任麗萍，邵玉平，陳濤，王艷，方興，韓悅，姚文清

遼寧省疾病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽(yáng) 110005

急性弛緩性麻痹（acute flaccid paralysis，AFP）病例定義為所有15歲以下出現(xiàn)AFP癥狀的病例及任何年齡臨床診斷為脊髓灰質(zhì)炎的病例均作為AFP病例。引起兒童AFP的病原除脊髓灰質(zhì)炎病毒外，還包括腸道病毒A組71型（EV-A71）、柯薩奇病毒、?？刹《镜确羌顾杌屹|(zhì)炎腸道病毒（non-polio enterovirus，NPEV）［1］。EV-A71 屬小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）腸道病毒屬（Enterovirus）A 組腸道病毒［2］，該病毒除引起AFP外，還可引起手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）、皰疹性咽峽炎、無(wú)菌性腦膜炎等［2］。近年來(lái)EV-A71多與手足口病的暴發(fā)相關(guān)，是引起手足口重癥病例的病毒類型［3］。至2015年，EV-A71被分為7個(gè)基因型（A～G）和14個(gè)基因亞型［3-5］，其中，中國(guó)內(nèi)地的C4基因亞型分為C4a及C4b 2個(gè)進(jìn)化分支［4-5］。

本文對(duì)2009—2018年遼寧省AFP病例中EVA71分離株進(jìn)行VP1基因特征分析，旨在為遼寧省AFP監(jiān)測(cè)提供病原學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 病例來(lái)自2009—2018年遼寧省AFP監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，14 d內(nèi)的麻痹病例雙份糞便標(biāo)本由縣區(qū)疾控中心采集，7 d內(nèi)送至遼寧省疾控中心脊灰實(shí)驗(yàn)室，-20℃保存。

1.2 細(xì)胞及毒株 橫紋肌肉瘤RD細(xì)胞及轉(zhuǎn)脊灰病毒受體的小鼠肺L20B細(xì)胞均由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病所脊灰實(shí)驗(yàn)室提供；EV-A71原型株（U22521_BrCr／1970／A）及EV-A71 C4亞型的C4a分支（FJ469153_BJ／CHN／2008／C4a）均從GenBank下載。

1.3 主要試劑及儀器 QIAGEN RNeasy Mini Kit試劑盒、One Step RT-PCR Kit試劑盒及QIAquick Gel Extraction Kit膠純化試劑盒均購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；Big Dye Terminator V3.0 Cycle Sequencing kit試劑盒及ABI3100測(cè)序儀均購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.4 病毒分離 根據(jù)WHO《脊髓灰質(zhì)炎實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》［1］及補(bǔ)充資料，用L20B細(xì)胞及RD細(xì)胞對(duì)糞便標(biāo)本進(jìn)行病毒分離，RD細(xì)胞呈陽(yáng)性而L20B細(xì)胞呈陰性的為NPEV。

1.5 RT-PCR擴(kuò)增 用QIAGEN RNeasy Mini Kit試劑盒提取病毒RNA。引物為EV-A71特異性引物2386S 及 011［6］，上游引物 2386S：5′-CTATGAAGTTGTGTAAGGAT-3′；下游引物 011：5′-GCICCIGZYTGITGICCRAA-3′。用 QIAGEN One Step RT-PCR Kit試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件：42℃逆轉(zhuǎn)錄45 min，94 ℃ 3 min；94℃變性30 s，50℃退火25 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。

1.6 序列測(cè)定 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用QIAquick Gel Extraction Kit膠純化試劑盒純化，用Big Dye Terminator V3.0 Cycle Sequencing kit試劑盒進(jìn)行標(biāo)記，ABI3100測(cè)序儀進(jìn)行序列測(cè)定。

1.7 序列分析 使用BioEdit7.0.9.0軟件對(duì)獲得的EV-A71分離株與EV-A71原型株及C4亞型的C4a分支的VP1區(qū)進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列同源性分析。

1.8 基因進(jìn)化樹的構(gòu)建及分析 根據(jù)序列分析獲得的EV-A71分離株VP1編碼區(qū)全長(zhǎng)，從GenBank下載EV-A71各基因型及亞型代表株的核苷酸序列，以柯薩奇病毒A組16型（CVA16）原型株G-10為組外對(duì)照，用Neighbor-Joining方法構(gòu)建所獲分離株與EV-A71各基因型及亞型代表株的進(jìn)化樹，并用MEGA 4.0軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離 2009—2018年遼寧省共檢測(cè)1 044份AFP標(biāo)本，99份標(biāo)本中分離出NPEV，其中從11份標(biāo)本中分離到EV-A71。11株分離株分別為EV7109-1／LN／CHN／2009、EV7112-1／LN／CHN／2012、EV7113-1／LN／CHN／2013、EV7113-2／LN／CHN／2013、EV7113-3／LN／CHN／2013、EV7114-1／LN／CHN／2014、EV7114-2／LN／CHN／2014、EV7114-3／LN／CHN／2014、EV7114-4／LN／CHN／2014、EV7114-5／LN／CHN／2014 及 EV7114-6／LN／CHN／2014。11株EV-A71分離株VP1區(qū)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，均可見1 023 bp的目的條帶，大小與預(yù)期均一致，見圖1。

圖1 11株EV-A71分離株VP1區(qū)核酸擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of VP1 region of 11 EV-A71 isolates

2.2 同源性分析 EV-A71基因組全長(zhǎng)7 408個(gè)核苷酸（BrCr／CA-70，U22521），VP1 編碼區(qū)全長(zhǎng) 891個(gè)核苷酸（2 439～3 329核苷酸）。11株分離株VP1區(qū)與C4亞型的C4a分支核苷酸同源性為96.5%～98.3%，氨基酸同源性為98.6%～99.3%；與EV-A71原型株核苷酸同源性為81.1%～82.2%，氨基酸同源性為93.6% ～94.7%；11株EV-A71 VP1區(qū)之間核苷酸及氨基酸同源性均較高，分別為95.5%～100%和98.6% ～100%。見表1。

表1 11株EV-A71、EV-A71原型株及EV-A71 C4亞型的C4a分支的VP1區(qū)核苷酸和氨基酸同源性分析（%）Tab.1 Homologies of nucleotides and amino acids of VP1 regions of 11 EV-A71 isolates，EV-A71 prototype strains and clade C4a of EV-A71 subtype C4（%）

2.3 基因進(jìn)化樹分析 結(jié)果顯示，遼寧省11株EVA71分離株與C4亞型的C4a分支處于同一支；11株分離株為密切相關(guān)的一簇，來(lái)源于同一傳播鏈。其中遼寧省2009年分離株與山東2009年毒株相似性較高；遼寧省2012年分離株與福建2011年毒株相似性較高；遼寧省2013年的3株分離株分為2小簇，分別與浙江省和泰國(guó)的毒株相似；遼寧省2014年的6株分離株分為3小簇，分別與湖北、安徽、泰國(guó)的毒株相似性較高。見圖2。

圖2 遼寧省AFP病例中EV-A71分離株VP1區(qū)基因進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on VP1 regions of EV-A71 isolates from patients with AFP in Liaoning Province

3 討論

EV-A71為A組腸道病毒的一個(gè)血清型，能引起兒童AFP，也是引起HFMD和皰疹性咽頰炎最常見的病毒［7-8］。根據(jù)腸道病毒劃分原則，VP1基因同源性≥85%，EV-A71被分為A～G 7個(gè)基因型，B及C基因型是全球分布最廣泛的基因型別。A基因型僅有EV-A71的原型株（BrCr株），1969年于美國(guó)發(fā)現(xiàn)；B、C基因型又分為B1～5、C1～5亞型，B及C基因型流行于歐美、亞太地區(qū)［9-11］。亞太地區(qū)流行的基因型2000年以前以B3、B4、C2為主，之后向B5、C3、C4基因型進(jìn)化，近幾年則以B5、C4基因型為主，C2基因型僅在日本流行［5］。印度在對(duì)本土HFMD及AFP病例中NPEV的回顧性研究中劃分了D基因型，并鑒定了G基因型［7］。對(duì)非洲部分國(guó)家EVA71流行株的分析中，鑒定了E及F基因型［12］。中國(guó)將C4基因亞型劃分為C4a和C4b兩個(gè)進(jìn)化分支；1998—2004年，以C4b流行為主，2005—2006年發(fā)生了C4a及C4b的共流行，2007年后C4a成為中國(guó)內(nèi)地EV-A71絕對(duì)優(yōu)勢(shì)流行株［11,13-14］。

遼寧省此11例EV-A71相關(guān)的AFP病例中，臨床診斷為病毒感染2例，感染性肌炎、急性播散性腦脊髓炎、胯關(guān)節(jié)滑膜炎、頸椎脊髓炎癥、肌肉運(yùn)動(dòng)障礙、腦脊髓炎、疑似腦炎、小腦共濟(jì)失調(diào)及非AFP各1例。分布時(shí)間上，2014年病例居多有6例，2013年有3例，2012年有1例，2009年有1例，2015—2017年未分離到EV-A71。本次分離的11株EVA71之間的核苷酸同源性較高，在95.5%以上；進(jìn)化樹分析也表明11個(gè)分離株為密切相關(guān)的一簇，同處于C4a進(jìn)化分支，來(lái)源于同一傳播鏈。

EV-A71侵襲中樞神經(jīng)系統(tǒng)的途徑與脊髓灰質(zhì)炎病毒類似，可能涉及兩種途徑：血腦屏障傳播或通過(guò)外周神經(jīng)逆行軸突運(yùn)輸［15］。關(guān)于EV-A71感染引起的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥機(jī)制研究較少，有研究報(bào)道，VP1蛋白97位亮氨酸變異為精氨酸（L97R）加強(qiáng)了EV-A71的神經(jīng)向性［16］。本文分離的11株EV-A71 VP1蛋白的97位亮氨酸未變異為精氨酸。NOISUMDAENG等［17］研究發(fā)現(xiàn)，VP1 P710位置（VP1-145）由谷氨酸變?yōu)楣劝滨０罚拾彼幔彼釙r(shí)，會(huì)提高EV-A71對(duì)人的神經(jīng)毒力，遼寧省11株分離株P(guān)710位置均為谷氨酸。本文主要對(duì)遼寧省EVA71分離株VP1區(qū)進(jìn)行序列分析，5′非編碼區(qū)序列毒力分析有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，本文分析了遼寧省AFP病例中EVA71分離株VP1區(qū)基因特征，為AFP監(jiān)測(cè)提供了病原學(xué)依據(jù)。