和其他幾種己糖氧化成各自的內(nèi)酯,同時消耗O2生成H2O2。隨后內(nèi)酯自發(fā)水解為相應(yīng)的醛酸。以D-葡萄糖為例,HOX利用分子氧為電子受體,催化D-葡萄糖C-1上的羥基,生成δ-D-葡萄糖酸內(nèi)酯,隨后緩慢水解為D-葡萄糖酸(gluconic acid,GA)[34]。

HOX催化葡萄糖和半乳糖氧化的反應(yīng)如下：

D-葡萄糖+O2→δ-D-葡萄糖酸內(nèi)酯+H2O2

D-半乳糖+O2→γ-D-半乳糖酸內(nèi)酯+H2O2

a-H2O2形成過程;b-δ-D-葡萄糖酸內(nèi)酯形成過程圖1 KERSCHENSTEINER推測的HOX的作用機制Fig.1 Proposed mechanism of HOX by KERSCHENSTEINER

4 HOX的異源表達

天然來源的HOX可從海藻物種中分離提取[20,23-24,27,28,30,35]。但由于藻類中HOX的含量很低,直接提取的生產(chǎn)成本偏高。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,基因的克隆與表達成為提高HOX產(chǎn)量和活性的重要手段。C.crispus來源的HOX基因已被克隆,并分別在大腸桿菌(Escherichia.coli)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、畢赤酵母(Pichiapastoris)和多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)中表達。

WOLFF等[32]從C.crispus中成功分離并測定了HOX的編碼基因序列,將其克隆至大腸桿菌宿主細胞進行表達,最終在SDS-PAGE中觀察到分子質(zhì)量為62 kDa的蛋白質(zhì)條帶,與計算預(yù)測的單體HOX分子質(zhì)量一致,但是并未在細胞中檢測到HOX活性。結(jié)果表明大腸桿菌表達出了大量無酶活性的HOX多肽。

畢赤酵母具有翻譯后加工修飾的能力,用于表達真核生物來源的蛋白質(zhì),且分泌蛋白的能力較強。因此HANSEN等[27]嘗試通過畢赤酵母表達系統(tǒng)表達重組HOX，首先將HOX基因克隆至誘導(dǎo)型胞內(nèi)表達載體pPIC3,并轉(zhuǎn)化至畢赤酵母KM71菌株進行整合表達，結(jié)果表明重組酶與天然酶的比活性、酶學(xué)性質(zhì)相似。為了提高HOX的表達水平,WOLFF等[32]通過紫外誘變重組畢赤酵母表達菌株,最終產(chǎn)量達到250 mg/L，同時,為優(yōu)化HOX的分泌,又將來自釀酒酵母的轉(zhuǎn)化酶和α-交配因子信號肽序列分別與HOX基因進行融合,卻未能在胞外檢測到酶活性。然而表達不含有信號肽序列的重組HOX,卻在培養(yǎng)基中檢測到活性,即HOX采用不依賴信號肽的胞外分泌表達。目前,HOX在酵母菌中的分泌機制尚未闡明。

另外,STOUGAARD等[36]嘗試采用自主復(fù)制型質(zhì)粒pYES2在釀酒酵母PAP1500菌株中表達,并成功獲得了有活性的HOX。OLEMPSKA等[34]則報道了在多形漢遜酵母中表達HOX的方法,構(gòu)建了一個基于大腸桿菌pBR322質(zhì)粒的整合型表達載體,并電轉(zhuǎn)化至RB11宿主菌株。隨后對重組菌株進行紫外誘變進一步提高了其活性,最終比酶活力達到100 U/mg。

5 應(yīng)用

HOX具有廣泛的底物特異性,利用糖類物質(zhì)進行除氧及抑制好氧菌生長,可作為抗氧化劑、酸化劑、面粉改良劑,在食品、畜牧養(yǎng)殖等方面具有廣泛的應(yīng)用。

5.1 乳制品的酸化劑

HOX能夠氧化包括葡萄糖、半乳糖和果糖在內(nèi)的多種己糖,最后產(chǎn)生的內(nèi)酯自發(fā)水解為相應(yīng)的醛酸,可作為乳制品的酸化劑。在不含葡萄糖或葡萄糖含量非常低的產(chǎn)品中,HOX比GOD使用更為有效、方便,因為后者只能特異性氧化葡萄糖。例如在乳制品中,大量存在的乳糖和半乳糖則幾乎不會被GOD氧化。因此GOD只能在含有葡萄糖或同時加入了乳糖酶的乳制品中使用[37]。即便如此,GOD也只能利用乳糖分解產(chǎn)物的50%作為其底物。相反,HOX對葡萄糖、半乳糖、乳糖都具有氧化作用。因此HOX是乳制品中有效的酸化劑。

5.2 面粉制品的改良劑

HOX可作為改良劑添加至面粉或面團中,以克服面包彈性差、易塌陷等質(zhì)量問題。常用的面團改良劑分為2類,一類是化學(xué)類氧化劑,如溴酸鉀、抗壞血酸等[38-39],另一類是氧化還原酶,如HOX、GOD、漆酶等[16-40]。一般認為,在面團中添加氧化劑可增強蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)共價鍵的形成,如二硫鍵、谷氨酰賴氨酸交聯(lián)鍵等,從而促進面筋蛋白之間形成較好的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)空間結(jié)構(gòu),提高面團穩(wěn)定性、強度,增大面團體積等[17]。長期以來被廣泛使用的溴酸鉀由于具有毒性且易爆已相繼被許多國家禁用。隨后一些改進措施是在面粉或生面團中添加GOD。這種氧化還原酶通過巰基基團的氧化交聯(lián),酪氨酸殘基的交聯(lián)或氨基酸殘基之間的酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)促進多肽鏈之間共價鍵的形成[16]。但谷物面粉中葡萄糖含量較低,GOD的使用效果并不盡如人意。相反,具有廣泛底物譜的HOX可以催化面團中由大量的β-淀粉酶分解淀粉生成的麥芽糖。因此相較GOD,HOX是作為生面團改進劑的更好選擇。

GüL等[41]研究發(fā)現(xiàn),添加30 mg/kg的HOX能有效地增強面團中的面筋網(wǎng)絡(luò),改善面團流變性能,同時產(chǎn)生的H2O2能增大面包體積。POULSEN等[30]通過對比分別添加了GOD和HOX的面包發(fā)現(xiàn),與同劑量GOD相比,HOX更有效地提高了面團強度和面包體積。并且HOX對葡萄糖的親和性高于GOD對葡萄糖。ALMEIDA等[15]在面團中添加了3種酶——葡萄糖酯酶、半纖維素酶和HOX,烘焙后沒有出現(xiàn)常見的面包塌陷、結(jié)皮脫落等現(xiàn)象,獲得了令人滿意的效果。

5.3 食品的降糖護色劑和保鮮劑

一些含有蛋白質(zhì)和還原糖的食品,特別是烘焙食品,在常溫或加熱的條件下會發(fā)生美拉德反應(yīng),導(dǎo)致食品過度褐變、降低食物的營養(yǎng)價值。這一反應(yīng)造成的影響可以通過添加HOX將還原糖氧化的方式來控制。S?E[35]的研究表明,在奶酪或淀粉中添加HOX,顯著減少了烘焙后的食品的褐變面積,提高了食物品質(zhì),有效地預(yù)防或減輕了美拉德反應(yīng)。

此外,HOX可去除食品中殘留的O2,顯著降低氧化作用,同時能抑制好氧菌生長,實現(xiàn)延長產(chǎn)品保鮮期和保質(zhì)期的目的。所以,HOX可改進乳酪、黃油、果汁等食品的儲存穩(wěn)定性,可用于替代防腐劑。

5.4 作為新型抑菌劑等應(yīng)用

近年來,伴隨著飼料工業(yè)和酶制劑工業(yè)的快速發(fā)展,一種安全、無毒、無副作用的新型飼料添加劑——飼料酶制劑逐漸興起。這種飼料酶制劑的使用能夠強化飼料營養(yǎng)價值和質(zhì)量穩(wěn)定性、改善動物健康狀況和畜產(chǎn)品品質(zhì),對緩解動物飼料資源緊張、保障食品安全及減輕環(huán)境污染等方面具有重要意義[3,42]。

將HOX加入到青貯飼料中,可通過己糖的氧化反應(yīng)消耗飼料中的O2,建立抑制致病好氧微生物生長的厭氧環(huán)境[18]。HOX可作為抑菌劑添加至牙膏等牙齒保健品中,其原理與動物飼料添加劑相似。HOX還可作為分析試劑確定糖含量,或?qū)⑵浼尤雮鞲衅髦衃18]。

6 總結(jié)

HOX是一種來源于藻類物種的氧化還原酶,具有安全、無毒、無副作用的優(yōu)點?？勺鳛橐环N新型的食品和飼料用酶,添加至面粉、乳制品及動物飼料中使用,起到殺菌、抗氧化的效果,對于改善食品風(fēng)味、保證食品安全、促進動物健康等起到重要作用。HOX催化效率高、底物范圍廣,是一種潛力很大的生物催化劑。

目前已被發(fā)現(xiàn)的HOX來源菌種較少,天然物種中含量較低,且不適合大規(guī)模生產(chǎn)。應(yīng)用基因工程技術(shù)已異源表達HOX,并通過菌株誘變在一定程度上提高了活性,但其表達水平仍較低,未見大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)。隨著HOX應(yīng)用特性不斷被開發(fā),應(yīng)進一步挖掘不同來源的HOX,并優(yōu)化異源表達策略,提高食品級宿主的表達水平。此外,解析HOX的晶體結(jié)構(gòu),加強HOX催化特性的研究與改造,擴大酶的應(yīng)用范圍將會是未來的發(fā)展方向。