王振東，盧曉琳，姚秀英，劉鑫麗，趙琳琳，王理，牛勃，4

1.山西醫(yī)科大學(xué)生化教研室，山西 太原 030001；2.首都兒科研究所分子免疫室，北京 100020；3.陸軍總醫(yī)院263臨床部婦產(chǎn)科，北京 100024；4.首都兒科研究所轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究室，北京 100020

無(wú)胚胎妊娠也稱為枯萎卵妊娠，是指胚胎從未發(fā)育或再吸收，最終導(dǎo)致流產(chǎn)。無(wú)胚胎妊娠通常發(fā)生在懷孕婦女流產(chǎn)前12周，是妊娠早期較常見的流產(chǎn)，占自然妊娠的50%［1-3］。有研究表明，無(wú)胚胎妊娠可能與感染、免疫、染色體異常、內(nèi)分泌等多種因素相關(guān)［4］。

胎兒一半的遺傳物質(zhì)源于父本，因此可能會(huì)引起母體免疫系統(tǒng)的排斥反應(yīng)，有研究證實(shí)，胚胎著床是母體胎兒復(fù)雜的免疫耐受過程，免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)在該過程中發(fā)揮重要作用［5］。婦女在育齡期發(fā)生自然流產(chǎn)大多數(shù)存在免疫異常現(xiàn)象，其中約80%的復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）與自身免疫因素相關(guān)［6-7］。

人類白細(xì)胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）也稱為主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC），負(fù)責(zé)免疫系統(tǒng)中的抗原表達(dá)，分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類［8］。HLAⅠ類分子是NK細(xì)胞受體的配體，具有阻斷NK細(xì)胞活性的能力，起到保護(hù)胎兒的作用。胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)3種HLAⅠ類分子（HLA-C、HLA-G、HLA-E），有研究證實(shí)，HLAⅠ類基因的缺失或突變可能導(dǎo)致流產(chǎn)［8］。AGRAWAL等［9］研究發(fā)現(xiàn)，HLA-G基因多態(tài)性增加了RSA的風(fēng)險(xiǎn)。HLAⅡ類分子是一種固定在細(xì)胞膜上的異質(zhì)二聚體，由1條α鏈（DPA1）和1條β鏈（DPB1）構(gòu)成，結(jié)合細(xì)胞外源性抗原肽后，可被CD4+T細(xì)胞識(shí)別，胎盤滋養(yǎng)層HLAⅡ類抗原的抑制是妊娠成功的一個(gè)重要機(jī)制。研究已經(jīng)證實(shí)，HLAⅡ類分子在胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中的過表達(dá)可能誘發(fā)流產(chǎn)，但其具體機(jī)制尚未明確［10］。HLAⅡ類分子包括HLA-DP、DQ、DR、DN、DO和DM 共6個(gè)亞型，有研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)RSA患者體內(nèi)存在大量HLA-DQ或HLA-DR的表達(dá)［11-12］。目前對(duì)HLA-DP與流產(chǎn)相關(guān)性的研究較少，因此本研究采用高通量DNA分析技術(shù)，檢測(cè)無(wú)胚胎妊娠婦女外周血中HLA-DPA1基因的14個(gè)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），并分析HLA-DPA1的遺傳多態(tài)性與無(wú)胚胎妊娠的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 樣本 選擇2016年5月～2018年9月間由中國(guó)人民解放軍總院263醫(yī)院經(jīng)產(chǎn)前B超檢查確診為無(wú)胚胎妊娠的110名患者作為研究對(duì)象，同時(shí)招募150名因非醫(yī)療原因流產(chǎn)患者作為對(duì)照。所有參與者均為漢族，無(wú)家族病史、特殊疾病及其他藥物作用和輻射效應(yīng)，且均已提交知情同意書。本研究方案經(jīng)當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)和首都兒科研究所IRB審核通過。經(jīng)患者靜脈采集外周血，于-30℃保存。同時(shí)記錄研究對(duì)象的年齡及孕周。

1.2 主要試劑及儀器 血液和細(xì)胞培養(yǎng)DNA提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；NANODROP 1000分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；帶有基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption／ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）的質(zhì)量陣列高通量DNA分析儀購(gòu)自美國(guó)Angena公司。

1.3 DNA的提取 采用血液和細(xì)胞培養(yǎng)DNA提取試劑盒從血液樣本中提取基因組DNA，通過NANODROP 1000分光光度計(jì)測(cè)定260和280 nm波長(zhǎng)下的吸光度值，檢測(cè)DNA的濃度和純度。

1.4 SNP的選擇及基因分型 從1000 Genomes數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出啟動(dòng)子和HLA-DPA1基因全長(zhǎng)區(qū)域的標(biāo)記SNP，分別從NCBI SNP數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBI pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得外顯子SNP和熱點(diǎn)SNP，利用Haploview 4.2軟件分析上述SNP的連鎖相關(guān)性。

在 AgenaCx網(wǎng)站（https：／／agenacx.com／）設(shè)計(jì)漢族人群中等位基因頻率>0.10且與其他SNP有強(qiáng)連鎖不平衡的SNP（n=19）引物，設(shè)定r2<0.8，引物序列見表1，引物由生工生物工程（北京）股份有限公司合成。以提取的樣本基因組為模板，PCR擴(kuò)增SNP區(qū)域，PCR產(chǎn)物通過質(zhì)量陣列高通量DNA分析儀進(jìn)行分析，同時(shí)以純水作為陰性對(duì)照，并對(duì)60%的樣本進(jìn)行再分型，對(duì)基因分型頻率≥90%的HLA-DPA1基因的SNP進(jìn)行基因型／等位基因頻率的分析。其他群體中SNP基因型／等位基因的頻率從1000 Genomes數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得，并驗(yàn)證與對(duì)照組樣本的相關(guān)性。

表1 SNP擴(kuò)增的引物序列Tab 1.Primer sequences for SNP regions

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)，哈溫平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）的比較采用卡方檢驗(yàn)；以O(shè)R值的 95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行多元線性回歸，判斷與HLA-DPA1多態(tài)性相關(guān)的無(wú)胚胎妊娠風(fēng)險(xiǎn)；病例組和對(duì)照組孕周的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在5%顯著性水平下，基于110例病例和150例對(duì)照的最小樣本量，應(yīng)用Quanto軟件（http：／／biostats.usc.edu／Quanto.html）計(jì)算，當(dāng) OR 為 0.5時(shí)，檢測(cè)能力為99.99%。

2 結(jié)果

2.1 受試者年齡及孕周的比較 對(duì)照組及病例組受試者的平均年齡分別為（28.35±6.13）和（28.86±7.15）歲，平均孕齡分別為（6.84± 1.22）和（6.93±1.34）周，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為0.63和0.55，P分別為0.532和0.585）。

2.2 DNA的濃度及純度 對(duì)照組及病例組受試者血液樣本中提取的DNA濃度均在40 ng／μL以上，可用于PCR擴(kuò)增，其在260與280 nm處的光吸收比值除少量在1.7～1.8或2.0～2.1之間，其他均在1.8～2.0之間；其在260與230 nm處的光吸收比值除少量在1.85～2.0之間，其他均在2.0以上。見表2。表明無(wú)過量蛋白質(zhì)、RNA或酚類物質(zhì)污染，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 HLA-DPA1基因頻率與樣本基本參數(shù)分析Haploview 4.2軟件分析結(jié)果表明，HLA-DPA1基因中共有14個(gè)SNP位點(diǎn)基因分型頻率在90%以上，除rs2073522在P<0.05時(shí)偏離HWE外，共對(duì)13個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，見表2。組間比較頻率時(shí)發(fā)現(xiàn)，除rs1431403外，所有SNP的基因型和等位基因分布在對(duì)照組和無(wú)胚胎妊娠組間非常相近（數(shù)據(jù)未顯示），rs1431403基因分型多態(tài)性檢出率為94.23%，其中對(duì)照組為143例，病例組為102例。

表2 SNP的詳細(xì)參數(shù)Tab.2 Detail parameters of SNP

2.4 rs1431403位點(diǎn)的基因型及等位基因多樣性分析 基因型／等位基因頻率分析結(jié)果表明，對(duì)照組與病例組rs1431403位點(diǎn)的等位基因頻率間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但純合子基因型（CC 和 TT）明顯高于對(duì)照組（P<0.01），病例組純合子突變組合（CC+TT）部分也顯著高于對(duì)照組（P<0.001），見表3。表明該人群中rs1431403多態(tài)性可能與無(wú)胚胎妊娠風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)。

表3 對(duì)照組和病例組rs1431403位點(diǎn)基因型的比較Tab.3 Comparison of rs1431403 genotypes in two groups

2.5 rs1431403位點(diǎn)基因型和等位基因頻率在不同人群中的多態(tài)性分析 對(duì)照組rs1431403位點(diǎn)基因型／等位基因頻率與北京其他正常漢族人群間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），除日本和非洲人群的等位基因頻率與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P>0.05），包括西雙版納中國(guó)傣族人口在內(nèi)的其他亞洲國(guó)家或其他洲的外國(guó)人群的rs1431403位點(diǎn)基因型／等位基因頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表4。表明對(duì)照組rs1431403位點(diǎn)基因型／等位基因頻率可代表漢族人群，且rs1431403位點(diǎn)在不同民族或種族人群中具有不同的基因型／等位基因頻率分布。

表4 不同民族或種族正常人群rs1431403位點(diǎn)基因型和等位基因頻率的多態(tài)性Tab.4 Polymorphisms of frequencies of rs1431403 genotype／allele in healthy populations of various nationalities or races

3 討論

本實(shí)驗(yàn)基因分型結(jié)果表明，病例組CC與TT分型為40.2%和30.4%，分別比對(duì)照組高出19.2%和10.8%，CT分型為29.4%，比對(duì)照組低30.0%，病例組純合子突變組合（CC+TT）部分為70.6%，比對(duì)照組高30.0%；分型差異結(jié)果表明，HLA-DPA1基因中SNP位點(diǎn)rs1431403與無(wú)胚胎妊娠有顯著相關(guān)性，純合子基因型（CC和TT）明顯增加了無(wú)胚胎妊娠的風(fēng)險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)還將對(duì)照組中rs1431403位點(diǎn)基因型／等位基因頻率與北京其他正常漢族人群（1000 Genomes數(shù)據(jù)庫(kù)）進(jìn)行了比較，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了對(duì)照組rs14-31403位點(diǎn)基因型／等位基因頻率可代表漢族人群，其分布與包括西雙版納中國(guó)傣族人口在內(nèi)的其他亞洲國(guó)家或其他洲的外國(guó)人群相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明rs1431403位點(diǎn)與無(wú)胚胎妊娠的關(guān)系在不同民族中可能存在差異。

有研究發(fā)現(xiàn)，rs1431403位點(diǎn)的基因變異同時(shí)存在于HLA-DPA1和HLA-DPB1的內(nèi)含子區(qū)域，可能與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、1型糖尿病等自身免疫性疾病和HIV等免疫缺陷相關(guān)［13-14］。HLAⅡ類分子與外源性抗原結(jié)合為復(fù)合物，與CD4+T淋巴細(xì)胞（Th）表面受體（T cell receptor，TCR）結(jié)合，CD4+Th 的活化引起Th細(xì)胞增殖，表達(dá)相應(yīng)的淋巴因子，進(jìn)而啟動(dòng)體液免疫［15］，表明HLAⅡ類分子增加可刺激CD4細(xì)胞上升。FERRERIA等［14］發(fā)現(xiàn)，rs1431403的C等位基因在Ⅰ型糖尿病和HIV中均可引起CD4／CD8的下調(diào)。YANG等［13］發(fā)現(xiàn)，rs1431403位點(diǎn)的變異顯著增加類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，HLAⅡ類分子表達(dá)上調(diào)是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的檢測(cè)指標(biāo)之一；也有研究表明，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎風(fēng)險(xiǎn)與HLA的基因多態(tài)性密切相關(guān)［16］。綜上所述，rs1431403位點(diǎn)的基因型與HLADPA1的表達(dá)可能存在關(guān)聯(lián)，rs1431403位點(diǎn)基因型可能是影響無(wú)胚胎妊娠發(fā)生的途徑，但具體病理機(jī)制有待進(jìn)一步研究。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)（Alibaba 2.1，gene-regulation.com／pub／programs／alibaba2／index.html）發(fā)現(xiàn)，rs1431403下游4 bp處為干擾素共識(shí)序列結(jié)合蛋白（ICSBP）結(jié)合位點(diǎn)，ICSBP能夠促進(jìn)HLA-DP表達(dá)［17］，但I(xiàn)CSBP與該位點(diǎn)的結(jié)合是否受rs1431403位點(diǎn)突變調(diào)節(jié)尚需證實(shí)。

綜上所述，HLA-DPA1中rs1431403位點(diǎn)的純合分型（CC或TT）是中國(guó)人群胚胎停育的潛在危險(xiǎn)因素，該結(jié)果可能為自然流產(chǎn)的產(chǎn)前診斷提供線索，對(duì)優(yōu)生優(yōu)育具有積極意義。