任慧梅，陳慶華 綜述，李敏 審校

國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心，北京 100022

1983年，SMITH等［1］采用昆蟲桿狀病毒感染昆蟲細胞，成功表達重組人β干擾素，標志著昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)的誕生。此后，昆蟲細胞基質作為桿狀病毒載體的宿主，廣泛應用于重組蛋白的表達。在疫苗領域，昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)的生產平臺也越來越受到關注，已有多種采用該系統(tǒng)生產的人用或獸用商品化疫苗上市［2-3］。但近年來隨著科學技術的發(fā)展，多種昆蟲細胞系被發(fā)現(xiàn)存在外源性病毒的持續(xù)感染［4］，因此，昆蟲細胞作為生物制品生產用細胞基質的安全性引起人們的密切關注。

近期在我國進行預防用生物制品臨床試驗申報的藥學研究資料中，發(fā)現(xiàn)有些研發(fā)企業(yè)選用了昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)進行重組抗原的生產，審評對其昆蟲細胞外源因子的控制進行了關注。本文綜合了預防用生物制品藥學審評過程中對外源因子的考慮，對桿狀病毒表達系統(tǒng)中最常用的兩種昆蟲細胞基質SF9和High Five的外源因子控制，及該昆蟲細胞系應用于預防性疫苗時的藥學研發(fā)考慮進行探討。

1 昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)

桿狀病毒（baculovirus）載體可在昆蟲細胞中表達外源蛋白，且不能在哺乳動物細胞中復制，對包括人在內的哺乳動物無致病性，具有很好的生物安全性［5-6］。目前研究和應用最為廣泛的桿狀病毒是苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（AcMNPV）［2］。

分離自鱗翅類昆蟲的SF-9和High Five（Hi-5）是桿狀病毒表達系統(tǒng)中常用的昆蟲細胞基質［7-8］。除了SF-9和Hi-5外，在過去30多年中，從鱗翅類昆蟲分離到多種可用于桿狀病毒表達系統(tǒng)生產人用或獸用生物制品的昆蟲細胞系［5，9］。

昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)能對表達的重組蛋白進行多種翻譯后修飾，如二硫鍵形成、磷酸化、?；⑻腔?、寡聚化和折疊［5］。由于其構建簡單，易于放大，效率高，既可表達單一的抗原蛋白，也可表達復合蛋白，并可在細胞內形成具有良好抗原性的病毒樣顆粒，昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)已成為被廣泛認可的生產重組蛋白的平臺及生產疫苗抗原的有效工具［3，10-11］。

2 昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)在疫苗中的應用

預防性疫苗領域相對保守，由于接種疫苗的人群基本上都是健康人，包括兒童，安全性對疫苗來說最為重要。而且在重組疫苗領域，已有被廣泛接受的哺乳動物細胞培養(yǎng)平臺、大腸埃希菌及酵母培養(yǎng)平臺，其安全性均已獲得臨床證明。雖然昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)具有一系列的優(yōu)點，但其應用于預防性疫苗生產時仍需格外慎重，外源因子的質控必須嚴格執(zhí)行。

迄今為止，采用昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)生產的人用預防性疫苗已有兩個產品上市：第1個是葛蘭素史克公司采用Hi-5細胞研發(fā)的人乳頭瘤病毒樣顆粒（HPV16和18雙價）疫苗Cervarix，該疫苗于2007年在歐洲上市，于2016年在中國批準進口注冊；第2個是由Protein Science公司采用SF9細胞制備的三價重組人流感病毒疫苗Flublok，于2013年上市，另外，F(xiàn)lublok四價疫苗于2016年在美國首次上市。除上述上市產品外，還有多個采用昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)制備的預防性疫苗處于臨床研究或臨床前研究階段，如：埃博拉疫苗、呼吸道合胞病毒疫苗、諾如病毒疫苗、B19微小病毒疫苗等［12］。上述疫苗均采用SF9或Hi-5細胞生產，且選用SF9細胞進行研究的疫苗數(shù)量遠多于Hi-5細胞。

此外，Dendreon公司生產的治療性疫苗Provenge于2010年被FDA批準上市，該疫苗是一種自體前列腺癌治療產品，其抗原為采用SF21細胞生產的由人前列腺酸磷酸酶和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子融合成的重組蛋白［11］。UniQure公司采用SF9細胞生產的基因治療藥物Glybera于2012年在歐洲上市，用于治療罕見病脂蛋白脂酶缺乏癥［11］。除以上4個已上市的人用生物制品外，還有多個采用昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)生產的重組獸用疫苗已上市［12］。

3 昆蟲細胞SF-9和Hi-5中的外源因子

鑒于SF-9和Hi-5是桿狀病毒表達系統(tǒng)中最常用的昆蟲細胞基質，且已上市的兩種預防性疫苗亦采用以上兩種昆蟲細胞作為生產用細胞基質，因此本文關注了SF9和Hi-5細胞中的外源因子。

2014年，幾乎同一時間由3個不同團隊在不同的SF細胞系中獨立發(fā)現(xiàn)了彈狀病毒（SF-rhabdovirus）［4，13-14］。后續(xù)研究表明，SF 毛蟲的持續(xù)感染是最近在SF細胞系中發(fā)現(xiàn)的彈狀病毒感染的最終來源，SF21、SF9L5814和SF9細胞系均表現(xiàn)出彈狀病毒污染［4］。SF彈狀病毒的宿主范圍相對較窄，極可能僅限于少數(shù)鱗翅目昆蟲物種和細胞系［15］。截至目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)SF彈狀病毒在任何細胞株中引起細胞病變的報道，也未發(fā)現(xiàn)感染或易感染SF彈狀病毒的哺乳動物細胞株［4，15-16］。

其中FDA生物制品評價與研究中心（Center for Biologics Evaluation and Research，CBER）通過高通量測序（massive parallel sequencing，MPS）發(fā)現(xiàn) SF9昆蟲細胞中存在內源性彈狀病毒。研究人員在SF9細胞中檢測到彈狀病毒5個主要基因的片段，幾乎包含其所有主要基因組及結構蛋白，而且轉錄水平能檢測到基因轉錄，電鏡觀察能檢測到極少量的彈狀病毒顆粒。即SF9細胞中的彈狀病毒仍有以完整病毒形式存在的可能。該研究建議在生產的不同階段應進行敏感性檢測，也可通過相關的病毒模型，結合病毒去除步驟，檢驗生產過程的病毒安全性［14］。后續(xù)FDA跟蹤報道，說明所有昆蟲細胞來源的已上市疫苗產品，均對整個生產過程進行評估以證實不含外源病毒，其工藝均可保證生物制品的安全性［17］。

基于SF9細胞制備的重組人流感病毒疫苗（美國 Protein Science公司，F(xiàn)lublokTM）已于 2013年經FDA批準上市，Protein Science公司發(fā)表文獻，說明該SF9細胞上清中可檢測到彈狀病毒的基因，但該基因缺失320個核苷酸，缺失序列包括X、L基因的轉錄基序；將SF9細胞上清經密度梯度離心處理得到1.14 g／mL條帶，經電鏡分析認為，該條帶為無定型微粒，即未形成彈狀病毒顆粒；對該條帶進行SDS-PAGE、LC-MS／MS分析，顯示為exosome蛋白、彈狀病毒N蛋白、截短的NPG蛋白；1.14 g／mL條帶可將桿狀病毒基因轉染SF9細胞，該結果與exosome功能一致［18］。與FDA發(fā)表的文獻不同，該研究未在SF9細胞中檢測到病毒顆粒，認為可能與SF9細胞的批號及傳代歷史不同有關，并認為不同來源的細胞檢定結果難以外推至其他細胞［18］。

此外，有研究提示，某些SF9細胞系中彈狀病毒基因組整合至細胞基因組上，以轉錄單元存在［12］?？傮w來說，到目前為止，彈狀病毒在昆蟲細胞中的存在形式有不同的結論，但感染性試驗的結論基本一致，即彈狀病毒可以感染同類昆蟲細胞，但不感染人和其她哺乳動物細胞［15，19-20］。

2007年，日本國家傳染病研究所在Hi-5中發(fā)現(xiàn)粉紋夜蛾細胞系病毒（trichoplusiani cell line virus，TnCLV）［21］。TnCLV與一種特征明顯的昆蟲病毒—獸棚病毒（flock house virus，F(xiàn)HV）相似，又被稱為獸棚病毒變異株（flock house virus variant，F(xiàn)HVvar），其與FHV核苷酸及氨基酸序列同源性為80%左右，且TnCLV衣殼蛋白可被一種多克隆抗FHV抗血清識別［21］。與彈狀病毒不同，TnCLV及FHV一般不被認為是哺乳動物病原體，因此與SF彈狀病毒相比，對TnCLV污染的細胞株和易感性的研究較少。目前已知的只有粉紋夜蛾Tn衍生的昆蟲細胞系受到TnCLV 的污染，SF 細胞中不存在 TnCLV 污染［4，21］。

除外源病毒污染外，SF9和Hi-5細胞的逆轉錄酶檢測均為陽性。此外，有證據表明，SF9細胞可被圣路易斯腦炎病毒、登革熱病毒、日本乙型腦炎病毒、切昆貢亞熱病毒感染，因此建議企業(yè)關注昆蟲細胞中蟲媒病毒的檢定［4］。

4 昆蟲細胞應用于預防性疫苗時的藥學研發(fā)考慮要點

SF-RVN是目前唯一報道的無任何可檢測到彈狀病毒污染的SF細胞株，其形態(tài)、生長特性、對桿狀病毒感染的反應和重組蛋白產量均與SF9差異不大［18，20］，但比 SF9 具有更好的生物安全性，更適用于生物制品的生產［4］。此外，據了解，國內也有企業(yè)購買商業(yè)化SF9細胞后，經單克隆篩選得到彈狀病毒陰性的SF9細胞。鑒于國內外均已獲得不含彈狀病毒的SF9細胞，因此建議有意愿采用SF9昆蟲細胞進行疫苗研發(fā)和生產的企業(yè)，盡量在研發(fā)早期選用無外源病毒污染的細胞株。

彈狀病毒的發(fā)現(xiàn)（2014年）是在含有彈狀病毒的SF9細胞生產的Flublok上市（2013年）之后，并且之后FDA批準了Flublok的四價流感疫苗?；诖耍行┭邪l(fā)企業(yè)認為若后續(xù)的病毒滅活和工藝控制可完全去除彈狀病毒，使用含有彈狀病毒的SF9細胞進行預防性疫苗的生產是可以接受的。雖然目前尚無證據表明彈狀病毒對人具有感染性，但在已知SF9細胞含有彈狀病毒的前提下，作為生產中的外源病毒仍具有潛在的風險，在我國進行臨床試驗申報仍建議研發(fā)企業(yè)深入鑒定、評價所用的SF9細胞，如基因組測序、轉錄組測序、質譜、電鏡檢測等，明確彈狀病毒是以核酸片段形式存在，還是以病毒顆粒形式存在。若彈狀病毒以病毒顆粒形式存在，則不符合《中國藥典》“疫苗總論”要求：種子批無外源因子污染。若確認不是以完整病毒存在，而是以核酸片段存在，則需闡明存在方式，并加強細胞庫和毒種庫以及生產工藝中間品的檢定：如增加彈狀病毒檢測靶點、轉錄或蛋白水平檢測等，確保無污染風險。只有以核酸片段的形式存在，才能進一步評估產品的必要性和獲益，以及該疫苗臨床是否急需綜合評價，考慮開展早期臨床試驗。但若要進入Ⅲ期臨床試驗，毒種制備用SF9細胞應使用克隆篩選后無彈狀病毒污染的細胞株，即Ⅲ期臨床前需完成無彈狀病毒污染細胞株的篩選。

在審評過程中曾發(fā)現(xiàn)采用Hi-5細胞進行生產的某產品，在其研發(fā)早期，種子庫中檢測到FHVvar病毒RNA，并通過電鏡在細胞質中觀察到一種病毒顆粒樣結構。審評采用與上述SF彈狀病毒一致的原則，要求申請人進行廣泛研究（參照上述SF彈狀病毒），明確該外源病毒的存在形式，并證實該外源因子不具備在哺乳動物細胞中擴增和感染的能力，同樣，若要進入Ⅲ期臨床試驗，應篩選不含F(xiàn)HVvar的細胞株。后期申請人采用終點稀釋法對該細胞進行克隆和篩選，得到不含F(xiàn)HVvar病毒RNA的Hi-5細胞克隆，并采用該細胞株重新建立了生產用細胞庫，F(xiàn)HVvar RNA檢測陰性。出于安全性考慮，藥審中心仍要求申請人在研發(fā)相關階段對產品進行FHVvar病毒檢測，且結果應為陰性。

據文獻報道，國外幾個研究小組已獨立獲得6個無TnCLV污染的Tn細胞系，但這些細胞系的克隆狀態(tài)、特征程度均不同［4］。據了解，國內也有生產企業(yè)通過多輪細胞亞克隆及篩選，成功獲得了不含TnCLV的Hi-5細胞株。因此，建議疫苗研發(fā)和生產企業(yè)盡量在研發(fā)早期選用無TnCLV污染的Hi-5細胞。

目前已上市的疫苗除乙肝疫苗使用的CHO細胞外，生產用細胞基質均未見逆轉錄酶活性陽性。《中國藥典》生物制品生產檢定用動物細胞基質制備及檢定規(guī)程中，對生產用細胞基質逆轉錄酶及逆轉錄病毒的要求為：若細胞逆轉錄酶活性檢測為陽性，則需進行透射電鏡檢查或PCR檢測及感染性試驗，以確證是否存在感染性逆轉錄病毒顆粒?？僧a生感染性逆轉錄病毒顆粒，且下游工藝不能證明病毒被清除的細胞基質不得用于生產。因此，疫苗研發(fā)企業(yè)應按照《中國藥典》的要求，進一步確認SF9和Hi-5細胞是否含有逆轉錄病毒，并建議在原液中進一步闡明是否有逆轉錄病毒序列，開展昆蟲細胞中逆轉錄酶活性相關的轉座子風險研究。

目前WHO細胞基質技術指南和FDA細胞基質技術指南均無對昆蟲細胞細胞基質殘留的定量限度要求。建議申請人采用目前國內外具有一定認可程度的昆蟲表達體系試劑盒或斑點雜交法進行殘留DNA、殘留宿主細胞蛋白的檢測。原則上，在方法學可比的基礎上，昆蟲細胞基質殘留應不高于已上市同類產品的要求。此外，對于DNA殘留應結合成瘤性檢測綜合評估，雖然體內法是成瘤性評估的“金標準”，但昆蟲細胞的生長溫度為27℃，因此成瘤性試驗采用的動物模型（動物體溫為37℃）不適用，可考慮進行軟瓊脂克隆作為參考，并進一步對核酸殘留進行質控，以進行更好的風險評估。由于昆蟲細胞基質可參考上市產品較少，對于宿主細胞蛋白及DNA殘留風險的相關研究較少，企業(yè)應在臨床前研究中充分評估安全性風險后，再考慮開展人體臨床研究。

昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)依賴于桿狀病毒的增殖生產目的蛋白，因此，桿狀病毒的去除為生產過程中的關鍵工藝參數(shù)。疫苗研發(fā)和生產過程中，需參照《中國藥典-人用疫苗總論》、《重組制品生產用哺乳動物細胞質量控制技術評價一般原則》以及ICH Q5A《來源于人或動物細胞系生物技術產品的病毒安全性評價》指南的要求，制定全面系統(tǒng)的病毒去除／滅活措施以及嚴格的標準，以控制產品潛在的病毒污染。此外，病毒滅活后應考察滅活劑對重組蛋白完整性、免疫原性的影響，并對抗原蛋白的回收率等進行研究。

由于昆蟲細胞的生存環(huán)境使其經常受到外源病毒的污染，考慮到目前的技術發(fā)展水平，昆蟲細胞系只有在經過嚴格的檢測，以及生產過程中的嚴格質控，才能被認為無外源病毒。因此，昆蟲細胞被用于生物制品生產或研究之前，應廣泛檢測其是否存在外源病毒污染，并在生產過程中實施嚴格的措施以避免污染。若已選擇的昆蟲細胞含有外源病毒，應對該外源病毒進行廣泛研究，盡量通過各種技術手段去除外源病毒污染。

綜上所述，由于對昆蟲細胞的前期研究、背景資料和致瘤性風險等積累的認識十分有限，其開發(fā)應用將引入新的安全性隱患，需慎重權衡利弊，在開展充分研究的基礎上嚴格控制潛在的風險性。